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ENZIMOLOGÍA VEGETAL
Enzimología vegetal. Problemas propios del manejo de las enzimas vegetales. Cinética
enzimática utilizando los principios del cuasi-equilibrio o equilibrio rápido. Regulación del
metabolismo en la célula vegetal.
Las enzimas son sustancias que poseen una extraordinaria capacidad catalítica (1), tienen
un alto grado de especificidad por sus sustratos (2), aceleran reacciones químicas
específicas (3) y funcionan en soluciones acuosas bajo condiciones suaves de temperatura y
pH (4). Las enzimas, actuando en secuencias organizadas, catalizan los cientos de
reacciones que ocurren en una vía metabólica mediante la cual un nutriente es degradado o
biosintetizado asegurando la supervivencia y proliferación celular. Algunas de las enzimas
son reguladoras, esto es, que pueden responder a varias señales metabólicas cambiando de
acuerdo a éstas su actividad catalítica. A través de la acción de las enzimas reguladoras, los
sistemas enzimáticos están altamente coordinados para formar un conjunto armónico entre
las diferentes actividades metabólicas y de esta manera sostener la vida.
PRINCIPALES CARACTERÍSTICAS DE LAS ENZIMAS
Las enzimas, son proteínas con excepción de un pequeño grupo de moléculas de ARN que
también poseen actividad catalítica (ribosimas). En el caso de tratarse de proteínas su
actividad catalítica depende de la integridad de la conformación nativa, es decir, de las
estructuras primaria, secundaria, terciaria y cuaternaria (Esquema 1).
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Estructura primaria
Estructura secundaria (tipo hélice)
Estructura secundaria (hoja β)
Estructura terciaria
Estructura cuaternaria
Esquema 1: Estructura de las proteinas
La estructura tridimensional de una proteína prové una discriminación precisa en el
reconocimiento de los ligandos -la molécula que interactúa con la proteína-. Una molécula
de proteína está compuesta de varios dominios de masas moleculares de alrededor de 104
daltons. El sitio activo de una enzima- que es la región donde el sustrato se liga y la
reacción catalítica ocurre- está localizado en la interfase entre dos dominios.
Si la enzima es desnaturalizada o disociada en sus subunidades, en general, la actividad
catalítica se pierde. Por otra parte, las enzimas, al igual que otras proteínas, tienen un peso
molecular que oscila desde aproximadamente 12.000 hasta más de 1.000.000. Algunas
requieren cofactores que pueden ser uno o más iones metálicos como por ejemplo Fe2+,
Mg2+, Mn2+,Zn2+ o bien una molécula orgánica o metaloorgánica llamada coenzima. A
veces ambos, es decir, una coenzima y uno o más iones metálicos para su actividad. Una
molécula de enzima catalíticamente activa con su coenzima y/o iones metálicos se llama
holoenzima. La proteína de esa enzima se llama apoenzima o apoproteína. La coenzima
funciona como un transportador transitorio de grupos funcionales específicos.
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Tabla 1: Elementos inorgánicos (cofactores) necesarios para la actividad enzimática.
Iones
Enzimas
Fe2+ o Fe3+
Citocromo oxidasa
Catalasa
Peroxidasa
Cu2+
Citocromo oxidasa
K+
Piruvato quinasa
Mg2+
Hexoquinasa
Glucosa-6-fosfatasa
Piruvato quinasa
Tabla 2: Transportadores transitorios de grupos de átomos o grupos funcionales
(coenzimas).
Coenzima
Pirofosfato de tiamina
Grupo Transferido
Aldehído
Coenzima A
Grupo acilo
Piridoxal fosfato
Grupo amino
Flavina adenina dinucleótido
Electrones
Nicotinamida adenina dinucleótido
Ión hidruro (:H-)
CLASIFICACIÓN DE LAS ENZIMAS
Con el objeto de sistematizar el estudio de las enzimas, las mismas fueron clasificadas por
el tipo de reacción que catalizan en 6 grupos. Cada uno de esos grupos tiene subclases
basadas en el tipo de reacción que catalizan. A cada enzima se le ha dado un número de
clasificación de cuatro dígitos y un nombre sistemático que identifica la reacción catalizada
y un nombre trivial. Se las denomina con el sufijo asa añadido al nombre de su sustrato o
con una palabra o frase que describe su actividad.
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•
Nomenclatura:
-
Número clasificatorio de 4 dígitos (E.C.)
-
Nombre sistemático
-
Nombre trivial
ATP + D-Glucosa
ADP + D-Glucosa-fosfato
Número clasificatorio: E.C. 2.7.1.1.
2. Clase: Transferasa
7. Subclase: Fosfotransferasa
1. Fosfotransferasas con OH como aceptor
1. D-glucosa como aceptor del fosfato
Nombre sistemático: ATP:glucosa fosfotransferasa
Nombre trivial: hexoquinasa
Por acuerdo internacional se las ha clasificado en 6 clases principales.
Nro
Clase
Grupo.
Tipo de reacción catalizada
1
Oxidorreductasas
Transferencia de electrones
2
Transferasas
Reac. de transferencia de grupos
3
Hidrolasas
Reac. de hidrólisis
funcionales al agua)
4
Liasas
Adición de grupos a enlaces dobles o formación de
enlaces dobles por eliminación de grupos.
5
Isomerasas
Transferencia de grupos dentro de una molécula para
dar formas isoméricas.
6
Ligasas
Formación de uniones C-C, C-S, C-O y C-N por
reacciones de condensación acopladas a la ruptura de
ATP
(transferencia
de
grupos
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PRINCIPALES PROBLEMAS EN EL MANEJO
(EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DE ENZIMAS)
DE
LAS
ENZIMAS
El primer paso en la obtención de una enzima es la degradación del órgano, tejido o células
que la contienen. Para ello el órgano o tejido vegetal es desintegrado en licuadora, molido,
o exprimido en juguera. Estos procesos deben ser efectuados siempre en frio
(corrientemente entre 0-4°C), pero pueden hacerse a temperaturas inferiores como en el
caso del molido del material vegetal verde que suele llevarse a cabo en morteros enfriados a
-20 °C o en presencia de N2 líquido. Cuando se homogeneiza un tejido fresco es necesario
utilizar una cierta cantidad de líquido. Este líquido o medio de homogeneización debe tener
una composición adecuada para proteger la enzima que queremos extraer de posibles
desnaturalizaciones.
Así, si una enzima es sensible a los metales pesados podemos agregar un quelante (por ej.
