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AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DE BACTERIAS FOTÓTROFAS DE LA
FAMILIA Rhodospirillaceae A PARTIR DE MUESTRAS DE AGUA OBTENIDAS
DEL GOLFO DE MÉXICO
V. Pacheco-Gonzáleza, J. García-Menab, M.T. Núñez-Cardonaa
Laboratorio de Ecología Microbiana, Departamento El Hombre y su Ambiente.
Universidad Autónoma Metropolitana – Xochimilco. Calzada del Hueso 1100, Colonia
Villa Quietud, C. P. 04960. [email protected]
b
Departamento de Genética y Biología Molecular, CINVESTAV – IPN Unidad
Zacatenco, Av. IPN 2508, México D. F. 07360. [email protected]
a
RESUMEN
En el ambiente marino como en todo sistema acuático, los microorganismos llevan a cabo un sinnúmero de
transformaciones esenciales para la continuidad de la vida marina. Entre éstos se encuentran las bacterias
fotótrofas, que al igual que en otros sistemas acuáticos, inciden especialmente en los ciclos del carbono, el
azufre y nitrógeno. Estas bacterias han sido poco estudiadas en México, es por ello que el objetivo de este
trabajo de investigación es contribuir al conocimiento de este grupo ancestral de microorganismos. Para ello,
se colectó muestras de agua del Golfo de México y se inoculó medios de cultivo líquidos específicos para el
crecimiento de la familia Rhodospirillaceae. Actualmente se cuenta con 13 cultivos puros y las observaciones
al microscopio óptico y las fotografías obtenidas muestran que sus células presentan diferencias pequeñas en
su tamaño, todas son bacilos y forman agregados de más de cinco células. El análisis in vivo de sus pigmentos
revelan que todas presentan bacterioclorofila a y pigmentos accesorios de la serie normal de la
espiriloxantina. Así mismo, se está realizando la tipificación molecular de las cepas, secuenciando su 16S
rDNA con el propósito final de identificar las cepas aisladas.
INTRODUCCIÓN
Las bacterias que pueden utilizar la luz como fuente de energía, constituyen un grupo amplio y heterogéneo
de microorganismos que principalmente se agrupan porque poseen uno o más pigmentos (bacterioclorofilas y
carotenoides) y son capaces de llevar a cabo la formación de ATP mediada por la luz en un proceso conocido
como fotofosforilación. Existen dos grupos principales, uno integrado por las bacterias rojas y verdes
(sulfurosas y no sulfurosas), y otro conformado por las cianobacterias. La principal distinción entre ambas se
basa en los fotopigmentos y en el conjunto del proceso fotosintético que realizan. Las bacterias rojas y verdes
son fotótrofos anoxigénicos, mientras que las cianobacterias son fotótrofos oxigénicos 5. Las tres familias que
comprenden a las bacterias rojas anoxigénicas, la Ectothiorodospiraceae y Chromatiaceae (bacterias rojas del
azufre) y la Rhodosphirillaceae (Rojas no sulfurosas) 1, 3, 8, 5 se encuentran ampliamente distribuidas en la
naturaleza, en especial en ambientes acuáticos8.
La diversidad de la familia Rhodospirillaceae se refleja en su morfología, la estructura de su membrana
interna, la composición de sus carotenoides y la bacterioclorofila a o b como únicos pigmentos fotosintéticos.
Requieren de una o más vitaminas para su crecimiento y generalmente son la tiamina, biotina, niacina y ácido
p-benzóico1, 2, 8. La coloración de sus cultivos es típica, adquiriendo tonalidades que van desde el verde,
verde-amarillo, café-amarillo, café, café-rojizo, rojo o violeta-púrpura y su morfología celular puede ser de
bacilos, cocos o espirales, relativamente pequeños, con movilidad mediante flagelos polares o perítricos y en
ocasiones con vacuolas con gas8.
Los cultivos de estas bacterias son usados como alimento para organismos pequeños tanto acuáticos como
terrestres y aportan materiales de excreción que son útiles para otros organismos incluyendo bacterias
heterótrofas y algas4.
El objetivo de este trabajo es aislar y caracterizar cepas de la familia Rhodospirillaceae considerando sus
propiedades morfológicas celulares y pigmentarias, así como identificar a las cepas aisladas mediante la
secuenciación de su 16S rDNA y de esta forma contribuir al conocimiento de este grupo de microorganismos
que habitan ambientes acuáticos mexicanos.
METODOLOGÍA
Para realizar este estudio se utilizó muestras de agua de diferentes puntos del Golfo de México colectadas
durante la campaña oceanográfica PROMEBIO como parte de los proyectos de investigación “Procesos
Oceánicos y Mecanismos Biológicos de Producción del Sur del Golfo de México” y “Estudios
Hidrobiológicos en la región de Tuxpan-Tampamachoco, Veracruz y el Golfo de México. Producción
Planctónica” los cuales están bajo la responsabilidad del Dr. David Salas de León (ICMyL) y de la Dra.
