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BOLETÍN DEL CENTRO DE INVESTIGACIONES BIOLÓGICAS
VOLUMEN 42, NO. 4, 2008, PP. 491–505
UNIVERSIDAD DEL ZULIA, MARACAIBO, VENEZUELA
REGENERACIÓN IN VITRO DE BILLBERGIA ROSEA HORTUS
EX BEER A PARTIR DE ÁPICES CAULINARES
A DRIANA P ARDO 1, CLARET MICHELANGELI 2,
N ORCA MOGOLLÓN 1 Y G EINE A LVARADO 1
1
Unidad de Biotecnología Vegetal (UCLA), Decanato de
Agronomía,Universidad Centroccidental “Lisandro Alvarado”,
Barquisimeto, Estado Lara, Venezuela
[email protected], [email protected],
[email protected]
2
Centro de Investigaciones en Biotecnología Agrícola (CIBA), Facultad
de Agronomía, Universidad Central de Venezuela (UCV),
Maracay, Estado Aragua, Venezuela
[email protected]
Resumen. La especie Billbergia rosea es considerada la más exuberante
de su género por presentar inflorescencias colgantes de llamativos
colores. Sin embargo, a pesar de su alta demanda, en el mercado de
ornamentales no se han desarrollado protocolos eficientes para su
propagación. Por tal motivo se estableció un protocolo para la
regeneración in vitro de esta especie a partir de ápices caulinares. Se
siguieron las respectivas etapas de iniciación, multiplicación,
enraizamiento y aclimatización, y se aplicó un diseño completamente al
azar. La iniciación de brotes a partir de ápices se favoreció en el medio de
cultivo Murashige y Skoog (MS) semisólido y los reguladores de
crecimiento BAP (1 mgL-1) y ANA (0,01 mgL -1). La etapa de
multiplicación de brotes requirió una mayor proporción de BAP (1 mgL-1)
que de ANA (0,5 mgL-1) en el medio; siendo en este caso el empleo del
medio MS líquido el que permitió a los brotes los mayores promedios
para altura de brotes (cm) y número de brotes por explante. El medio en
estado líquido y la incorporación de ANA (0,1; 0,5 y 1 mgL -1) fueron los
factores más importantes para la formación de raíces. La aclimatización
de las vitroplantas ocurrió de manera satisfactoria con el uso de los
sustratos Promix ® y aserrín de coco y las combinaciones de arena, aserrín
de coco y Promix ® (1:1:1), y arena más aserrín de coco (1:1). El empleo
de esta técnica puede ser utilizada para la producción de plantas de B.
rosea a escala comercial. Recibido: 07 abril 2008, aceptado: 30
septiembre 2008.
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492
Pardo et al.
[Bol. Centro Invest. Biol.
Palabras clave. Billbergia rosea, regeneración in vitro, Bromeliaceae,
ápices caulinares, reguladores de crecimiento.
IN VITRO REGENERATION OF BILLBERGIA ROSEA
HORTUS EX BEER VIA SHOOT TIPS
Abstract. Billbergia rosea is considered the most exuberant species in the
genus for having exotic, brightly colored hanging inflorescences.
However, despite its high demand in the ornamental plant market,
efficient propagation methods are still lacking. Therefore, in this study,
we established an in vitro regeneration protocol for this species using
shoot tips. All experiments followed the initiation, multiplication, rooting
and acclimatization steps, as well as a completely randomized design.
Initialization of shoot tips was favored by semisolid Murashige and Skoog
(MS) medium and the BAP (1 mgL-1) and ANA (0.01 mgL -1) growth
regulators. Shoot multiplication required a higher BAP dose (1 mgL-1)
than ANA (0.5 mgL -1) in the medium, and in this case, the MS liquid
medium allowed shoots to reach higher mean shoot height (cm) and
number of shoots per explant. Use of liquid state medium and ANA (0.1,
0.5 and 1 mgL-1) were the most important factors for root production.
Vitroplant acclimatization was satisfactory by using Promix ® and coconut
powder as substrate and combinations of sand, coconut powder and
Promix ® (1:1:1), or sand plus coconut powder (1:1). This technique is
useful for commercial scale production of B. rosea plants. Received 07
April 2008, accepted 30 September 2008.
