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ACTIVIDAD BIOLÓGICA Y ENZIMAS DE ESTRÉS EN PLÁNTULAS DE CAFÉ Coffea
arabiga L. BIOFERTILIZADAS
María de Lourdes Adriano Anaya1
Carlos Hernández Ramos1
Miguel Salvador Figueroa1
Ramón Jarquin Gálvez2
RESUMEN
La producción de plántulas de café, convencionalmente se realiza con la aplicación de
fertilizantes químicos. En este trabajo se planteó como objetivo evaluar el efecto de
biofertilizantes (inoculos microbianos) en la actividad microbiológica del suelo y las enzimas de
estrés en plántulas de café Coffea arabica L. Como biofertilizantes se empleó una cepa de HMA
y dos cepas diazotroficas, PACHAZ08 y 11B. Se establecieron 8 tratamientos en un diseño
factorial 23 y 100 plántulas por tratamiento. Despues de la inoculación de las plántulas se siguió
el desarrollo de las mismas mediante muestreo cada 4 semanas (28 días) hasta la semana 16.
En cada muestreo se determinó en las plantas altura, longitud de las hojas, longitud de la raiz,
actividad de catalasa y peroxidasa, y en el suelo actividad de invertasas, esteras, y fosfatasa
acida y alcalina. Los datos se sometieron al analisis de varianza y comparacion de medias. La
mayor actividad microbiológica se encontró en los suelos de las plántulas inoculadas con los
tres microorganismos y en las plántulas inoculadas únicamente con el diazotrofo 11B. En las
plantas de esos mismos tratamientos se encontró la mayor activiad de enzimas anti estres.
Como resultado de lo anterior las plántulas de los mencionados tratamientos mostraron las
mejores características anatómicas.
PALABRAS CLAVE: Vivero, inoculo, diazotrofo, esterasa, resistencia
INTRODUCCIÓN
En México, Chiapas es el estado con mayor producción de café orgánico. En dicho estado,
243,667 Hm2 de tierra se dedican a dicha actividad e involucra a 175,000 productores
(COMCAFE, 2007). Aunque el estado de Chiapas es cuna de la cafeticultura orgánica (dio inicio
en la década de 1960 a 1970 con la aparición de la filosofía biodinámica), la mayoría de los
productores orgánicos actuales surgen por su incapacidad económica para adquirir los
productos químicos que rutinariamente utilizaban en el cultivo. La recurrente crisis en los
precios internacionales y la incorporación al mercado internacional de café de menor calidad y
precio, agudizó la insolvencia económica de los cafeticultores, ampliando la zona cafetalera sin
empleo de agroquímicos.
Paralelamente, la corriente para consumir alimentos libres de agroquímicos (orgánicos) creció
rápidamente en el mercado europeo, dando un impulso a la cafeticultura (y a otros productos
del campo). Dicho mercado ofreció ventajas económicas para los productores de café libre de
agroquímicos. De esta forma, la “cafeticultura orgánica” se estableció como una forma de
producción.
Aunque el número de productores chiapanecos de café orgánico se ha incrementado, el
desarrollo científico – tecnológico requerido para mantener la productividad no ha seguido la
misma dinámica y ha quedado atrasado. Las tecnologías de sustentabilidad para fertilizar los
cafetos, que los campesinos de Chiapas emplean, en muchos de los casos se reducen al
1
2
Centro de Biociencias. Universidad Autonoma de Chiapas. Correo-e: [email protected]
Facultad de Agronomía. Universidad Autónoma de San Luis Potosí.
empleo de la materia vegetal obtenida durante la limpieza de los cafetos y la eliminación de la
flora acompañante (si es que no la emplean como fuente de energía), en algunos casos
emplean la composta obtenida de la pulpa del grano y los más avanzados emplean los
productos del vermicomposteo de dicha composta. Para el control de plagas y enfermedades
del cafeto, en el mejor de los casos emplean parasitoides para el primer caso y caldo bordeles
para el segundo caso. Las tecnologías de sustentabilidad previamente mencionadas no son
empleadas por los cafeticultores chiapanecos para la obtención de plántulas que les permita
renovar el cafetal o abrir nuevas áreas de cultivo (PROCAFE, 2005). En este sentido, los
campesinos establecen el semillero sobre el suelo y las plántulas que alcanzan la etapa de
“mariposa”, que están libres de enfermedades y tienen buena formación, se trasplantan a
bolsas de polietileno que contiene suelo del cafetal. Las plantas se colocan en una distancia de
20 X 20 cm permaneciendo de 4 a 6 meses en vivero antes de ser llevadas a campo. En esta
etapa las plántulas son fertilizadas con la formula 15-9-12, ó 20-20-00 (N-P-K) en dosis de 5 a 8
g planta-1, en tres aplicaciones (ICAFE, 2004).