EDTA) al medio de homogeneización, evitando pérdidas de actividad por éste tipo de
factor. Igualmente si la enzima es sensible a la oxidación, el medio de homogeneización
puede llevar agentes reductores tales como la cisteína, mercaptoetanol u otros compuestos
antioxidantes. Por lo general los tejidos vegetales tienen elevados niveles de enzimas
proteolíticas y de compuestos fenólicos, por ello en el medio de extracción se agregan
inhibidores de proteasas o sustancias que precipitan los polifenoles como la
polivinilpolipirrolinona (PVPP). Además se buscará un buffer cuya composición, pH y
concentración (fuerza iónica) mantenga lo mejor posible los niveles de la actividad
enzimática en estudio. Por otra parte, deberán controlarse otros factores tales como la
temperatura, ya que las proteínas son, generalmente, termolábiles y sin este control
podríamos inactivar la enzima a extraer, o bien obtener rendimientos muy bajos que no
reflejen los niveles de la actividad “in vivo”. En vegetales, generalmente se trabaja entre 04°C y a pH 7-7,5, ya que a este pH se consiguen mejores extracciones de proteínas. Una
vez extraída la enzima debemos contar con una forma de cuantificarla. Como, en general, la
única propiedad característica que le conocemos es su actividad sobre un cierto sustrato al
que convierte en uno o más productos, utilizamos esta característica para detectar y medir
la enzima. Es, sin embargo necesario, que antes de proceder a medir la enzima se eliminen
moléculas pequeñas que pudieran estar presentes en el preparado. Ello puede realizarse por
varios métodos, pero uno de los más utilizados es la diálisis o ultrafiltración a través de
membranas de diferente tamaño de poro.
De acuerdo a lo expresado la enzima va a ser detectada a través de la reacción que cataliza,
por espectrofotometría o por otro método que resultare conveniente, la desaparición de
sustrato o la aparición de productos.
PURIFICACIÓN ENZIMATICA
El homogenato obtenido contiene todos los metabolitos solubles de la célula así como una
gran cantidad de enzimas diferentes. Esta mezcla impide estudiar algunas características de
las enzimas y, además, puede modificar el comportamiento de muchas de ellas. Por esto es
que en la mayoría de los casos se procura purificar las enzimas, esto es, separarlas de la
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compleja mezcla de proteínas, lípidos, azúcares y otras sustancias que se encuentran en el
homogenato.
Existen numerosas técnicas basadas en las propiedades de las distintas proteínas que
pueden aplicarse para la purificación de enzimas. Entre las técnicas aplicadas
mencionaremos:
1- Los métodos basados en la solubilidad de las proteínas, a saber: precipitación con
sales, precipitación con solventes, etc.
2- Métodos basado en fenómenos de adsorción: los adsorbentes empleados pueden ser,
entre otros: gel de fosfato de calcio, alúmina, hidroxiloapatita, etc. Estos métodos
pueden aplicarse directamente sobre la solución de la enzima o bien aplicando la
solución de enzima a estos materiales colocados en columnas. En este último caso
los adsorbentes son preparados de modo que sean retenidos por las columnas:
cromatografía de adsorción.
3- Métodos basados en las cargas de las proteínas: cromatografía de intercambio
iónico, electroforesis de poliacrilamida con y sin dodecilsulfato de sodio.
4- Métodos basados en el tamaño de las proteínas: diversos tipos de filtración por gel
(métodos de exclusión molecular) o electroforesis preparativa.
5- Métodos basados en la especificidad de las enzimas: cromatografía de afinidad.
6- Métodos basados en el puntos isoeléctrico: isoelectroenfoque, cromatoenfoque.
7- Métodos mixtos: cromatografía de intercambio iónico (catiónico o aniónico),
electroforesis en geles de poliacrilamida u otro soporte, etc.
Cuando se intenta purificar una enzima por primera vez no hay regla sobre el método a
utilizar ni sobre la secuencia de métodos necesarios para lograr la purificación. Hay que
decidir qué métodos se aplicarán de acuerdo con las posibilidades del laboratorio. Se
ensaya el método elegido y se lo incorpora al protocolo de purificación en elaboración o se
lo desecha según los resultados que se obtengan. Es casi imposible que un único método
sea suficiente para logar una purificación elevada de una proteína. La única regla general
aplicable a las purificaciones es la utilización de métodos suaves que no alteren las
estructuras de las enzimas y protocolos de purificación cortos (Tabla 3).
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Tabla 3: Principales tipos de cromatografía
Fase móvil
Líquida
Fase
estacionaria
Líquida
Clase
Sólida
Adsorción
Reparto
Tipo
(propiedad)
Tamaño
Nombre
Ejemplo
Exclusión
Interacciones
electrostática
Intercambio
iónico
Filtración por
gel
Intercambio
aniónico
Intercambio
catiónico
Interacción
hidrofóbica
Afinidad
Hidrofobicidad Interacción
hidrofóbica
Interacciones
Afinidad
por
afinidad
biológica
Interacciones
Adsorción
inespecíficas
Hidroxilapatita
Cromatografía de filtración en gel
La cromatografía de filtración en gel se realiza empleando unas matrices formadas
por unas esferas porosas. El volumen de los poros es muy elevado y su diámetro está
determinado. Cuando penetran en el lecho de la columna dos proteínas de tamaños tales
que una penetra en los poros de las esferas de gel y la otra no, la primera se reparte entre el
espacio entre las esferas y el interior de los poros, reduciéndose la concentración en la fase
libre entre las esferas. La segunda proteína, por su tamaño, sólo puede encontrarse entre las
esferas. El flujo de solvente es más elevado entre las esferas que en el interior de los poros
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de éstas, por lo que el efecto neto es el de acelerar el desplazamiento de las proteínas de
mayor peso molecular respecto a las de menor peso molecular. En esta cromatografía se
eluyen primero las proteínas mayores, y en segundo lugar las menores, y tiene una gran
influencia en el resultado la longitud de la columna y el volumen de la misma. Columnas
largas aseguran separaciones de mayor calidad. La filtración por gel se emplea para
determinar el peso molecular de proteínas desconocidas mediante el uso de patrones de
peso molecular de proteínas conocidas.
Cromatografía de intercambio iónico
La cromatografía de intercambio iónico se realiza sobre matrices que tienen una carga neta,
positiva o negativa. La carga de la matriz de la columna así como la carga de las proteínas
dependerá del pH del solvente y de su fuerza iónica (proporcional a la concentración de
iones). En unas condiciones determinadas serán retenidas en la columna las proteínas que
tengan una carga complementaria a la de la matriz del gel (las proteínas cargadas
negativamente serán retenidas por una matriz cargada positivamente), siendo eluidas las
restantes. Para eluir las proteínas retenidas se pueden variar la carga iónica del solvente o su
pH de forma que se alcance el punto isoeléctrico de la proteína de interés o el de la matriz,
neutralizando de este modo la fuerza que retiene a las proteínas en la columna
Cromatografía de afinidad y de inmunoafinidad
En la cromatografía de afinidad las esferas de gel que conforman el lecho de la
columna presentan unido en su superficie un ligando, una molécula ante la que tiene
afinidad una o más de las proteínas presentes en la mezcla a separar. Al atravesar la
columna el ligando secuestra sobre la superficie de las esferas de gel la proteína afín, y deja
pasar el resto. La elución de la proteína afín se puede conseguir modificando las
propiedades de carga del ligando (variando el pH hasta alcanzar su punto isoléctrico,
variando la fuerza iónica del solvente, etc.) con lo que se reduce la intensidad de la
interacción hasta anularla.