Key words. Billbergia rosea, in vitro regeneration, Bromeliaceae, shoot
tips, growth regulators.
INTRODUCCIÓN
La familia Bromeliaceae es autóctona del continente americano y está
conformada en su mayoría por especies de importancia ornamental de gran
valor en el comercio internacional para fines decorativos (Koh y Davies 1997).
Dentro de éstas, destaca la especie Billbergia rosea Hortus ex Beer conocida
popularmente como flor de junio o parásita de San Juan (Esteva y Steyermark
1987). Esta especie se caracteriza por ser diploide (2n = 50) y presentar un
metabolismo fotosintético tipo ácido crasuláceo (MAC), inflorescencias
colgantes de llamativos colores y extraordinaria belleza. Además de ventajas
comparativas frente a otras bromeliáceas, presenta tolerancia a la sequía y baja
exigencia en nutrientes (Brown et al. 1997, Benzing 2000, Crayn et al. 2004).
La especie B. rosea es generalmente propagada por semillas o por
división asexual de brotes laterales y produce en promedio tres brotes o hijos
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anuales, requiriéndose alrededor de cuatro a cinco años para que las plantas
desarrollen inflorescencias y un tamaño aceptable para la venta (Esteva y
Steyermark 1987). Este proceso resulta lento como para producir la cantidad
necesaria de plantas que exige el comercio, particularmente el europeo, donde
existe una gran demanda de esta especie. Sin embargo, la propagación a gran
escala se puede lograr empleando técnicas de cultivo in vitro en donde es
preciso controlar ciertos factores como: tipo, tamaño, edad fisiológica y
desinfección del explante, formulación y constitución física del medio
nutritivo, balance hormonal, número de subcultivos y condiciones
ambientales, todas las cuales influyen en la estabilidad genética y en los
diferentes eventos morfogenéticos que ocurren en la célula (George 1996). En
relación al explante, se considera que la regeneración a partir de ápices es
rápida y permite la recuperación de genotipos estables, pero en este último
caso, en menor proporción que los meristemas (Slater et al. 2003).
En varias especies de bromeliáceas se han desarrollado métodos exitosos
de propagación in vitro, dentro de los cuales se pueden mencionar la
micropropagación de la piña (Ananas comosus) (Almeida et al. 1995,
Alvarado y Mogollón 2004, Mogollón 2004) y de otras especies ornamentales
como: Quesnelia quesneliana, Vriesea poelmannii, Aechmea fasciata y
Guzmania sp. (Hosoki y Asahira 1980), Tillandsia sp. y Vriesea sp.
(Kukulczanka y Czaetks 1989), Vriesea fosteriana (Mercer y Kerbauy 1992,
Galek y Kukulczanka 1996), Vriesea sp. (Mekers y Van Onsen 1983),
Aechmea fasciata (Vinterhalter y Vinterhalter 1994), Neoregelia cruenta
(Carneiro et al. 1999), Tillandsia sp., Guzmania sp. y Aechmea fasciata
(George 1996), Guzmania lingulata y Vriesea splendens (Pierick et al. 1984) y
Cryptanthus (Koh y Davies 1997). En el presente estudio se establece como
objetivo la regeneración masiva de B. rosea a partir de ápices caulinares.
MATERIALES Y MÉTODOS
Los estudios se realizaron en el laboratorio de Cultivo in vitro de la
Unidad de Biotecnología Vegetal, ubicado en el Decanato de Agronomía,
Universidad Centroccidental “Lisandro Alvarado” (UCLA), en Tarabana,
estado Lara, Venezuela.
MATERIAL VEGETAL Y ESTABLECIMIENTO DE LAS PLANTAS MADRES O DONANTES
Se utilizaron 15 plantas adultas de B. rosea (Hortus ex Beer), entre 70 a
90 cm de largo, que fueron adquiridas en el vivero “La Orquídea” localizado
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Pardo et al.
[Bol. Centro Invest. Biol.
en el Hatillo, estado Miranda, Venezuela. Posteriormente, se colocaron en el
umbráculo de la sede de los Postgrados de Agronomía de la UCLA.
