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Patología molecular y el
Virus del papiloma humano
Servicio de Anatomía Patológica
Hospital General Universitario de
Ciudad Real
El virus del
papiloma
humano
Ciclo de vida del VPH
Infección de células basales  Síntesis Pr.
precoces (E) no estructurales  Replicación
episomal del ADN (Hib. In situ) 
 Infección latente
 Coilocito  Integración (Hib. In situ) +
Oncogenes + Genes supresores 
Carcinoma infiltrante
 Coilocito  Síntesis productiva ADN 
Síntesis Pr. tardías (L) cápside (IHQ) 
Partículas virales (M.E.)  Transmisión….
Hematoxilina-Eosina.
Displasia
Hematoxilina-Eosina.
Carcinoma epidermoide
High grade lesions. Pap
smear
p16
FASES DE LA TÉCNICA
MOLECULAR VPH




Extracción del ADN
Amplificación del ADN (PCR)
Detección del virus VPH
En los casos positivos: Tipificación del
VPH
Toma cervico-vaginal para
estudio ADN





Abstinencia sexual de 72 horas
No exámenes digitales, colposcopia, lavados,
medicación local ni estudios transvaginales previos.
Se aconseja realizarla 6 días anteriores y/o
posteriores a la menstruación.
Si se han efectuado tomas de biopsia y/o terapias
locales, esperar 30 días.
Tras tratamientos (crioterapia, Leep, conización a
bisturí) se recomienda esperar 60 días.
1. Extracción de ADN
Citología líquida
Digene Cervical Sampler
Cytyc PreservCyt
RECEPCIÓN DE
MUESTRAS


Torundas de
alginato o algodón
o envases de
citología líquida
Congelador para:
– Almacenar muestras
hasta su
procesamiento
Extracción
Extracción de ADN (I)


Digestión proteinasa K: Calor (termoblock): 56º
Torundas: 15 minutos; Biopsias: Noche
Centrífuga en algunos pasos
Extracción ADN (y II)

Biorrobot QIAGEN EZ1
(1/2 hora)
2. Amplificación del
ADN
PCR
Reacción en Cadena de la
Polimerasa: amplificar ADN
Amplificación del ADN

Termociclador: 45 ciclos de 94º, 55º y 72º
(6 horas)
PCR
PCR
Ciclos de
PCR
Desnaturalizació
n
94º C
Hibridación
55º C
Síntesis
74º C
Desnaturalización
94º C
Hibridación
55º C
Síntesis
74º C
3. Detección y tipificación del
virus de papiloma humano
3.a. Lectura
(Lo que antes
hacíamos)

Antes: Electroforesis en gel de
agarosa teñido con bromuro
de etidio
(calidad y
cantidad de
ADN)
Amplificación de HPV tipo 16. Amplicones de 217 bp en líneas 3, 4, 8 y 9.
La línea 1 es un control negativo (ADN de placenta). La línea 2 es un control positivo.
Kits
Detección del VPH: Antes
usábamos geles




Realizar gel de agarosa (1
hora)
Bromuro de etidio como
marcador fluroescente
Microondas, Cubeta de
electroforesis
Añadir solución de carga
y conectar corriente e. (2
horas)
Detección de VPH:
Interpretación
Identificación del VPH:
Tipado
Tipado del VPH
Identificación del VPH:
Tipado
Otra técnica diferente: La
captura de híbridos

Desnaturalizar

Hibridar

Capturar

Detectar

Leer
3.b. Lo que ahora hacemos:
Automatización mediante
arrays de baja densidad

Clinical Arrays® (Genómica S.A.U.):
120 pocillos con secuencias de ADN específicas
Lectura automatizada

Caso negativo

VPH 16 positivo
CLART HPV-2 (array strips)
70
71
72
73
81
82
83
84
85
6
11
51
53
54
56
58
59
61
62
66
68
18
26
31
33
35
39
40
42
43
44
45
81
82
83
84
6
11
89
CI
DNA
6
11
16
54
56
58
59
61
62
66
68
70
71
72
73
31
33
35
39
40
42
43
44
45
51
52
53
82
83
84
85
89
CI
DNA
6
11
16
18
26
56
58
59
61
62
66
68
70
71
72
73
81
39
40
42
6
11
44
45
51
52
53
54
35
DNA
6
11
16
18
26
31
33
52
CI
R
Leyenda:
• R, marcas de posición del Array de ADN
CI, control interno para la reacción de PCR
ADN, control de calidad de ADN de la muestra
R
R
Lectura automatizada

VPH 16
Importancia de la
determinación del VPH
Ejemplos de aplicación de
PCR
HPV L1 Virus-Like Particle
(VLP) Vaccine Synthesis
Empty viral
capsids
L1
gene
on
HPV
DNA
Elicits
humoral
Yeast/BCV
DNA
L1 gene
inserted into
genome of
yeast or BCV
Transcriptio
n
Capsid
proteins
immune
response
in host
mRN
tRNAA
Translati
rRN
on
A
VLP = Virus-like peptide
Yeast Cell (or Baculovirus
Expression System)
Conclusiones

–
–
–
–

El potencial clínico de la detección del ADN-VPH
en el presente contribuye:
Una mejor evaluación diagnóstica morfológica citocolpo-histológica.
Detección de tipos virales oncogénicos en pacientes con
citologías anormales y/o imágenes colposcópicas no
concluyentes.
Manejo y control posterapéutico de las lesiones
intraepiteliales. Provee un método de control de calidad para los
exámenes cito-colpo-histológicos.
La detección del ADN-VPH puede utilizarse como
método de cribado como complemento del
Papanicolaou.