La naturaleza del ligando es muy variada, puede ser un receptor (proteína) unido a
las esferas, que seleccionará su/s ligando/s de una mezcla compleja, o un antígeno (usado
en una inmunización) que recubre las esferas y que retendrá aquellos anticuerpos que lo
reconocen (anticuerpos purificados por afinidad), o en el caso concreto de la
inmunoafinidad el ligando que recubre las esferas son anticuerpos que retienen en la
columna a aquellas proteínas que contienen los epitopes que reconocen.
En ocasiones la cromatografía de afinidad se realiza incubando el gel recubierto con
el ligando directamente con la solución que contiene las proteínas a purificar.
Posteriormente se empaqueta la columna y se procede a la elución, primero de las proteínas
no unidas y posteriormente de las retenidas (eluido específico).
Expresión de los resultados de la purificación:
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Luego de cada paso de purificación de una enzima es necesario expresar los resultados de
esa purificación en forma tabulada. La tabla debería contener los siguientes datos
agrupados en columnas:
Procedimiento
Vol.
Actividad
Unidades
Proteína
Actividad
Rendimiento
(ml)
(Unid./ml)
Totales
(mg/ml)
Específica
%
Grado
de
Purificación
Unidades de enzima:
Se define una unidad internacional de enzima (UI) como la cantidad de la enzima que
cataliza la transformación de 1 µmol de sustrato por minuto bajo condiciones definidas de
medida (temperatura, pH, concentración de sustrato o sustratos y cofactores).
Si se logra obtener una enzima pura y se conoce su peso molecular se puede definir la
actividad molecular o molar, o número de recambio como el número de moléculas de
sustrato transformados por minuto y por molécula de enzima en condiciones en que se mida
la velocidad máxima de la enzima.
Actualmente la Unión Internacional de Bioquímica recomienda el uso del Katal (Kat) que
se define como la cantidad de enzima que transforma 1 mol de sustrato en producto en 1
segundo. Así:
1 Katal= 6 x 107 UI
Actividad específica:
La actividad específica está dada por el cociente entre el número de unidades de enzima y
los mg de proteína del preparado. Esta unidad es muy usada en los estudios de purificación
enzimática.
Aplicaciones del concepto de actividad específica:
1- Permite calcular la purificación de una enzima.
2- Sirve para diferenciar dos enzimas o actividades contenidas en un mismo extracto.
PRINCIPIOS GENERALES DE LA ACCIÓN CATALÍTICA DE UNA ENZIMA
Las enzimas proveen un entorno específico llamado sitio activo en que está
energéticamente favorecida una determinada reacción. Es así como las enzimas pueden ser
modificadas dentro de ciertos límites sin que pierdan su actividad biológica. En algunos
casos se logró eliminar uno o más aminoácidos sin pérdida de actividad. También se han
efectuado digestiones enzimáticas parciales de algunas enzimas con los mismos resultados.
Esto nos indica que no toda la proteína enzimática participa en la catálisis sino que sólo
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parte de ella es la que intervienen en la unión (sitio de ligamiento del o de los sustratos) y
transformación de los sustratos (grupos catalíticos).
Una reacción enzimática simple puede escribirse:
E+S
ES
EP
E+P
donde: E: enzima libre
S: sustrato libre
ES: complejo enzima-sustrato
EP: complejo enzima-producto
P: producto
La función del catalizador biológico (E) es aumentar la velocidad de la reacción sin
afectar el equilibrio de la reacción. Para visualizar ambos conceptos estudiemos la
representación de la reacción anterior en un diagrama en que la variación de la energía libre
(ΔG) de la reacción se representa en función de la coordenada de reacción, es decir, del
curso de la reacción (Figura 1). En el equilibrio la energía libre del estado fundamental de P
es menor que de S, por tanto la reacción está favorecida (ΔG < 0). Como se puede apreciar
el equilibrio entre S y P no es afectado por el camino que haya seguido S para convertirse
en P, es decir, por cualquier intermediario que haya podido formar S con el catalizador.
Figura 1: Variación de la energía libre (ΔG) de la reacción en función de la coordenada de
reacción, es decir, del curso de la reacción
Existe una barrera energética entre S y P que representa la energía necesaria para el
alineamiento correcto de los grupos reaccionantes, la formación de intermediarios
transitorios, reordenamiento de enlaces y otras transformaciones necesarias para que la
reacción se produzca en uno otro sentido. Esto significa que la o las sustancia/s
reaccionantes adquieren una cierta energía (energía de activación) y pasan del estado
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fundamental a un estado de transición. Una vez en este nivel energético (estado activado) la
probabilidad de que el compuesto vuelva a S o se transforme en P es la misma.
La velocidad de la reacción es un reflejo de esta energía de activación pues cuanto mayor es
la barrera tanto menor será la velocidad de la reacción. Por tanto la función de los
catalizadores biológicos es disminuir esta barrera y de este modo aumentar la velocidad de
la reacción. Merece destacarse que si bien los catalizadores no afectan el equilibrio de la
reacción hacen que este equilibrio se alcance más rápido aumentando la velocidad de la
reacción.
En presencia de un catalizador la transformación de S en P, puede describirse mediante la
formación de varios intermediarios de transición. El paso que incluye la formación de uno
de tales intermediarios con mayor energía de activación será el limitante de la velocidad de
la reacción.
La relación entre la variación de energía libre (ΔGo´) y la Keq de dicha reacción es:
ΔGo´= - RT ln K eq
lo que indica que la Keq está relacionada directamente con el ΔGo´ de la reacción. Por otra
parte, para la transformación de S
P la v = k [S] donde:
v= velocidad de la reacción
K= constante de la reacción
FACTORES QUE INFLUYEN EN LA VELOCIDAD DE LAS REACCIONES
ENZIMATICAS.
El estudio de los factores que tienen influencia sobre la actividad de las enzimas permite
una mejor comprensión de los mecanismos involucrados en el proceso catalítico.
La mejor metodología a emplear para el análisis del progreso de una reacción enzimática es
el estudio del efecto de la variación de uno de los factores que tienen influencia sobre la
misma mientras los demás se mantienen invariables. En la figura 2 se puede observar la
variación de la concentración de cada uno de los componentes de la reacción descripta más
arriba en el transcurso del tiempo.