Las plantas madres se observaron continuamente para mantenerlas en
óptimas condiciones. Semanalmente se aplicaron riegos con aspersiones de
benomil (2 gL-1) y fertilizante foliar de fórmula 20-20-20 (Orquidex). En el
umbráculo se obtuvieron valores promedios de 200 µmolm-2s-1 en las horas de
mayor luminosidad, 28ºC de temperatura y 70% de humedad relativa.
TIPO Y DESINFECCIÓN DEL EXPLANTE
Se utilizaron ápices caulinares de las plantas madres más jóvenes. Para
ello, se eliminaron todas las hojas hasta quedar un tallo desnudo que permitió
visualizar las yemas. Los tallos se sometieron a un protocolo de desinfección
que consistió en tres lavados con agua corriente y jabón en polvo comercial;
seguidamente se aplicó una solución jabonosa de iodo (Betadine) al 10%,
durante 10 min para posteriormente sumergirlos en una solución de benomil
(Benlate 1,5 gL-1) durante 15 min, con tres gotas de adherente (Citowett plus)
por cada litro de agua. Por último se colocaron en una solución de hipoclorito
de sodio al 15%, durante 15 min. Entre cada paso, se hicieron tres lavados
sucesivos con agua destilada-esterilizada. Todos los procedimientos anteriores
se realizaron en recipientes de vidrio sobre planchas de agitación continua.
Finalizado el protocolo de desinfección, los siguientes pasos del cultivo in
vitro se ejecutaron bajo cámara de flujo laminar IAS (Integrated Air Systems).
INICIACIÓN DE BROTES
Se utilizó el medio de cultivo Murashige y Skoog (1962), constituido por
sus sales inorgánicas en concentración completa, 30 gL-1 de sacarosa,
vitaminas: tiamina-HCl (30 mgL-1), ácido nicotínico (10 mgL-1), piridoxina (1
mgL-1), glicina (2 mgL-1) y mioinositol (100 mgL-1). Se empleó 1 mgL-1 del
regulador 2-bencilaminopurina (BAP) en combinación con cuatro
concentraciones (0,01; 0,05; 0,1 y 0,5 mgL-1) de ácido naftalenacético (ANA).
Se utilizaron dos tipos de medio: semisólido con el uso de agar (Difco-Agar), a
una concentración de 8 gL-1, y líquido sin la adición de agente gelificante. En
total se probaron ocho tratamientos con 15 repeticiones/tratamiento. Se
consideró un ápice por tubo de ensayo como unidad experimental. Los
explantes de 2 mm de largo contenían cuatro primordios foliares. El medio se
dispensó en tubos de ensayo de 25 x 150 mm, distribuidos en alícuotas de 20
mL por cada tubo; finalmente el pH del medio se ajustó a 5,7 ± 0,1. Una vez
ocurrida la siembra, los tubos se ubicaron de manera aleatoria en cámara de
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crecimiento, a una temperatura de 25 ± 2 ºC, iluminación de 13,5 µmolm-2s-1 y
fotoperíodo de 16 h. Las variables evaluadas a los 30 días de iniciado el
experimento fueron porcentaje de contaminación y regeneración de brotes;
ésta última calculada como el porcentaje de explantes que formaron brotes.
MULTIPLICACIÓN DE BROTES
Se emplearon brotes de 2 a 3 cm de largo y 2 a 3 hojas/brotes procedentes
de la etapa de iniciación. Se cultivaron en medio líquido, manteniendo los
mismos componentes utilizados para la iniciación de brotes y se determinó el
efecto de la combinación de los reguladores BAP (1 mgL-1) y ANA (0,0; 0,01;
0,1 y 0,5 mgL-1). El pH del medio se ajustó a 5,7 ± 0,1, el cual se dispensó en
frascos de vidrio de 120 mL de capacidad, distribuidos en alícuotas de 20 mL
por cada frasco. Una vez ocurrida la siembra, los frascos se ubicaron en
cámara de crecimiento bajo agitación continua (70 rpm), a una temperatura de
25 ± 2ºC, iluminación de 13,5 µmolm-2s-1 y fotoperíodo de 16 h. En total se
conformaron cuatro tratamientos con 15 repeticiones por tratamiento. Se
consideró un brote/frasco como unidad experimental. Las variables evaluadas
a los 60 días de iniciada la etapa de multiplicación fueron altura de los brotes
(cm) y número de brotes/explante.
