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AISLAMIENTO Y ESTUDIO DE LAS BACTERIAS FOTÓTROFAS DE LA
FAMILIA CHROMATIACEAE QUE HABITAN EL GOLFO DE MÉXICO
M. G. Santamaría-Olmedoa, J. García-Mena b y M. T. Núñez-Cardona a
Laboratorio de Ecología Microbiana, Departamento El Hombre y su Ambiente.
Universidad Autónoma Metropolitana-Xochimilco, Calzada del Hueso 1100, Colonia
Villa Quietud, C. P. 04960. [email protected]
b Departamento Genética y Biología Molecular, CINVESTAV-IPN Unidad Zacatenco,
Av. IPN 2508, C. P. 07360, México D. F. [email protected]
a
RESUMEN
Las bacterias rojas del azufre de la familia Chromatiaceae por lo general habitan zonas anaeróbicas con
exposición a la luz. Son productores primarios y participan en los ciclos del azufre, el carbono, el nitrógeno
así como en las tramas tróficas al servir de alimento para numerosos invertebrados que habitan los sistemas
acuáticos. Estos microorganismos se han estudiado ampliamente en lagos y lagunas, sin embargo, poco se
conoce sobre su estructura y función en las zonas oceánicas. Actualmente el uso de técnicas moleculares
empleadas para su detección e identificación en muestras de ambientes naturales sin aislarlas, ha minimizado
la necesidad de contar con medios de cultivos que permitan aislar a estos microorganismos. Es por ello que el
objetivo de este trabajo es describir las técnicas utilizadas para el aislamiento y cultivo de las bacterias rojas
del azufre obtenidas a partir de muestras de agua colectadas en el Golfo de México, que incluyen un medio de
cultivo líquido enriquecido, la técnica del agar semisólido, la utilizada para el análisis de sus pigmentos
fotosintéticos, además de la técnica aplicada para la extracción del DNA genómico y la amplificación del 16S
rDNA por PCR para el análisis tipo DGGE e identificación de las cepas aisladas por secuenciación y análisis
filogenético.
1. INTRODUCCIÓN
Las bacterias fotótrofas anoxigénicas son un grupo diverso de microorganismos, que habitan generalmente
zonas anaerobias de los sistemas acuáticos con exposición a la luz 4, 8, y debido a su capacidad fotosintética,
convierten a la energía luminosa en química. Dentro de este grupo de microorganismos están las familias
Chlorobiaceae (verdes sulfurosas, Rhodospirillaceae (rojas no sulfurosas), Ectothiorhodospiraceae y
Chromatiaceae (ambas rojas sulfurosas).
El fotometabolismo de las bacterias rojas del azufre de la familia Chromatiaceae es estrictamente anaerobio
por lo que el oxígeno molecular no es un producto de la fotosíntesis, para realizar dicho proceso utilizan como
donador de electrones compuestos derivados del azufre como el Na 2S, S, tiosulfato, sulfuro, hidrógeno
molecular o compuestos orgánicos simples de peso molecular bajo 1,2, 3, 8.
Las formas celulares de las bacterias rojas del azufre de la familia Chromatiaceae pueden ser esféricas, en
espiral, bacilos o vibrioides; se desarrollan como células individuales o arreglos de más de dos células, y su
movimiento es por medio de flagelos, por deslizamiento o bien por vacuolas con gas 5, 4, 9.
A diferencia de los miembros de Ectothiorhodospiraceae, los de la Chromatiaceae acumulan azufre
intracelularmente 3, 11. La mayoría de sus componentes presentan bacterioclorofila a y en un número pequeño
de especies cuentan con bacterioclorifila b. Estos pigmentos fotosintéticos muestran máximos de absorción en
células in vivo entre 800-860 nm y 1000 nm respectivamente 3, 5, 7, 10, 12.
Los carotenoides que pueden presentar son de las series de la espiriloxantina, la okenona y el rodopinal13, los
cuales les sirven como protectores contra la fotooxidación y funcionan como pigmentos accesorios para la
fotosíntesis 1.
Actualmente existe un número pequeño de especies descritas, lo cual probablemente se debe a la dificultad
para su aislamiento, conservación y cultivo, además la aplicación de técnicas moleculares para su detección
en muestras naturales ha minimizado el interés por implementar técnicas que permitan contar con más fuentes
de referencia (cepas de colección), así como la riqueza específica de los miembros de esta familia.
En este trabajo se describe brevemente las técnicas empleadas para la detección, aislamiento y cultivo de las
bacterias rojas del azufre de la familia Chromatiaceae en muestras de agua colectadas del Golfo de México.
Dentro de las técnicas empleadas para el estudio de las bacterias fotótrofas esta el uso de un medio
enriquecido (detección), su aislamiento (agar semisólido), el análisis de sus pigmentos fotosintéticos (in vivo
y extraídos con solventes orgánicos) y mediante su material genético mediante la técnica de Biología
Molecular. En los párrafos siguientes se describen cada una de estas técnicas las cuales han sido empleadas
para aislar y estudiar a las bacterias plánticas del Golfo de México.