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Figura 2: Variación de la concentración de cada uno de los componentes de la reacción en el
tiempo de reacción
A excepción de la fase inicial de la reacción, las pendientes de las curvas de progresión
para [E] y [ES] son esencialmente cero siempre que la [S] sea mucho mayor que la [E]
hasta que el S está prácticamente agotado. En consecuencia la velocidad de síntesis de ES
debe ser igual a la velocidad de descomposición de ES. En otras palabras ES se mantiene
en un estado estacionario y la [ES] puede tratarse como si se mantuviera constante.
Para evitar posibles perturbaciones en las determinaciones de las velocidades de las
reacciones es aconsejable hacer las mediciones en los primeros instantes de la reacción, es
decir, determinar velocidades iniciales en las que hay proporcionalidad directa entre la
cantidad de enzima utilizada, el tiempo y la cantidad de sustrato transformado y en la que
hay exceso de sustrato. Operando en esta zona y en presencia de gran exceso de sustrato la
reacción enzimática puede considerarse como una reacción de orden 0, es decir, que la
cantidad de producto formado por unidad de tiempo (velocidad de la reacción) es
independiente del tiempo. Estas son, también, las condiciones que deben emplearse para la
medición de unidades de enzima.
Los principales factores que afectan la velocidad inicial de una determinada reacción
son:
Temperatura, pH, concentración de enzima, concentración de sustrato y la presencia de
activadores o inhibidores
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Efecto de la temperatura:
Las reacciones enzimáticas suelen comportarse como reacciones químicas ordinarias ya que
su velocidad aumenta como consecuencia de un aumento de la temperatura. Sin embargo
con las enzimas se alcanza un punto en que todo nuevo aumento de la temperatura provoca
una disminución de la velocidad de la reacción (Figura 3). Esto se debe a que a
temperaturas relativamente altas las enzimas se desnaturalizan.
Figura 3: Efecto de la Temperatura sobre la velocidad de la reacción catalizada por enzimas.
Según la Figura 3 parecería existir una temperatura en que la actividad enzimática es
óptima. Sin embargo este óptimo no es constante ya que depende de una serie de factores
tales como la presencia de activadores, inhibidores, agentes desnaturalizantes, proteasas,
etc. presentes en el preparado.
En condiciones definidas (pH, fuerza iónica, concentración de sustrato) la velocidad de una
reacción enzimática varía con la temperatura debido a que la constante específica de la
velocidad es función de la temperatura. Arrhenius expresa una relación entre el logaritmo
de la constante K de velocidad y la temperatura absoluta T:
Log k= log C- Ea/2,3 R x 1/T
En donde: R=constante de los gases
Ea= energía de activación
C= constante
De donde se puede calcular Ea de la pendiente de la curva (Figura 4).
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La mayor parte de las reacciones enzimáticas siguen la ecuación de Arrhenius en la zona
fisiológica de temperaturas. La ecuación tiene la misma forma que la ecuación de Van´t
Hoff con la diferencia de que en este caso se utilizan constantes de velocidad en lugar de
constantes de equilibrio. Es asi como a una concentración constante de reaccionantes las
constantes de velocidad se pueden sustituir por velocidades ya que la velocidad es
proporcional a K. En la Figura 4 podemos estimar la Ea de la pendiente de la recta
Figura 4: A) Actividad enzimática a diferentes temperaturas de incubación. B) Gráfico de
velocidad en función de la inversa de la temperatura de reacción enzimática.
Efecto del pH sobre la actividad enzimática:
Los enzimas poseen grupos químicos ionizables (carboxilos -COOH; amino -NH2; tiol -SH;
imidazol, etc.) en las cadenas laterales de sus aminoácidos. Según el pH del medio, estos
grupos pueden tener carga eléctrica positiva, negativa o neutra. Como la conformación de
las proteínas depende, en parte, de sus cargas eléctricas, habrá un pH en el cual la
conformación será la más adecuada para la actividad catalítica. Este es el llamado pH
óptimo. La mayoría de los enzimas son muy sensibles a los cambios de pH. Desviaciones
de pocas décimas por encima o por debajo del pH óptimo pueden afectar drásticamente su
actividad. Así, la pepsina gástrica tiene un pH óptimo de 2, la glucosa 6-fosfatasa lo tiene a
pH 7,5 y la arginasa lo tiene a pH 10, Figura 5.
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Figura 5: Efecto del pH sobre la velocidad de una reacción enzimática.
Para eliminar efectos destructivos del pH sobre la enzima es necesario hacer una curva de
tiempo a cada pH, a fin de medir la velocidad inicial correspondiente. El efecto del pH
sobre las afinidades se elimina utilizando, concentraciones suficientemente altas de sustrato
como para mantener siempre saturada la enzima cualquiera sea el pH utilizado (Figura 6).
Para conocer cuál es la cantidad de sustrato necesaria es imprescindible obtener V M y KM a
cada pH.
Figura 6: Actividad enzimática a diferentes pH y en diferentes condiciones de concentración de
sustrato
Efecto de la concentración de enzima:
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Cuando representamos la velocidad de la reacción en función de la concentración de
enzima podemos obtener curvas como las ilustradas en la figura 7 en que a es la curva
normal, b es la curva obtenida en presencia de un inhibidor reversible y c es la curva
obtenida en presencia de un activador disociable.
Figura 7: Efecto de la concentración de enzima sobre la velocidad de la reacción enzimática
Efecto de la concentración de sustrato:
Ya vimos que para ocurra una reacción enzimática debe haber una interacción entre enzima
y el o los sustratos. En el caso más simple la reacción enzimática estará descripta por la
ecuación química en que un sustrato es transformado en un producto:
K1
k2
E+S
ES
k-1
E+P
k-2
en donde las constantes K son las constantes de velocidad.
La ecuación propuesta supone la formación del complejo enzima-sustrato (ES) y fue la base
que utilizó V. Henri en 1903 para explicar la catálisis enzimática. En fundamento de esta
idea fue la observación del efecto de la concentración de sustrato sobre la velocidad inicial
de una reacción enzimática.
Posteriormente, en 1913, L. Michaelis y M. Menten desarrollaron una teoría general en la
que postularon que la enzima se combina con el sustrato en forma reversible y rápida para
formar el complejo enzima-sustrato:
K1
E+S
ES
k-1
y que ese complejo luego dá origen a la formación de producto y liberación de la enzima en
un proceso más lento que el primero:
k2
ES
E+P
k-2
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por tanto la segunda reacción es la que determina la velocidad de la transformación.
Si se considera que sólo los componentes tempranos de la reacción están en equilibrio,
estas condiciones se conocen como suposición de cuasi-equilibrio o equilibrio rápido. Así
la ecuación anterior la podemos escribir:
K1
E+S
kcat
ES
E+P
k-1
donde kcat es la constante catalítica de velocidad y en las condiciones de cuasi-equilibrio
corresponde a K2.