ENRAIZAMIENTO DE BROTES
Se seleccionaron brotes provenientes de la etapa de multiplicación in
vitro, con un tamaño aproximado de 4 a 5 cm y 4 a 5 hojas/brotes, los cuales
se cultivaron en medio MS (Murashige y Skoog 1962), con los mismos
constituyentes orgánicos indicados para las dos etapas anteriores, a excepción
de los reguladores de crecimiento. Para determinar el efecto del regulador
ANA en la rizogénesis, se probaron cuatro concentraciones (0,0; 0,1; 0,5 y 1
mgL-1) de esta auxina, empleando dos estados físicos del medio nutritivo:
líquido (sin agar) y semisólido (8 gL-1 de Difco-Agar), para un total de ocho
tratamientos con 15 repeticiones cada uno, considerándose un brote/frasco
como unidad experimental. Ambos tipos de medio se dispensaron en frascos
de vidrio con capacidad de 120 mL, añadiendo 20 mL en cada uno.
Seguidamente, se ubicaron en cámara de crecimiento a una temperatura de 25
± 2 ºC, iluminación de 13,5 µmolm-2s-1 y 16 h de fotoperíodo. Los frascos con
medio líquido se sometieron a agitación continua (70 rpm). Las variables
evaluadas a los 30 días del ensayo fueron número y longitud máxima de las
raíces.
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Pardo et al.
[Bol. Centro Invest. Biol.
ACLIMATIZACIÓN DE VITROPLANTAS
Se evaluó el efecto de diferentes sustratos sobre la transferencia de plantas
in vitro a condiciones in vivo. Para ello se seleccionaron brotes enraizados con
un tamaño de 5 a 7 cm. Los sustratos de arena cernida, aserrín de coco y
Promix® (turba, perlita, vermiculita) se utilizaron solos y en forma combinada:
arena cernida, aserrín de coco (1:1 v/v) y arena, aserrín y Promix® (1:1:1
v/v/v). La aclimatización (Conover y Poole 1984) se hizo en cámara húmeda
empleando bandejas plásticas con tapa de 20 x 10 x 10 cm. Para tal fin, se
trasplantaron 15 vitroplantas por bandeja para un total de dos bandejas por
cada tratamiento; se colocaron a una temperatura de 23 ± 2ºC, iluminación de
200 µmolm-2s-1 y se mantuvieron tapadas por un lapso de 15 días, después del
cual se realizaron riegos interdiarios hasta completar los 60 días que duró el
ensayo. Las variables evaluadas a los 30 y 60 días fueron: altura de la planta,
número de hojas, número y longitud de las raíces.
Una vez aclimatizadas, todas las plantas que alcanzaron un promedio de
10 a 12 cm de altura y 8 a 10 hojas, se trasplantaron a vasos plásticos de 50
cm3 de capacidad contentivos de una mezcla de raíces de helecho y aserrín de
coco (1:1 v/v), manteniéndose en condiciones de vivero a una temperatura
promedio de 28 ºC, 70% de humedad relativa y 200 µmolm-2s-1 de
iluminación. Se aplicó el fertilizante foliar de fórmula 20-20-20 (Orquidex),
así como riegos interdiarios. Finalmente, las plantas que superaron los 15 cm
de altura fueron amarradas a piezas de madera o raíces de helecho y colocadas
bajo sombra natural para que continuaran su crecimiento.
DISEÑO EXPERIMENTAL Y ANÁLISIS DE DATOS
En todos los experimentos se aplicó un diseño completamente al azar. Los
datos que cumplieron con los supuestos del análisis de la varianza se
procesaron mediante esta técnica empleándose la prueba de Tukey para la
comparación de medias. En aquellos casos donde no se cumplieron los
supuestos del análisis de la varianza se utilizó la vía no paramétrica KruskalWallis con la prueba de medias por comparación de rangos múltiples,
indicándose sus respectivos promedios. En todos los casos, el nivel de
significancia fue de 5%.