Cultivo enriquecido especifico para la familia Chromatiaceae. Este medio de cultivo se utiliza para el
crecimiento de las bacterias rojas del azufre, su preparación es la siguiente: 950 ml de agua destilada, 1.0 ml
de solución SL12, 1.0 g KH2PO4, 0.50 g NH4Cl2, 3.0 g MgSO4 . 7H2O, 0.05 g CaCl2 . 2 H2O, 20.0 g NaCl. Se
esteriliza por autoclave a 121° C, durante 15-20 minutos, luego se agrega 1.0 ml de una solución de Vitamina
B12 (2.0 mg/100ml), 30.0 ml solución de Bicarbonato de sodio (5%), 6.0 ml solución de Na 2S . 9 H2O (6%)
11
.
Solución SL12. La preparación de esta solución es la siguiente: 3.0 g Ethylenediamine-tetraacetate-di-Na-salt
(EDTA), 1.1 g FeSO4 . 7H2O, 300.0 mg H3BO3, 42.0 mg ZnCl2, 24.0 mg NiCl2 . 6H2O, 18.0 mg Na2MoO4 . 2
H2O, 2.0 mg CuCl2 . 2 H2O, 190.0 mg CoCl2 . 6 H2O, 50.0 mg MnCl2 . 4 H2O, 1000.0 ml Agua destilada 11.
Aislamiento de las cepas. Para ello se utilizó la técnica del agar semisólido para aislar y purificar las
colonias, se prepara de la siguiente forma, preparar agar bacteriológico al 3%, luego se coloca 3 ml de agar
noble en tubos de ensaye de 15.0 ml con tapones de algodón, se esteriliza por autoclave a 121° C, durante 1520 minutos, después se le agrega 6.0 ml de medio de cultivo enriquecido y 1.0 ml de muestra, se homogeniza
con un vortex, enseguida se realizan las dilución (10 -4). Una vez que se solidifica los cultivos, se agrega una
solución de parafina:aceite de parafina (1:1). Después de 15 a 20 días de incubación a temperatura ambiente y
un ciclo de iluminación (16h de luz y 8h de oscuridad), se procede al aislamiento de las colonias.
Análisis de pigmentos fotosintéticos. El análisis de los pigmentos fotosintéticos puede ser a partir de células
intactas (in vivo) o bien extraídos con solventes orgánicos (metanol y acetona:metanol, 7:2). Estas técnicas se
describen a continuación:
Análisis in vivo
Para el análisis in vivo se centrifuga 10.0 ml de cultivo masivo a 5,000 rpm durante 20 minutos. Las lecturas
se hacen después de resuspender las células concentradas en 5.0 ml de medio de cultivo (sin sulfuro de sodio).
Como blanco se utiliza medio de cultivo y se orienta la parte opaca de la celda hacia la zona más cercana al
fotodetector del espectrofotómetro9.
Análisis de los pigmentos extraídos con solventes orgánicos.
Los pigmentos son extraídos con solventes orgánicos, utilizando 10.0 ml de cultivo. El volumen se centrifuga
a 5, 000 rpm durante 20 minutos, eliminando el sobrenadante, agregar y agitar en 5.0 ml de disolvente
(acetona: metanol en proporción 7:2 ó metanol puro). Conservar los muestras 4° C durante 18 horas y en la
oscuridad. Después de transcurrido este tiempo, la muestra se centrifuga a 5,000 rpm durante 20 minutos,
evitando resuspender las células sedimentadas, y los registros se realizan con el sobrenadante. Como blanco
se utilizan los solventes utilizados para la extracción 9 y preferentemente mediante el uso de un
espectrofotómetro con luz ultravioleta (ejemplo: Shimadzu modelo UV160 A)
Extracción de DNA. Con 5.0 ml de muestras con crecimiento masivo, se empastilla los microorganismos por
centrifuga en tubos de polipropileno de 1.5 ml durante 30 segundos a una velocidad de 6,000 rpm.
Posteriormente se agregan: 0.6 g de perlas de vidrio, 100 μl de SDS al 5%, 400 μl de H 2O y 500 μl de Fenol;
homogenizar; incubar a 60° C durante 10 minutos; agregar 250 μl CHCl 3; centrifugar a 10° C durante 15
minutos; retirar la fase acuosa y agregar 500 μl de fenol y 250 μl CHCl 3; homogenizar; centrifugar durante 15
minutos (Se repiten los dos puntos anteriores hasta la fase acuosa tenga una apariencia transparente); agregar
500 μl de CHCl3; homogenizar; centrifugar durante 5 minutos; extraer la fase acuosa a otro tubo eppendorf y
agregar 1/10 parte del volumen de la fase de 2.7 M de CH3 COONa para ajustar sales y el doble del volumen
de la fase de Etanol absoluto (100%); centrifugar a 10° C durante 30 minutos a > 12,000 rpm; se retira el
sobrenadante y se agregan 500 μl de Etanol al 70%; centrifugar durante 30 minutos a > 12,000 rpm; se retira el
Etanol y se deja secar la pastilla. Resuspender la pastilla en 50 μl de agua desionizada. Esta extracción se
conserva a -20°C. .
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