La velocidad de la reacción está dada por:
V=kcat [ES] (ecuación 1)
en que [ES] representa al complejo enzima-sustrato y la velocidad máxima de la
reacción (VM) será:
VM = kcat [Et] (ecuación 2)
en donde [Et]= [ES] + [EL]
La velocidad de la reacción estará dada por la variación de la concentración del complejo
ES en función del tiempo que en el equilibrio es igual a cero, y podemos escribir:
k1 [EL] [S] = K-1 [ES] + kcat [ES]
y como [EL] = [ET] – [ES]
luego K1 ([ET] – [ES]) [S] = [ES] (k-1 + kcat)
resolviendo la ecuación para [ES] y agrupando:
[ES] = ([ET][S])/ [S]+ (k-1 + kcat)/k1 ecuación 3
dado que v= kcat [ES] (ecuación 1)
y reemplazando en la ecuación (1) podemos expresar la velocidad de la reacción
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v= kcat ([ET][S])/ [S]+ (k-1 + kcat)/k1
y como VM = Kcat [ET]
luego: v=Vmax[S])/ [S]+ (k-1 + kcat)/k1
El segundo término del denominador es una relación de constantes que se denomina
constante de Michaelis-Menten (Km)
Km = (k-1 + kcat)/k1
v= Vmax[S])/ [S]+ km
que es la expresión conocida como de Michaelis-Menten y que representa una ecuación de
velocidad de una reacción enzimática. En ella se relaciona la velocidad de la reacción con
la velocidad máxima que puede alcanzar la misma, la concentración de sustrato y una
constante (Figura 8).
Figura 8: Efecto de la concentración de sustrato sobre la velocidad de una reacción enzimática
Significado del KM: Si analizamos el gráfico anterior veremos que el K m es la
concentración de sustrato necesaria para alcanzar la mitad de la velocidad máxima. En
efecto, si tomamos una concentración de sustrato idéntica al valor del Km y reemplazamos
en la ecuación de Michaelis-Menten tenemos:
v= Vmax[S])/ [S]+ [S])= Vmax/2
Por otra parte cuando Km es mucho menor que la concentración de sustrato empleada se
alcanza la velocidad máxima de la reacción:
v= Vmax[S])/ [S]+ Km = Vmax
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y tenemos una reacción independiente de la concentración de S, la velocidad es de orden
cero. Se admite que este es el caso cuando se trabaja con concentraciones de sustrato del
orden de 10 veces el valor de Km. Esto es particularmente importante cuando se procura
valorar una enzima ya que sólo en estas condiciones estará trabajando la totalidad de la
misma.
A su vez cuando trabajamos con concentraciones muy bajas de sustrato:
v= (Vmax/ Km) [S]
Es decir que en estas condiciones la velocidad de la reacción enzimática es proporcional a
la concentración del sustrato, consideración de importancia cuando se desea analizar el
efecto de un metabolito mediante reacciones enzimáticas.
Debe recordarse que para la mayoría de las enzimas Kcat es del mismo orden de magnitud
que K-1, es decir, que en la mayoría de los casos no se cumplen las suposiciones de base de
la cinética de equilibrio rápido. En esos casos definimos la K m como:
Km = (k-1 + kcat)/k1
En donde queda expresado que en esas situaciones Km es una constante dinámica o de
equilibrio que expresa la relación entre las concentraciones reales del estado estacionario
más que las concentraciones de equilibrio.
Por el contrario cuando Kcat es la reacción que limita la velocidad del proceso global, es
decir que Kcat << K-1, entonces:
Km = k-1 /k1
que se define como la constante de disociación, Ks, del complejo ES
Ks= [E] [S]/ [ES]
Cuando se verifican estas condiciones Km representa una medida de la afinidad de la
enzima por su sustrato en el complejo [ES].
Importancia del Km:
1- La constante de Michaelis-Menten es un elemento de juicio importante para
caracterizar una enzima, por lo que siempre que se purifica una enzima se trata de
conocer este valor.
2- El Km indica la afinidad de la enzima por el sustrato. Si una enzima tiene un Km
muy bajo con un determinado sustrato, significa que se requiere esa pequeña
concentración de sustrato para lograr la saturación de la mitad de las moléculas de
enzima y, por lo tanto, alcanzar la mitad de la VM con esa cantidad de enzima.
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3- El Km indica cual es el sustrato preferido de una enzima cuya especificidad es
relativamente amplia.
4- Dando valores a los términos de la ecuación de Michaelis-Menten se puede conocer
la concentración de sustrato que se debe elegir para hacer el ensayo de una enzima
en condiciones de reacción de orden cero, o sea sin que influya la concentración de
sustrato.
5- El estudio de Km y de sus modificaciones frente a variaciones de medio de reacción
(pH, presencia de otro sustrato, del producto, de activadores o inhibidores) es un
elemento de juicio importante para interpretar el mecanismo de una reacción
enzimática.
Transformaciones lineales de la ecuación de Michaelis-Menten:
La determinación de Km y VM en diferentes condiciones experimentales es un elemento
importante para caracterizar una enzima y su posible mecanismo de trabajo. Con el fin de
realizar estas determinaciones con exactitud Lineweaver y Burk realizaron
transformaciones lineales de la ecuación de Michaelis-Menten y obtuvieron la ecuación:
1/v = 1/[S] x km/Vmax + 1/Vmax
Representando gráficamente 1/v= f (1/[S]) se obtiene una recta que proporciona
información importante respecto de los parámetros cinéticos de una reacción enzimática tal
como se puede observar en la Figura 9:
Figura 9: Efecto de la concentración de sustrato sobre la velocidad de una reacción enzimática.
Gráfico de dobles recíprocas de 1/v en función de 1/S
Efecto de inhibidores:
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Se define como inhibidores a cualquier sustancia capaz de reducir la velocidad de una
reacción enzimática. Los inhibidores enzimáticos se clasifican en dos grandes grupos:
reversibles e irreversibles de acuerdo a que la enzima recupere o no su actividad original
una vez eliminado el inhibidor. En el primer caso el inhibidor interactúa en forma
reversible con algún grupo esencial de la enzima formando un complejo enzima-inhibidor.
Se establece, entonces, un equilibrio entre este complejo y la enzima libre y el inhibidor
libre, equilibrio del mismo tipo que el observado para el complejo ES:
E+I
EI
Los inhibidores irreversibles, por otra parte, modifican o destruyen algunos grupos
esenciales para la actividad de la enzima.
Los grupos principales de inhibiciones reversibles son: competitiva, no-competitiva y
acompetitiva.