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RESULTADOS Y DISCUSIÓN
INICIACIÓN DE BROTES
De los ocho tratamientos utilizados para la iniciación de brotes sólo se
observó respuesta en el medio semisólido suplementado con 1 mgL-1 de BAP
y 0,01 mgL-1 de ANA a los 30 días de iniciado el experimento. En los restantes
tratamientos se evidenció el necrosamiento de los ápices a partir de los 15 días.
De manera similar, Alvarado y Mogollón (2004) y Mogollón (2004)
encontraron que la combinación de 1 mgL-1 de BAP y 0,01 mgL-1 de ANA
resultó efectiva para la iniciación de brotes de piña (A. comosus) procedentes
de ápices caulinares.
La regeneración ocurrió en el 90% de los explantes cultivados en 1 mgL-1
de BAP y 0,01 mgL-1 de ANA, con un porcentaje de contaminación de 25%,
permitiendo el crecimiento y desarrollo de brotes entre 1 y 2 cm de altura con
una a dos hojas. Similares resultados fueron observados en piña cv. Española
Roja, donde se logró un porcentaje de regeneración entre 85 y 90% (Alvarado
y Mogollón 2004) y en Vriesea sp. con un 20% de contaminación (Mekers y
van Onsen 1983).
En cuanto a la constitución física, los resultados revelaron que el medio
semisólido propició la regeneración de brotes a partir del explante utilizado. Se
conoce que la mayoría de las bromeliáceas son extremadamente sensibles al
déficit de oxígeno durante esta etapa (Pierick et al. 1984, Kukulczanka y
Czaetks 1989, Mercer y Kerbauy 1992). Dicha respuesta puede atribuirse a la
mayor disponibilidad de oxigeno en el medio semisólido en comparación con
el medio en estado líquido.
MULTIPLICACIÓN DE BROTES
Para la variable altura de brotes, la prueba de Tukey separó los
tratamientos en tres grupos de los cuales dos resultaron estadísticamente
diferentes. La mayor altura se registró con el uso del medio MS con 1 mgL-1
de BAP y 0,5 mgL-1 de ANA con un promedio de 4,75 cm. Seguidamente, las
combinaciones 1 mgL-1 de BAP y 0,1 mgL-1 de ANA, 1 mgL-1 de BAP y 0,01
mgL-1 de ANA, mostraron valores de 3,87 y 3,86 cm de altura,
respectivamente. Los brotes más pequeños (3,19 cm) se observaron con la
aplicación de 1 mgL-1 de BAP sin ANA (Tabla 1).
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Tabla 1. Altura y número de brotes de Billbergia rosea, cultivados en medio MS
-1
-1
líquido suplementado con BAP (1 mgL ) y ANA (0, 00; 0,01; 0,1 y 0.5 mgL ), a los
60 días de la etapa de multiplicación in vitro.
Reguladores de crecimiento
(mgL-1)
BA
ANA
1
1
1
1
0,00
0,01
0,10
0,50
CV (%)
Altura de brotes
(cm)
3,19 b
3,86 ab
3,87 ab
4,75 a
25,10
Número de brotes
13,33 b
17,54 ab
12,66 b
19,30 a
-
Valores con la misma letra, dentro de la columna, no difieren al nivel de P ≤ 0,05,
según prueba de Tukey y comparación de rangos múltiples.
Para el número de brotes el máximo promedio (19,30) se registró con 1
mgL-1 BAP y 0,5 mgL-1 ANA, seguido por las combinaciones 1 mgL-1 BAP y
0,01 mgL-1 ANA, 1 mgL-1 BAP sin ANA, donde se alcanzaron valores de
17,54 y 13,33 brotes, respectivamente. El menor promedio se observó con la
combinación 1 mgL-1 BAP y 0,1 mgL-1 ANA, con 12,66 brotes (Tabla 1).