Martha Signoret Poillon (UAM-Xochimilco), respectivamente.
Para colectar las muestras de agua se utilizó botellas muestreadoras Niskin de 5.0 litros de capacidad
colocadas en una rosette, la cual está equipada con un CTD, el cual registra in situ la temperatura,
conductividad y profundidad.
Con las muestras de agua colectadas, se inoculó tubos de ensaye conteniendo medio de cultivo específico para
la familia Rhodospirillaceae cuya composición y preparación es la siguiente: por cada 1000 ml de agua
destilada se agrega 1.0 g de succinato de sodio, 0.5 g de KH 2PO4, 3.0 g de MgSO4 • 7H2O, 0.4 g de NH4Cl,
0.05 g de CaCl2 • 2H2O y 20 g de NaCl. Este medio de cultivo base se esteriliza por autoclave durante 20
minutos a 15 lb de presión y a 121 °C. Una vez frío se adiciona 1.0 ml de cloruro férrico, 0.2 ml de vitamina
B12, 1.0 ml de solución de elementos traza y 10.0 ml de una mezcla de acetatos de sodio y magnesio
previamente esterilizada (van Niel, 1971 modificado por Núñez-Cardona, comunicación personal).
Para el aislamiento y la obtención de cultivos puros se utilizó la técnica del agar semisólido propuesta por van
Niel (1971) y modificada por Pfennig y Trüper (1981)6 la cual se describe en los párrafos siguientes:
Se coloca 6.0 ml del medio enriquecido a tubos de ensaye conteniendo 3.0 ml de agar noble al 3%. A cada
tubo se le adiciona 1.0 ml de muestra, una vez inoculado, y solidificado se agrega 3.0 ml de una mezcla de
parafina con aceite de parafina (preparada a una proporción 1:1 y esterilizada por autoclave a 121 °C durante
20 minutos). Finalmente, los tubos inoculados se incuban a temperatura ambiente (20-28 °C) y se exponen a
la luz colocando un foco de luz incandescente de 40 W a 20 cm de distancia hasta que se observa el
crecimiento de las colonias pigmentadas.
Una vez que se hace evidente el crecimiento de las colonias (15–20 días de incubación), se procede al
aislamiento a partir de los cultivos en donde se observa las colonias más separadas. Para ello, se retira la capa
de parafina con una espátula de aluminio (previamente esterilizada con alcohol y la flama del mechero). Las
colonias que se encuentran más separadas y con mayor crecimiento se succionan con una pipeta Pasteur
estéril, todo este procedimiento se realiza en una campana de flujo laminar 6. Las colonias seleccionadas se
resuspenden en viales de vidrio de 5.0 ml de capacidad con rosca y tapón de baquelita, los cuales deben
contener medio de cultivo con la composición antes descrita.
Para hacer los registros de la morfología celular de las cepas bacterianas se utilizó portaobjetos con una capa
de agar bacteriológico esparcido sobre la superficie y colocando una gota del cultivo. Estas preparaciones se
observaron inmediatamente al microscopio de contraste de fases con el objetivo 100X.
Los pigmentos fotosintéticos de las cepas aisladas se analizaron in vivo7, para ello se centrifugó 10.0 ml de
cultivo a 5,000 rpm durante 20 minutos y las células concentradas se resuspendieron en 5.0 ml de medio de
cultivo. las lecturas se hicieron orientando la parte opaca de la celda hacia la zona más cercana al fotodetector
del espectrofotómetro (Shimadzu UV1601) utilizando como blanco medio de cultivo base.
Para la secuenciación de su 16S rDNA de las cepas se realizó la extracción de sus ácidos nucléicos, para lo
cual se centrifugó un volumen de 5.0 ml de cultivo líquido a 6000 rpm durante 30 segundos en un tubo
eppendorf de 1.5 ml. Se agregó 0.6 g de perlas de vidrio, 100 μl de SDS al 5 %, 400 μl de agua estéril y 500
μl de fenol. Se incubó durante 10 min. a 60 °C y se agitó durante 2 minutos en un agitador tipo vortex.