Inhibición competitiva:
Se puede esquematizar:
El inhibidor se combina reversiblemente con el sitio activo de la enzima, en el mismo lugar
donde se une el sustrato, impidiendo de esta manera el ligamiento de este último. Se
denomina competitiva porque tanto el inhibidor como el sustrato compiten por el mismo
sitio. Este tipo de inhibición puede ser analizada aplicando los principios estudiados del
cuasi-equilibrio o equilibrio rápido. Las fijaciones de sustrato e inhibidor son mutuamente
exclusivas. A muy altas concentraciones de sustrato desaparece la inhibición. El inhibidor
es tan específico como el sustrato. Por lo general, el inhibidor competitivo es un análogo
químico del sustrato. La inhibición competitiva es utilizada terapéuticamente para tratar
pacientes que han ingerido metanol. Este compuesto se convierte en metaldehído por
acción de la enzima alcohol deshidrogenasa. El metaldehído produce daño permanente en
muchos tejidos y ceguera. La terapia para los pacientes intoxicados con metanol es la
inyección, intravenosa, de etanol que es sustrato de la misma enzima y compite con el
metanol. La Figura 10 muestra el gráfico de doble-recíprocas de la reacción de la E con su
S en presencia de diferentes concentraciones de I donde se puede observar que la V M de la
reacción permanece inalterada mientras que el Km aumenta en presencia del inhibidor.
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Figura 10: Gráfico de doble-recíprocas de la reacción de la E con su S en presencia de diferentes
concentraciones de un inhibidor competitivo
Inhibición no-competitiva:
El inhibidor se une a la enzima en un sitio diferente al sitio activo. La enzima es inactivada
cuando se une el inhibidor, ya sea que el sustrato se encuentre unido a la enzima o no. El
inhibidor se fija indistintamente a la enzima libre o al complejo enzima- sustrato ES. Se
forma un compuesto ternario que es catalíticamente inactivo y que no puede escindirse para
formar producto y complejo enzima-inhibidor. El equilibrio sería:
en donde la VM medida = VM aparente es menor que la VM de la reacción en ausencia del
inhibidor. La Figura 11 muestra el gráfico de 1/v= f (1/[S]) en presencia de diferentes
concentraciones de inhibidor . La afinidad de la enzima por su sustrato no es alterada por la
presencia del inhibidor.
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Figura 11: Gráfico de doble-recíprocas de la reacción de la E con su S en presencia de diferentes
concentraciones de un inhibidor no-competitivo
Inhibición acompetitiva:
Un sistema unirreaccionante se puede representar por el equilibrio:
en el que el inhibidor se une reversiblemente a un sitio de la enzima diferente al sitio de
ligamiento del sustrato. A diferencia de la inhibición no-competitiva, en la inhibición
acompetitiva el inhibidor se une, únicamente, al complejo ES y forma un complejo ternario
ESI no productivo. En la Figura 12 podemos ver el gráfico de 1/v = f (1/[S]) a distintas
concentraciones de inhibidor donde se puede apreciar que tanto VM como Km están
afectado por la acción del inhibidor.
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Figura 12: Gráfico de doble-recíprocas de la reacción de la E con su S en presencia de diferentes
concentraciones de un inhibidor acompetitivo
Estos principios generales se pueden aplicar a reacciones más complejas.
Los inhibidores irreversibles se combinan y/o destruyen grupos funcionales de la enzima
que son esenciales para su actividad. Un caso común es la formación de uniones covalentes
entre un inhibidor irreversible y una enzima. Es por este motivo que la utilización de
inhibidores irreversibles es muy frecuente para estudiar mecanismos de reacción. Un grupo
especial de inhibidores irreversibles son los llamados inhibidores suicidas que tienen la
característica de reaccionar con la o una de las primeras enzimas de una vía metabólica
uniéndose irreversiblemente a ella interrumpiendo la secuencia de reacciones. Este tipo de
inhibidores se está aplicando en la industria farmacéutica por su capacidad de actuar,
únicamente, en el sitio activo de una determinada enzima, es inocuo para las demás y, por
tanto, posee muy pocos efectos secundarios.
Activación enzimática:
Los activadores son modificadores que incrementan la velocidad de una reacción catalizada
por enzimas. Se consideran dos tipos principales a saber: esenciales y no esenciales.
Activación esencial: En estos casos no hay actividad enzimática en ausencia del activador.
El verdadero sustrato de la enzima es un complejo sustrato-activador. Este fenómeno es
común en reacciones que involucran intermediarios fosforilados, especialmente
nucleósidos. Casi todas las reacciones que involucran ATP requieren Mg 2+. Lo mismo
ocurre con las pirofosfatasas, enzimas que tiene pirofosfato complejado con Mg 2+ como
sustrato. Los estudios cinéticos de reacciones que involucran un complejo enzima-activador
son bastante complicados y aún más complicaciones surgen cuando están involucrados más
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de un complejo metal-sustrato en la reacción y cada sustrato tiene una afinidad diferente
por el metal.
Activación no esencial: la reacción puede ocurrir en ausencia del activador y su velocidad
es aumentada por la presencia de éste.
REGULACIÓN DE METABOLISMO VEGETAL
Normalmente, la maquinaria celular se mueve con el mayor ahorro posible de la energía y
esto es posible por la presencia de múltiples mecanismos de regulación que aseguran a la
célula la formación de cada producto que le sea necesario en un momento determinado.
La actividad de las enzimas reguladoras es modulada a través de varios tipos de moléculas
señales que generalmente son pequeños metabolitos o cofactores. Existen dos clases
principales de enzimas reguladoras,
1: las enzimas alostéricas que funcionan a través de la unión reversible y no covalente de un
metabolito regulador llamado modulador.
2: las enzimas reguladoras que funcionan por modificación covalente reversible.
Ambas clases de enzimas reguladoras tienden a tener varias subunidades y en algunos casos
los sitios reguladores y activos se encuentran en diferentes subunidades.
Existen, por lo menos, dos mecanismos adicionales de regulación de la actividad
enzimática.
3: Algunas enzimas son activadas o inhibidas por proteínas de control que se les unen y
afectan su actividad.
4: Otras son activadas por ruptura proteolítica que, a diferencia de otros mecanismos, es
irreversible.
Modulación de la actividad enzimática por pequeños metabolitos:
Un importante mecanismo de regulación de una vía metabólica por pequeños metabolitos
es la regulación por producto final. En una vía metabólica regulada por producto final en
que un metabolito A es convertido a través de varios pasos en el metabolito Y, por acción
de las enzimas E1, E2, E3, etc y, ocurrirá que el metabolito Y inhibirá a la enzima inicial de
la vía metabólica. La enzima E1 es conocida como enzima reguladora.