Investigaciones previas realizadas por Hosoki y Asahira (1980), Mekers y
van Onsen (1983) y Kukulczanka y Czaetks (1989), reportaron que las
bromeliáceas requieren de una mayor proporción de citocininas que de auxinas
durante la etapa de multiplicación de brotes. Específicamente en Tillandsia
sp., Vriesea sp. y Cryptanthus sp. se promovió la multiplicación de brotes con
la combinación de 1 mgL-1 BAP y 0,5 mgL-1 ANA (Mekers y van Onsen 1983,
Kukulczanka y Czaetks 1989), mientras que en Quesnelia. guesneliana,
Vriesea poelmanni y Aechmea fasciata (Hosoki y Asahira 1980, George
1996), se requirieron una dosis más elevada de ANA (1mgL-1).
El empleo del medio líquido permitió que los brotes experimentaran
incrementos en las variables altura y número de brotes, lo cual puede estar
asociado a la presencia en B. rosea de tricomas especializados para la
absorción de agua y nutrientes (Benzing 2000). De igual manera, el medio
líquido propició un óptimo crecimiento y multiplicación de los brotes en otras
bromeliáceas como Quesnelia quesneliana, Vriesea poelmmanni y Aechmea
fasciata (Hosoki y Asahira 1980) y Guzmania monostachia y Tillandsia
coronata (Galek y Kukulczanka 1996).
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ENRAIZAMIENTO DE BROTES
El análisis estadístico no arrojo diferencias significativas entre el
regulador ANA y la constitución física del medio, por tal motivo, ambos
factores se analizaron independientemente (Tabla 2).
Tabla 2. Análisis de la varianza para número y longitud de las raíces, a los 30 días
del cultivo in vitro de brotes de Billbergia rosea, en medio MS suplementado con
-1
cuatro concentraciones de ANA (0,0; 0,1; 0,5: 1,0 mgL ) y dos constituciones físicas
del medio (semisólido y liquido).
Número Raíces
Longitud Raíces
FdV
Gl
CM
CM
Tratamiento
Estado Físico
Trat x Estado
EE
Total
CV (%)
3
1
3
88
95
99,82*
319,01*
1.593 ns
5,95
25,41*
23,11*
0,26 ns
0,84
30,11
*Indica diferencias significativas al nivel de P ≤ 0,05.
significativas al nivel de P ≤ 0,05.
27,34
ns
No existen diferencias
El número de raíces se incrementó a medida que se aumentó la
concentración de ANA en el medio líquido, lo cual revela que esta auxina
favoreció la rizogénesis en los brotes de B. rosea. El incremento en la
concentración de 0,1 a 1 mgL-1, aumentó el número de raíces de 6,54 a 8,95,
mientras que cuando ANA estuvo ausente en el medio de cultivo, se
obtuvieron en promedio 4,17 raíces. Contrariamente, la longitud de las raíces
fue menor a medida que se incrementó la concentración de ANA,
observándose el mayor promedio (3,43 cm) con 0,1 mgL-1 y el menor (1,27
cm) con 1 mgL-1 de ANA (Tabla 3).
De manera similar Pierick et al. (1984) y Kukulczanka y Czaetks (1989)
encontraron que el ANA era la auxina más importante para la inducción de
raíces. En los cultivares de piña Española Roja (Alvarado y Mogollón 2004) y
Queen Australia (Mogollón 2004), así como en Aechmea fasciata (González
et al. 2003), se observó un incremento en el número de raíces con el aumento
en la concentración de ANA. Igualmente, especies de Tillandsia y Vriesea,
requirieron 0,5 mgL-1 de ANA para la formación de 4 a 16 raíces (Mekers y
Van Onsen 1983, Kukulczanka y Czaetks 1989).
Pardo et al.
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Tabla 3. Número y longitud de las raíces de brotes de Billbergia rosea cultivados en
medio líquido y cuatro concentraciones de ANA (0,0; 0,1; 0,5: 1,0 mgL-1), a los 30
días de la etapa de enraizamiento.
Regulador de crecimiento
ANA
(mgl-1)
Número de raíces
0,0
0,1
0,5
1,0
CV (%)
4,17 c
6,54 b
7,70 ab
8,95 a
30,11
Longitud de raíces
(cm)
3,12 a
3,43 a
1,82 b
1,27 b
27,34
Valores con la misma letra, dentro de la columna, no difieren al nivel de P ≤ 0,05,
según la prueba de Tukey.
