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Importancia del gen mecA y sección MREJ en la detección de SARM Dr. Pablo Baltar y Prof. Benito J. Regueiro, Departamento de Microbiología, Hospital Clínico Universitario, Universidad de Santiago de Compostela BD-MAXTM es una plataforma abierta que permite realizar diversos estudios relacionados con SARM. En este caso hemos realizado por un lado un análisis de discrepantes en relación con otros test del mercado y, por otro, hemos llevado a cabo un test de viabilidad de distintos tipos de muestras. Análisis de discrepantes Prof. Benito Regueiro La región del casete cromosómico del gen mec es muy complicada. Es un elemento génico móvil que se transfiere horizontalmente. SCCmec Basic structures of representativ e SCCmec elements. The structures of SCCmec elements of representative strains are illustrated based on the follow ing nuc leotide sequences deposited in databases: NCTC10442 (A B033763), N315 (D86934), 85/2082(AB037671), CA05 ( AB063172), ZH47 (AM292304), WIS ( AB121219), TSGH17 (AB512767), PM1 ( AB462393), HDE288 ( AF411935), JCSC6082 ( AB373032), and C10684 ( FJ390057). Red arrowheads indic ate the ISS of SCC that comprise DR sequences. Ant im icrob Agents Chem other. De c 2 009; 5 3(12): 4 961–4967 . Pub lished o nline Aug 31 , 2009. doi: 10.1 128/AAC.00579-09 PM CID: PMC2 786320 Classification of Staphylococcal Casse tte Chromos ome me c (SCCmec ) : Guidelines for Reporting Novel SC Cmec Elements I nt er nat iona l W o rk ing Gro up on t h e Classif ica tion o f Sta ph yloc oc ca l Ca ss ett e C hrom os ome E lemen ts (I W G- SC C) La diferenciación génica de tipos y subtipos de S. aureus resistentes a la meticilina es muy variada. CRITERIO ELECCIÓN 101 cepas de St aph. aureus ( MRSA) Incluyendo la cepa ATCC 43300 Microscan Disco Cefoxitina BDMaxTM MRSA Assay VS LightCycler® MRSA Advanced Test Pos / Pos Pos / Neg Neg / Neg Clínica SECUENCIACION/ BLAST Vitek Coagulasa GenoType MRSA BDMax StaphSR FluoroType MRSA Diversilab MALDI-TOF En el análisis de discrepantes lo que se pretendió es comparar BDMAXTM MRSA assay y LightCycler® MRSA Advanced Test de Roche. A continuación se realizaron diversas pruebas para confirmar los resultados como se indica en la figura anterior. La gran mayoría de cepas analizadas presentaron los mismos resultados con ambas técnicas pero en 7 hubo discrepancias. Cuando se realizaron los análisis de distancias de las cepas discrepantes se observó que se alineaban entre ellas presentando unos determinados tipos de gen mec. Una combinación de técnicas genotípicas y fenotípicas puede ser útil para el análisis de cepas discrepantes. Cuando el número de cepas discrepantes sea lo suficientemente grande se deberían diseñar nuevos primers para que las puedan incluir y de esa manera nos den más información. El test BD-MAXTM MRSA assay detectó mayor número de cepas positivas. Las técnicas moleculares en general: - Presentan mayor automatización, minimizando errores por manipulación y contaminaciones - Hay una obtención rápida de gran número de resultados - No son infalibles. En los casos conflictivos es fundamental tener alternativas - Están condicionadas a la manipulación previa y a las contaminaciones - No descartan las pruebas microbiológicas clásicas aunque ofrecen grandes beneficios en el quehacer diario de los laboratorios de microbiología Test de viabilidad Las muestras biológicas que se utilizan para diagnosticar los microorganismos causantes de la infección tienen un contenido de ADN genómico alto debido a la cantidad de leucocitos. Existen diferentes métodos de detección de ADN proveniente de microorganismos viables: - química y foto-activación (EMA, PMA, venenos, topoisomerasas) - nanopartículas (búsqueda de carga positiva y efecto paradójico) - citostáticos (con tamaños críticos) En los test de viabilidad, si las bacterias están vivas y la pared intacta, el citostático no penetra y por tanto no inhibe la PCR, pero en las bacterias muertas penetra e inhibe la PCR. Previamente a la extracción de ADN se utiliza el citostático durante 30 minutos. La plataforma BD-MAXTM se ha usado para determinar estos test de viabilidad. Cuando se utilizan muestras biológicas complejas como sangre, heces y otras, el sistema no funciona, pero sin embargo con el caldo sí. La solución puede ser utilizar partículas super-para-magnéticas con unión específica para bacterias y hongos, de tal manera que las partículas se enlacen a las bacterias. Hay distintas partículas en el mercado (NANO MR, ApoHCAPTOBAC). Utilizando estas partículas magnéticas de absorción específica enlazan o recuperan grampositivos, gramnegativos y hongos con un límite más bajo que los sistemas actuales. Además, algunas partículas fallan para algunas bacterias (A. baumanii, E. coli, E. faecium). Esta plataforma BD-MAXTM, por tanto, puede utilizarse como un sistema abierto para realizar diversos ensayos que son útiles para la detección de microorganismos en muestras biológicas. ¿Cómo se puede traducir la clínica al laboratorio o viceversa? Existen una serie de preguntas que nos debemos hacer en la práctica clínica e intentar llegar a un beneficio clínico: - ¿cómo encontrar e interpretar las pruebas clínicas? - ¿cómo seleccionar e interpretar las pruebas diagnósticas? - ¿cómo anticipar la evolución clínica del paciente? - ¿cómo seleccionar un tratamiento adecuado y suficiente? - ¿cómo prevenir y reducir el riesgo de la enfermedad? - ¿cómo aprender uno mismo y comunicar las actuaciones a seguir? Un laboratorio debe funcionar las 24 horas del día para dar respuesta a los problemas que afectan a nuestros clínicos. En el flujo de trabajo de un laboratorio y analizando las diferentes fases, la fase post-analítica es fundamental. En ella, se debería emitir un informe preliminar para dar datos parciales que puedan dar un valor añadido antes del informe validado. En un laboratorio de 24 horas esto sería fundamental; además el microbiólogo puede tener acceso a la historia clínica del paciente, para poder interpretar los resultados de una manera más coherente. FLUJO DE TRABAJO EN EL LABORATORIO Registro Filtro de llegada al SISTEMA INDUSTRIAL Fase Pre-analítica PROCESAMIENTO Filtro de llegada al SISTEMA URGENTE DERIVA Depositan muestras negativas Sistemas en cadena Ordenan y derivan trabajo adicional Fase Analítica Emiten datos positivos susceptibles de validación Sistemas de respuesta urgente Fase Post-analítica Búsqueda BENEFICIO CLÍNICO INFORME PRELIMINAR (RUO, datos parciales, et.) INFORME VALIDADO (FDA, CE, datos confirmados, etc.)