Así que, para que el café del Soconusco se coloque con mayor facilidad en los mercados
internacionales, se debe de realizar un manejo adecuado desde el semillero hasta su cosecha
aplicando, para ello, prácticas agrícolas que sean más amigables con el ambiente. Así que el
empleo de inoculantes microbianos o biofertilizantes desde el establecimiento del vivero es una
alternativa para disminuir el uso de agroquímicos.
En diversos modelos biológicos, se ha demostrado que el empleo de inoculantes microbianos
(microbiota exógena) mejora tanto el desarrollo de las plantas (Bashan et al 1998; Sánchez et
al, 2005) como la resistencia al estrés físico y al ataque de patógenos Salvador et al., 2009) sin
embargo, poco trabajo se ha orientado al análisis del impacto en la actividad biológica y en las
enzimas involucradas en la eliminación de moléculas de oxígeno reactivo, por lo que se piensa
que la inoculación con microorganismos autóctonos durante la etapa de vivero mejorará la
actividad biológica del suelo e incrementará la actividad de las enzimas de estrés.
Por todo lo anterior el objetivo del presente trabajo fue evaluar el efecto de la inoculación
microbiana en la actividad microbiológica del suelo y en las enzimas de estrés en plántulas de
café Coffe arábica variedad Bourbon durante la etapa de vivero.
MATERIALES Y MÉTODOS
Ubicación del área de estudio
El presente trabajo se realizó en el ejido “El Águila” (16o05’39” N, 92o11’12” O y 1,250 msnm)
del Municipio de Cacahoatán, Chis., México, teniendo como antecedente los trabajos de
capacitación desarrollados en años anteriores a través del modelo de ECEA (Jarquin, 2005).
Semillas empleadas
Se empleó 1 Kg de semillas de café Coffea arabica L. de la variedad Bourbon procedentes de
las parcelas del mismo lugar. Las semillas se eligieron tomando en consideración los criterios
del promotor de la ECEA.
Inoculo microbiano
Se uso Glomus intrarradices cultivada en raíces transformadas de zanahoria y dos cepas de
bacterias diazotroficas, 11B y PACHAZ 08, las cuales se crecieron en medio nutritivo a 28 oC y
200 rpm por 12 h. Los microorganismos forman parte de la colección del Centro de Biociencias
de la UNACH
Establecimiento del vivero
Primeramente las semillas se germinaron en una cama de suelo del cafetal. Cuando las
plántulas alcanzaron la etapa de mariposas, se retiraron y se lavaron con agua. Las plántulas
de similar tamaño, sanas y bien formadas se sembraron en bolas de polietileno (17 x 23 cm)
que contenían suelo del cafetal mezclado (3:1) con composta hecha con residuos de la cosecha
de café.
Diseño experimental
Se estableció un diseño factorial 23 (Cuadro 1) considerando los niveles de ausencia y/o
presencia de los microorganismos. Cada tratamiento estuvo constituido por 100 repeticiones,
considerando cada planta como unidad experimental.
Cuadro 1 Matriz factorial de los tratamientos establecidos en este trabajo
Tratamientos (T)
HMA (A)
PACHAZ08(B)
1
2
3
+
4
+
5
+
6
+
7
+
+
8
+
+
11 B (C)
+
+
+
+
Inoculación de plántulas
Al momento de la siembra en las bolsas, las plántulas fueron inoculadas con 1 ml del cultivo
bacteriano que contenía 1x108 UFC y del inoculo de HMA se coloco 1 cm2 de medio gelificado,
de acuerdo con los tratamientos del Cuadro 1.