En relación a la constitución física, el medio líquido promovió la
producción del mayor número y longitud de raíces, con promedios de 8,67 y
2,90 cm, respectivamente (Tabla 4). Similar a la respuesta en B. rosea, en
bromeliáceas como Aechmea fasciata (Hosoki y Asahira 1980, González et al.
2003), Tillandsia y Vriesea (Pierick et al. 1984, Kukulczanka y Czaetks 1989)
y Ananas comosus (Alvarado y Mogollón 2004, Mogollón 2004), el medio
líquido propició el rápido crecimiento de brotes y la formación de raíces.
Tabla 4. Número y la longitud de las raíces de brotes de Billbergia rosea cultivados
en medio MS (semisólido y líquido).
Constitución del Medio
Número de Raíces
Longitud de Raíces (cm)
Sólido
Líquido
CV (%)
5,03 b
8,67 a
30,11
1,92 b
2,90 a
27,34
Valores con la misma letra, dentro de la columna, no difieren al nivel de P ≤ 0,05,
según la prueba de Tukey.
ACLIMATIZACIÓN DE VITROPLANTAS
A los 30 días de la aclimatización la mayor altura de planta se presentó en
el sustrato Promix® con un valor promedio de 10,07 cm; seguido por el
sustrato aserrín de coco con 8,25 cm y las combinaciones de arena cernida más
aserrín de coco (1:1) y arena, aserrín de coco y Promix® (1:1:1), con alturas
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Regeneración In Vitro de Billbergia Rosea
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promedios de 7,23 cm y 6,25 cm respectivamente; mientras que en el sustrato
arena las plantas alcanzaron un promedio de altura de 5,33 cm (Tabla 5).
Tabla 5. Altura de las plantas, número de hojas, número y longitud de raíces, de
vitroplantas de Billbergia rosea a los 30 días de la aclimatización.
Sustrato
A
As
P
A + As
A + As + P
CV %
Altura de
Planta (cm)
5,33 bc
8,25 ab
10,07 a
7,23 ab
6,25 b
30,1
Número de
hojas
6,17 b
8,33 b
13,33 a
7,67 b
9,66 ab
31,2
Número de
raíces
4,33
5,50
6,66
4,16
6,16
26,8
Longitud de
raíces (cm)
2,30
2,98
3,45
3,03
3,57
-
Valores con la misma letra, dentro de las columnas, no difieren al nivel de P ≤ 0,05,
según la prueba de Tukey y comparación de rangos múltiples. . A = Arena; As =
Aserrín de coco; P = Promix.
De manera similar, el número de hojas se incrementó cuando se usó el
sustrato Promix®, obteniéndose un promedio de 13 hojas/planta; seguido por la
combinación de arena cernida, aserrín de coco y Promix®, con una media de 9
hojas/planta. En el sustrato aserrín de coco se desarrollaron en promedio ocho
hojas; mientras que los sustratos de arena, aserrín y la combinación de arena y
aserrín de coco, no presentaron diferencias estadísticas en los valores
promedios (Tabla 5).
La prueba de Tukey efectuada para el número de raíces no detectó
diferencias significativas entre los distintos sustratos a los 30 días de las
evaluaciones, observándose en promedio de 4 a 6 raíces para todos los
tratamientos. Similar a estos resultados, la comparación de rangos múltiples
aplicada a la longitud de raíces no detectó diferencias significativas entre los
sustratos, obteniéndose promedios de 2 a 4 cm de longitud para todos los
tratamientos (Tabla 5).
A los 60 días de la aclimatización las vitroplantas cultivadas en el sustrato
Promix® presentaron promedios de 12,07 cm para altura, 15 para número de
hojas, 14 para número de raíces y 10,42 cm para longitud de raíces. Estos
valores fueron menores con el uso de los otros sustratos, observándose con el
aserrín de coco promedios de 10,13 cm para altura de planta, 13 hojas, 9,83
raíces y 9,47 cm de longitud de raíces, seguido por las combinaciones de los
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[Bol. Centro Invest. Biol.
sustratos arena y aserrín de coco y arena, aserrín de coco y Promix®. El uso del
sustrato arena arrojó los valores más bajos para las variables evaluadas (Tabla
6).