E2
A
B
E3
C
Y
E1
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Generalmente el producto final es estructuralmente distinto al sustrato inicial, de donde se
dedujo que las enzimas correspondientes al tipo E1 de esta secuencia, es decir, las enzimas
reguladoras, tiene sitios distintos para el ligamiento del sustrato y para la unión del
inhibidor. Estos inhibidores han sido llamados alostéricos por Monod y Col. (1963), y los
sitios a que se unen fueron llamados alostéricos. Por esta misma razón también suelen
denominarse enzimas alostéricas. La unión de los inhibidores a estos sitios produciría
cambios en el estado conformacional de la molécula enzimática produciéndose
modificaciones en el sitio activo. Un inhibidor alostérico puede decrecer la afinidad por el
sustrato, lo que se traduciría por un aumento del Km, o bien puede afectar la eficiencia
catalítica de la enzima produciendo una disminución de la V M. También es posible la
producción simultánea de ambos tipos de fenómenos.
La retroinhibición es un modo muy efectivo de control puesto que al regular la primera
etapa de una vía metabólica regula la totalidad del flujo metabólico que transcurre por la
misma. Esto evita la acumulación de cada uno de los metabolitos intermediarios de la vía.
En la medida en que el metabolito final sea utilizado, la inhibición va desapareciendo y el
flujo de metabolitos se reinicia.
Los moduladores de las enzimas alostéricas pueden ser activadores o inhibidores. Un
activador, a menudo, es una molécula de sustrato y en este caso las enzimas reguladoras en
las que el sustrato y el modulador son iguales se llaman homotrópicas. Por otra parte
cuando el modulador es una molécula diferente del sustrato la enzima es heterotrópica.
Algunas enzimas tienen dos o más moduladores.
Merece destacarse que las propiedades de las enzimas alostéricas son significativamente
diferentes de las enzimas no reguladoras. Algunas de estas diferencias son estructurales, es
así como las enzimas alostéricas, además de los sitios de ligamiento de sustrato tienen uno
o más sitios alostéricos o reguladores para la unión del modulador. Los sitios de ligamiento
son específicos para cada uno de esos componentes y, además, las enzimas con
moduladores diferentes tienen diferentes sitios de unión para cada uno de ellos. Es de hacer
notar que en las enzimas homotrópicas los sitios activos y reguladores son iguales.
Estructuralmente, las enzimas reguladoras son en general más complejas que las enzimas
simples. La mayoría de ellas tienen más de una cadena polipeptídica o subunidad. Otra
diferencia radica en las propiedades cinéticas. Las enzimas alostéricas muestran relaciones
entre Vi y [S] que difieren del comportamiento de Michaelis-Menten. Aún cuando se
observa saturación con concentraciones de S suficientemente altas en los gráficos de V i= s
([S]) se obtiene una curva de saturación sigmoidal
Inhibidores y activadores
alostéricos
1.0
Y
0.8
0.6
0.4
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0.2
s
0.0
0
2
4
6
8
10
12
Figura 13: Efecto de la concentración de sustrato sobre la velocidad de una enzima alostérica.
En esa curva se puede encontrar un valor de [S] para el que V i= ½ VM, en este caso no
podemos referirnos al valor de Km porque la enzima no sigue la cinética de MichaelisMenten. En esos casos se utiliza S0,5 o K0,5 para representar la concentración de sustrato
para la cual se alcanza la mitad de la VM de la reacción catalizada por una enzima
alostérica.
Un comportamiento sigmoideo de la curva de Vi= f ([S]) significa que existe interacción
cooperativa entre las subunidades de la proteína, es decir, que cambios en la estructura de
una subunidad producidos por unión de un ligando se transmiten a las subunidades
adyacentes. Este efecto está mediado por interacciones no-covalentes en la interfase de las
subunidades. Las enzimas alostéricas homotrópicas, generalmente, poseen varias
subunidades. Frecuentemente el mismo sitio de unión de un sustrato en una subunidad se
comporta como un sitio regulador. Así para una enzima alostérica homotrópica la unión de
una molécula de sustrato altera la conformación de la enzima y como consecuencia la
afinidad del mismo por los otros sitios (frecuentemente actúa como activador). Este
comportamiento contribuye para la sigmoidicidad de la curva más que para el aumento
hiperbólico en Vi con el aumento de [S].
En el caso de las enzimas heterotrópicas en las que el modulador es un metabolito diferente
del sustrato es difícil generalizar el aspecto de la curva de saturación del sustrato. Así un
activador puede generar una curva de saturación más cercana a una curva hiperbólica con
una disminución de K0,5 y sin cambio en V M, resultando, de esta manera, un aumento en la
velocidad de reacción a una concentración fija de sustrato. Otras enzimas alostéricas
responden a un activador aumentando la VM y con una muy poca alteración del K0,5. Un
modulador negativo (inhibidor) puede producir una curva de saturación más sigmoidea con
un aumento de K0,5.
Las enzimas alostéricas muestran diferentes tipos de respuestas en sus curvas de actividad
versus concentración de sustrato. Los moduladores que para alguna de ellas son
activadores, de otras son inhibidores y en algunos casos se presentan ambos tipo de
moduladores simultáneamente.
Retroinhibición secuencial:
Este tipo de inhibición se produce en vías metabólicas ramificadas en que, por lo tanto, hay
más de un producto final. Sea la secuencia metabólica:
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Ea
A
Ec
B
D
E
F
G
C
Ee
En esta secuencia, cuando se acumula el producto E, la primera enzima responsable de la
ramificación que lleva a la producción de E, es decir Ec, será inhibida sin que por eso deje
de funcionar la conversión de C en G. A su vez, cuando también se haya acumulado G se
producirá la inhibición de la enzima Ee. Si ambos productos, E y G están acumulados, esto
ocasionará la acumulación de C, el efecto alostérico de Ea, con lo que, eventualmente, se
paralizará el flujo de metabolitos por la vía metabólica.
Retroinhibición concertada:
Se trata de un caso de retroinhibición en que cuando hay más de un tipo de producto final
ninguno es capaz, por si solo, de inhibir la enzima, o bien la inhiben en muy baja
proporción pero cuando se acumulan simultáneamente todos los productos finales éstos
actúan concertadamente inhibiendo significativamente a la enzima. La inhibición
concertada no equivale a la suma de las inhibiciones producidas por cada inhibidor, sino
que es mucho mayor, por ejemplo, si el metabolito inhibidor E inhibe un 20 % y el G
inhibe también un 20 %, la inhibición concertada puede alcanzar valores del 90 %. Como
en el caso anterior, además del mecanismo descripto suele observarse retroinhibición por
cada producto final sobre la primera enzima de la ramificación correspondiente.