Posteriormente se agregó 250 μl de CHCl3 (cloroformo) y se centrifugó durante 15 min. a 12 000 rpm. Se
extrajo la fase acuosa (parte blanca) y se colocó en un tubo nuevo y se agregó 500 μl de fenol y 250 μl de
CHCl3, se agitó durante 2 min. en vortex y nuevamente se centrifugó durante 15 min. a 12 000 rpm (se repite
ésto último las veces que sea necesario hasta que la preparación se vea transparente, sin fenol). Se extrajo la
solución acuosa y se agregó 500 μl de CHCl3, se agitó en vortex durante 2 min. y se centrifugó a 12 000 rpm
durante 5 min. Se extrae nuevamente la fase acuosa (midiéndola con una micropipeta) y se agrega 1/10 del
volumen obtenido de CH3COONa (acetato de sodio) y el doble del volumen de etanol absoluto para la
precipitación de los ácidos nucléicos. Se centrifugó a 12 000 rpm durante 30 min. a 10°C. Se decantó la fase
acuosa a un tubo nuevo, el primero se dejó secar hasta que se evaporó el etanol y se agregó 500 μl de etanol al
70 % y se centrifugó a 12 000 rpm durante 30 min. a 10°C. Se decantó nuevamente en un tubo nuevo y el
primero se dejó secar sobre la mesa perfectamente limpia. Finalmente se resuspendió la pastilla en 50.0 μl de
agua estéril, se homogenizó hasta deshacer la pastilla y se verificó el resultado en un gel de agarosa al 0.5 %.
Para la amplificación del DNA se utilizó la técnica de PCR.
RESULTADOS PREELIMINARES
Se obtuvo 13 cultivos uniespecíficos a partir de la muestra de agua colectada a 100 metros de profundidad en
la estación 17 (zona del Cañón de Campeche)
Las observaciones al microscopio revelaron que todas las cepas aisladas presentan forma de bacilos con poca
diferencia en su tamaño (2-3μm) y su arreglo celular es de más de cinco células como las de
Rhodopseudomonas palustris una especie ampliamente distribuida en el ambiente marino.
El análisis in vivo de sus pigmentos muestran que todos las células poseen bacterioclorofila a lo cual se hizo
evidente por los máximos de absorción que presentaron a 375, 590, 806, 865 887 nm y en 6 cepas se observó
la presencia de pigmentos de la serie normal de la espiriloxantina (516, 512 y 486 nm), cinco a la del licopeno
y rodopin, finalmente dos a la del rodopinal (497 y 529 nm). En la tabla 1 se presenta los máximos de
absorción de los pigmentos analizados in vivo en los 13 aislamientos.
Tabla 1. Máximos de absorción de los pigmentos fotosintéticos de las cepas aisladas
y analizados in vivo
Cepa
Bacterioclorofila a
GM17-1
GM17-2
GM17-3
GM17-4
GM17-5
GM17-6
GM17-7
GM17-8
GM17-9
GM17-10
GM17-11
GM17-12
GM17-13
374, 590, 806, 876
379, 590, 804, 855
377, 589, 805, 883
376, 590, 806, 866
375, 589, 805, 885
378, 590, 806, 867
379, 589, 806, 881
379, 589, 806, 881
376, 589, 806, 877
379, 590, 806, 865
377, 589, 806, 883
379, 590, 806, 865
380, 590, 806, 867
Carotenos
492 (licopeno y rodopin)
487, 516, 551 (espiriloxantina)
488, 516 (espiriloxantina)
493 (licopeno y rodopin)
485, 516 (espiriloxantina)
492, 522 (licopeno y rodopin)
488, 516 (espiriloxantina)
488, 516 (espiriloxantina)
488 (espiriloxantina)
493 (licopeno y rodopin)
486, 516 (espiriloxantina)
495 (rodopinal)
490 (licopeno y rodopin)
Actualmente se trabaja en el análisis molecular de las cepas, se extrajo el ADN de cada una de ellas y se
amplificó mediante la técnica de PCR, los productos obtenidos se purificaron por electroelución, utilizando
Escherichia coli como vector de clonación, obteniendo 2 clonas de cada cepa para su posterior secuenciación
e identificación. En la figura 1 se presenta un gel de agarosa obtenido a partir de la extracción del DNA de las
13 cepas aisladas.
a
CONCLUSIONES
Con la técnica de enriquecimiento utilizada para obtener cultivos de la familia Rhodospirillaceae se ha podido
evidenciar su presencia en un ambiente en el que teóricamente no es propicio para el crecimiento de este tipo
de organismos.
Los resultados de las propiedades pigmentarias muestran que al menos se cuenta con tres especies diferentes
de miembros de la familia Rhodospirillaceae lo cual se ratificará mediante la secuenciación de su 16S rDNA.
AGRADECIMIENTOS:
Al Instituto de Ciencias del Mar y Limnología (ICMyL) de la UNAM y al Consejo Nacional de Ciencia y
Tecnología (CONACyT).
BIBLIOGRAFÍA
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8. N. Pfennig & H. G. Trüper, “Anoxygenic phototrophic bacteria”, in Bergey´s Manual of Systematic
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