Tabla 6, Altura de las plantas, número de hojas, número y longitud de raíces, de
vitroplantas de Billbergia rosea a los 60 días de la aclimatización.
Sustrato
A
Altura de
Planta (cm)
5,90 c
Número de
hojas
4,83 c
Número de
raíces
3,66 c
Longitud de
raíces (cm)
2,43 b
As
P
A + As
A + As + P
CV %
10,13 ab
12,07 a
7,62 bc
6,16 c
34,5
13,33 ab
15,33 a
9,50 ab
8,83 bc
36,8
9,83 ab
14,33 a
7,33 b
5,83 bc
39,9
9,47 a
10,42 a
7,33 a
5,88 ab
38,7
Valores con la misma letra, dentro de las columnas, no difieren al nivel de P ≤ 0,05,
según la prueba de Tukey. A = Arena; As = Aserrín de coco; P = Promix.
Los resultados obtenidos indicaron que los sustratos Promix® y aserrín de
coco, favorecieron el crecimiento de las plantas en la etapa de aclimatización,
lo cual puede ser atribuido a sus propiedades físicas como alta capacidad de
retención de humedad y aireación que favoreció la difusión de oxígeno a las
raíces, así como un adecuado suministro de agua y nutrientes a la parte aérea
(Hartmann y Kester 1997). En el caso específico de la epífita B. rosea, las
raíces son altamente susceptibles a excesos de humedad (Mekers 1977,
Kukulczanka y Czaetks 1989), siendo la aireación la cualidad más importante
que debe poseer un sustrato para garantizar un rápido y óptimo crecimiento de
este órgano.
En el caso del sustrato arena, su alta capacidad de aireación favoreció la
aclimatización de las plantas cuando fue combinado con los otros sustratos. En
tal sentido, en las combinaciones de arena cernida, aserrín de coco y Promix®
(1:1:1) y arena cernida más aserrín de coco (1:1), las vitroplantas mostraron
valores promedios comparables con el sustrato Promix®, lo cual introduce una
ventaja económica, por cuanto se ahorraría el uso de este sustrato importado.
Todas las vitroplantas provenientes de la aclimatización lograron
desarrollarse de manera satisfactoria durante su traslado a vivero. Hasta el
presente, todas las plantas mantenidas en vivero muestran una apariencia
normal, sin cambios evidentes en la morfología o en la coloración de las hojas.
Vol. 42, 2008]
Regeneración In Vitro de Billbergia Rosea
503
Similarmente, en otras especies de bromeliáceas de los géneros Vriesea,
Tillandsia y Guzmania (Mekers y Van Onsen 1983, Kukulczanka y Czaetks
1989, Mercer y Kerbauy 1992), la mayoría de las plantas regeneradas bajo
condiciones in vitro han sobrevivido y mostrado un fenotipo acorde con las
características que las describen.
CONCLUSIONES
Se comprobó la efectividad de la técnica de cultivo in vitro a partir de
ápices caulinares para la regeneración masiva de plantas de B. rosea.
En el lapso de un año, equivalente al período de madurez de una planta
adulta, se logró producir a partir de un ápice caulinar, un promedio de 28
vitroplantas, los cuales fueron fácilmente aclimatizadas y trasferidas a vivero
mostrando una apariencia fenotípica normal.
RECOMENDACIONES
Emplear la técnica de cultivo in vitro aquí desarrollada a escala comercial
para contribuir a la incorporación de B. rosea en el mercado nacional e
internacional de productos ornamentales.
Utilizar del sustrato arena en combinación con los sustratos Promix® y
aserrín de coco durante la aclimatización de vitroplantas de B. rosea por
cuanto introducen una ventaja económica.
AGRADECIMIENTOS
A Paúl Azuaje por su valiosa colaboración para la elaboración de esta
investigación. Al Centro de Desarrollo Científico y Humanístico de la
Universidad Central de Venezuela (CDCH-UCV) y al Premio de Promoción a
la Investigación por el financiamiento otorgado.
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