Variables evaluadas
A 10 plantas de cada tratamiento se les determinó: altura de la planta (cm), longitud de hija
(cm), longitud de raíz (cm), actividad enzimática indicativa de estrés (peroxidasas y catalasas
por el método de Kar y Mishra 1976) y actividad enzimática microbiana del suelo (invertasas por
el método de (Bailey et al., 1992); esterasas por el método de (Kokalis et al., 1994); fosfatasas
ácida y alcalina por el método de (Barroti y Nahas, 2003). Las determinaciones se realizaron
cada 4 semanas hasta la 16, después de la inoculación.
Análisis de resultados
os resultados fueron evaluados mediante análisis de varianza (ANOVA) y cuando existieron
diferencias se efectuó comparación de medias (Tukey α = 0.05).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Tamaño de las plantas
En el Cuadro 2 se muestran los valores de altura de planta, longitud de hoja y de raíz, después
de 16 semanas de establecido el vivero. Con claridad se observa que las plantas biofertilizadas
presentaron mejores características anatómicas. El análisis de varianza de los datos de la altura
alcanzada por las plantas de los diversos tratamientos se encontró que entre dichos datos hubo
diferencia significativa. De esta forma las plantas del tratamiento donde se aplicaron los tres
microorganismos (Tratamiento 8) y las inoculadas con el diazótrofo 11B tuvieron la mayor
altura. Dichas plantas fueron, en promedio, 32.8 % más altas que las del tratamiento testigo.
Cuadro 2. Efecto de la biofertilizacion en las variables anatómicas y en la colonización radicular
por HMA y bacteriana en plántulas de cafeto, crecidas en vivero rústico, después de 16
semanas de la inoculación.
T
1
2
3
4
5
6
7
8
LT
(cm)
13.4 c
17.2 a
13.7 bc
13.7 bc
14.0 bc
14.2 b
14.3 b
17.8 a
LH
(cm)
4.1 e
6.3 b
4.6 d
4.6 d
5.2 c
5.3 c
6.2 b
7.1 a
LR
(cm)
10.2 bc
11.2 ab
10.4 bc
10.1 bc
9.9 c
10.0 bc
11.3 ab
11.7 a
Tratamientos con letras iguales no son estadísticamente diferentes a p ≥ 0.05. T= Tratamientos.,
LT=Longitud del tallo, LH=longitud de hojas, LR=longitud de raíz.
En cuanto al tamaño de las hojas, se encontró que la longitud de las hojas de las plantas del
tratamiento testigo fue la más pequeña. Dichas hojas fueron 73 % menores que las hojas de las
plantas del Tratamiento 8. La diferencia en el tamaño de hoja fue estadísticamente significativa.
Por su parte, la mayor longitud radical la presentaron las plantas que recibieron la triple
inoculación (Tratamiento 8) siendo 14.7 y 18.2 % más larga que las plantas testigo y que las
plantas inoculadas exclusivamente con el HMA (Tratamiento 5), respectivamente (Cuadro 2).
Las diferencias observadas en las características anatómicas de las plantas de los diversos
tratamientos empleados muestran con claridad los efectos benéficos de los microorganismos
empleados, efectos que previamente se han reportado para otras plantas y otros
microorganismos empleados como biofertilizantes Morales (2003) para plántulas de café Coffea
arabica L. biofertilizadas con otros microorganismos promotores del crecimiento de plantas;
Díaz (2001), quien reportó que la altura de plántulas lechuga Lactuca sativa L., biofertilizadas
fue mayor que las plantas testigo; López (2008), quien encontró que la inoculación de plantas
de maíz (Zea mays) con bacterias diazotroficas influyó positivamente en la longitud del tallo, así
como en el número de hojas, estomas y raíces].
Autores como Medina et al. (1998) opinan que en muchas ocasiones y circunstancias el
establecimiento de una simbiosis micorrízica y microorganismos rizosféricos trae consigo una
serie de cambios fisiológicos y/o morfológicos en plantas hospedadora que casi siempre las
hace crecer y responder con más éxito a las tensiones ambientales, en comparación con las
plantas no inoculadas
El incremento de estos parámetros se le ha atribuido a la capacidad que tienen las bacterias
diazotroficas de sintetizar precursores del crecimiento vegetal como auxinas y giberelinas
(Collados, 2006), por lo que las fitohormonas secretadas por los microorganismos diazotrofos
hace incrementar el número de raíces laterales lo que permite a la planta tener un mejor
aprovechamiento de nutrimentos, agua, desarrollar su capacidad fotosintética y acumular mayor
biomasa carbonada.
Actividad enzimática
En el Cuadro 3 se muestran los valores de la actividad de las enzimas presentes en el suelo
rizosferico de las plantas de café empleadas en este trabajo y después de 16 semanas de
permanencia en el vivero. La mayor actividad enzimática fue de la fosfatasa ácida, mientras
que, la menor fue de la fosfatasa alcalina. Tanto en la actividad de estas enzimas como en la
actividad de invertasa y esterasa, los mayores valores se tuvieron en el suelo rizosferico de las
plantas que fueron inoculadas con los tres microorganismos empleados en este trabajo. A su
vez, en el suelo rizosferico de las plantas del tratamiento testigo, la actividad de todas las
enzimas mencionadas fue la menor. De esta forma se encontró que en este tratamiento la
actividad de invertasa, de esterasa, de fosfatasa ácida y fosfatasa alcalina fue 30.5, 34.0, 14.8 y
6.7% menor que en suelo rizosférico de las plantas donde se emplearon los tres
microorganismos.
Cuadro 3. Actividad de las enzimas invertasa, esterasa, fosfatasa ácida y fosfatasa alcalina y
contenido de nitrógeno total y fósforo soluble en el suelo rizosferico de plantas de café
empleadas en este trabajo, después de 16 semanas de permanencia en el vivero.
Fosfatasas
Invertasa
Esterasa
T
(nKatal/g de suelo)
(pKatal/g de suelo)
Ácida
Alcalina
(pKatal/g de suelo)
1
2
3
4
5
6
7
8
202.8 e
266.2 b
218.4 cd
216.4 de
231.2 cd
232.3 c
231.7 c
292.0 a
35.7 d
49.8 b
37.4 d
36.9 d
36.5 d
37.6 d
40.1 c
54.1 a
245.7 c
284.0 a
243.5 c
237.3 c
242.3 c
269.0 b
266.5 b
288.4 a
(nKatal/g de
suelo)
3.67 cd
3.77 bc
3.68 cd
3.62 d
3.85 ab
3.76 bc
3.75 bc
3.93 a
Tratamientos con letras iguales no fueron estadísticamente diferentes a p ≥ 0.05. T= Tratamientos.
El sistema de producción de café, al igual que el de cacao, tiene como característica que en el
mismo espacio convive una amplia diversidad de plantas. Esto hace que se produzca una gran
cantidad de materia orgánica (hojarasca, principalmente), la que al llegar al suelo se convierte
en sustrato que sirve para la proliferación microbiana. La velocidad de degradación, y
mineralización de los componentes de la materia orgánica, dependerá en gran medida de la
población y diversidad microbiana. En el sistema orgánico de producción (donde, en general,
hay ausencia de agroquímicos) las poblaciones microbianas se encontrarán en equilibrio
dinámico, por lo que la llegada de exo-microbiota (inoculantes) perturbará dicho equilibrio. La
perturbación puede ser positiva o negativa. En el caso del presente trabajo los resultados de
actividades enzimáticas en la rizosfera muestran que la llegada de exo-microbiota al sistema
perturba de forma positiva al equilibrio dinámico del sistema. Aunque la actividad de las
enzimas determinadas en este trabajo, mostraron incremento en su valor neto, con certeza no
se puede atribuir exclusivamente a la actividad de la exo-microbiota adicionada. Lo más
probable es que el incremento en la actividad de las enzimas se deba al complejo de reacciones
y relaciones establecidas dentro del sistema es decir, se deba a la microbiota nativa, a la
relación entre la microbiota nativa y la exo-microbiota, a la exo-microbiota misma, a la relación
exo-microbiota y la planta, a la planta misma y a la planta y la microbiota nativa.
Independientemente de lo anterior, el resultado final de esta red de relaciones es un suelo con
mejores propiedades para sostener el desarrollo del vegetal y, al final, un vegetal con mejores
características anatómicas, fisiológicas y de producción, lo cual confluye con los resultados
observados en la morfología de la planta.
Los resultados encontrados en este trabajo, coinciden parcialmente con lo reportado por
Collados (2006). Dicho investigador, trabajando con trigo, encontró que de las actividades
enzimáticas del suelo (fosfatasa ácida, β-glucosidasa y deshidrogenasa) investigada, solo la
fosfatasa ácida se vio impactada (positivamente) por la inoculación de Azospirrillum; las otras
permanecieron sin cambio.
Enzimas antioxidantes en plantas de cafeto
En el Cuadro 4 se muestra la actividad de las enzimas catalasa (CAT) y peroxidasa (POX), 4
meses después de iniciado el trabajo, de las plantas de los diversos tratamientos empleados en
este trabajo. La actividad de ambas enzimas siempre mostró una tendencia a incrementarse,
durante el tiempo que duró el estudio. Los tratamientos 2 y 8 mostraron la mayor actividad de
CAT y POX. Dichos valores fueron estadísticamente diferentes al resto de los tratamientos.
Las enzimas CAT y POX, miembros del sistema de defensa de las plantas, están involucradas
en la eliminación de las especies reactivas de oxígeno (ERO). La producción de las ERO, en
una planta, es resultado tanto de los procesos de respiración y de fotosíntesis, como del ataque
de patógenos o de cambios físicos ambientales (p. ej. sequía), los que juntos se conoce como
estrés oxidativo (EOx). El EOx representa, en conjunto, el factor limitante más importante para
la productividad vegetal y el rendimiento de las cosechas (Carrillo y Valle 2005). A mayor
actividad de CAT y POX en una planta, menores síntomas de EOx mostrará. El incremento en
la producción de CAT y POX en las plantas inoculadas con el diazotrofo 11B (Tratamiento 2),
indican que este microorganismo es capaz de inducir su producción. Situación que se ha
observado previamente por Gallegos (2005) quien demostró que la biofertilizacion de plantas de
maíz con el diazótrofo 11B permite, a las plantas producir más enzimas antioxidantes, lo que se
correlacionó con el incremento en la resistencia a la ausencia de agua por al menos 6 días.
Cuadro 4. Actividad de catalasa y peroxidasa en
diferentes tratamientos de biofertilizacion.
Enzima
T1
T2
T3
Catalasa (pKatal g-1) 96 b 135 a 92 b
Peroxodasa (U g-1)
625 b 745 a 635 b
las hojas de las plantas de cafeto sometidos a
T4
T5
T6
T7
T8
99 b
99 b 100 b 97 b
153 a
640 b 638 b 645 b 642 b
736 a
El mecanismo mediante el cual el diazotrofo 11B induce la producción de una mayor cantidad
de enzimas que combaten a las ERO es desconocido, aunque se puede presuponer la
existencia de un metabolito derivado de la interacción planta-diazotrofo. Esta suposición se
refuerza por el hecho de que en presencia del diazotrofo PACHAS08 (Tratamiento 4) no se
observó dicha respuesta, lo que coincide con lo previamente discutido de que entre estas
bacterias se establece una relación negativa.
Por su parte cuando el diazotrofo 11B interaccionó con el HMA (Tratamiento 6) tampoco se
observó dicho efecto, lo que pudiera deberse a un mecanismo diferente al comentado
previamente. Así mismo, el diazotrofo PACHAZ08 no modificó la producción de CAT y POX, por
lo que refuerza el hecho de que este organismo no establece una relación con las plantas de
café.
Dado que las enzimas CAT y POX también se inducen por la presencia de patógenos (hongos,
bacterias e insectos), se observó (datos no mostrados) que en las hojas de las plantas de los
tratamientos 2 y 8 la presencia de Cercospora coffeicola (causante de clorosis en las hojas) fue
menor que en el tratamiento testigo o que en las plantas inoculadas con la cepa.
CONCLUSIONES
El diazotrofo 11B solo o en conjunción con el HMA y el diazotrofo PACHAZ08, mejoró la
actividad biológica del suelo y la capacidad de producción de enzimas de combate al EOx en
plántulas de cafeto.
AGRADECIMIENTOS
A la Universidad Autónoma de Chiapas por el apoyo recibido a través de la Unidad de
Vinculación Docente “Producción de Biofertilizantes como Alternativa Biotecnológica de
Fertilización de Cultivos Agrícolas del Soconusco, Chiapas”
LITERATURA CITADA
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