Ea
A
Ec
B
D
E
F
G
C
Ee
Ejemplos en el metabolismo vegetal
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Antranilato
corismato
prefenato
arogenato
Corismato mutasa
Triptofano
Fenilalanina
La corismato mutasa es activada por triptófano para aumentar la producción de
fenilalanina. Altas concentraciones de fenilalanina inhiben a la corismato mutasa
Regulación por modificación química:
Estas enzimas son reguladas por la unión química de grupos específicos, unión que es
catalizada enzimáticamente.
La ribulosa 1,5 difosfato carboxilasa oxigenasa (RUBISCO), enzima que lleva a cabo la
fijación fotosintética del CO2, es regulada por modificación química. Esta involucra la
carbamilación de un residuo de lisina. Cuando la concentración de CO 2 es alta una reacción
de carbamilación ocurre, espontáneamente. Es de hacer notar que el sustrato de la enzima,
es decir, la ribulosa 1,5 difosfato, es un inhibidor de la transformación y que esta inhibición
es prácticamente completa en condiciones fisiológicas del CO 2. Sin embargo existe una
enzima, la rubisco activasa, que promueve la activación de la RUBISCO dependiente de
ATP. El mecanismo es desconocido y tampoco es claro el papel que juega el ATP (Figura
14).
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Figura 14: Reacción de carbamilación de la Enzima RUBISCO
Además, la carbamilación está favorecía por pH alcalino y altas concentraciones de Mg 2+
que favorecen la formación del complejo (estas condiciones aumentan durante la
iluminación).
Otro ejemplo es el de una enzima clave en la síntesis de la sacarosa, la sacarosa fosfato
sintetasa, cuya actividad está regulada por la fosforilación proteica de la enzima (Figura
15). En efecto sobre la enzima actúa una quinasa transformándola de una forma de baja
afinidad por los sustratos en otra de alta afinidad. Sobre esta forma de alta afinidad actúa
una fosfatasa que da origen a la forma de baja afinidad.
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Figura 15: Regulación de la actividad de una enzima por fosforilación-defosforilación
Modulación redox de la actividad enzimática:
Se conoce un cierto número de enzimas vegetales que son activadas o inhibidas por su
estado de oxidación o al menos por la presencia de ciertos oxidantes o reductores en sus
soluciones.
Para mayor claridad consideremos por una parte a aquellas enzimas que son reguladas por
un sistema compuesto por la ferredoxina y la tiorredoxina, que comprende algunas enzimas
de los cloroplastos, y por exclusión tenemos otro grupo cuyas enzimas son sensibles a
ciertos compuestos redox.
Enzimas reguladas por el sistema ferredoxina-tiorredocina: como ya se indicó estas
enzimas están localizadas en el cloroplasto. El estímulo básico regulador de esas enzimas
proviene de la luz. La acción de la luz se efectúa a nivel del fotosistema I. El flujo de
electrones ocasionado por la luz pasará el aceptor P430 y de allí a la ferredoxina soluble
(Figura 16).
Por acción de la NADP-tiorredoxina reductasa, enzima cuya estructura corresponde a una
flavoproteína, el electrón de la ferredoxina es utilizado para reducir la tiorredoxina. La
tiorredoxina es una proteína de bajo peso molecular capaz de transportar electrones.
Contiene un grupo cisteina que sufre reducción reversible a la forma de sulfhidrilo. Además
de la reducción enzimática a nivel fisiológico, la ferredoxina puede ser reducida
químicamente por DTT (ditiotreitol). Finalmente hay una reducción de las enzimas del
grupo por la tiorredoxina.
Las enzimas activadas por este sistema son: fructosa-1, 6-bisfosfatas, sedoheptulosa-1, 7bisfosfatasa, NAD-gliceraldehído, 3-fosfato deshidrogenasa, ribulosa-5-fosfato quinasa que
forman parte del ciclo del Calvin (fotosíntesis). Además, este mecanismo también activa la
NADP-malato deshidrogenasa y la fenilalanina amonio liasa. Normalmente se considera
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que el ciclo de Calvin está situado en lo que se denomina la fase oscura de la fotosíntesis,
sin embargo, algunas enzimas del ciclo prácticamente no son funcionales en la oscuridad,
por tanto, la diferenciación tradicional entre fase oscura y luminosa de la fotosíntesis carece
de validez.
Mecanismo de desactivación enzimática en la oscuridad: no habría un único mecanismo de
desactivación de este grupo de enzimas. Se pueden clasificar en tres tipos considerando sus
mecanismos de desactivación. El primer tipo, a los que pertenece la fructosa-1, 6-bisfosfata,
la ribulosa-5-fosfato quinasa y la fenilalanina amonio liasa, es desactivado por un oxidante
soluble como el glutatión oxidado (GSSG) o por el ácido dehidroascórbico.
En el segundo tipo tendríamos, únicamente, la NADP-malato deshidrogenasa, que
requeriría un oxidante ligado a membranas. Las enzimas del tercer grupo, tales como
NADP-gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa, no poseen mecanismos conocidos de
desactivación.
Tanto la desactivación de las enzimas activadas por tiorredoxina, como su activación se
hacen a una velocidad menor a la de la catálisis, es decir, se trataría de enzimas histeréticas.
Figura 16: Modulación redox de la actividad enzimática
Enzimas no dependientes de la tiorredoxina:
Han sido descriptas varias enzimas vegetales que son activadas por oxidantes y
desactivadas por reductores. Estas enzimas parecen estar situadas fuera de los plástidos. La
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nitrato reductasa, por ejemplo, es activada por ferricianuro y desactivada por NADPH. Sin
embargo, no se conoce el oxidante fisiológico de la enzima. Las fosfatasas ácidas no
específicas de hojas y tubérculos son activadas por GSSG y por ácido deshidroascórbico
con corrimiento del pH óptimo de modo que las enzimas son activas a pH neutro y ácido. A
pH neutro la activación producida por GSSG es revertida por GSH. La modulación redox
de fosfatasas ácidas de cianobacterias también ha sido comunicada.
CONTROL METABÓLICO POR LA CARGA ENERGETICA DEL ADENILATO
Atkinson ha sugerido que la relación entre ATP, ADP y AMP debe estar regulada contra
fluctuaciones demasiado grandes a fin de que la célula permanezca en estado operacional.
La producción de ATP debería estar regulada de modo que sea igual a su velocidad de
movilización. Consecuentemente, con estas ideas se encontró que la existencia celular de
adenilado, esto es la suma del total de ATP, ADP y AMP contenida en la célula es
constante. Por tanto la utilización de ATP produciría cantidades equivalentes de AMP y
ADP según el tipo de reacción con que se esté consumiendo el ATP. Por otra parte, hay una
enzima que interrelaciona a los tres componentes del adenilado, posibilitando un equilibrio
directo entre ellos. Esta enzima es la adenilato quinasa que cataliza la reacción:
ATP + AMP
2ADP
Adenilato quinasa
Atkinson y Walton (1967) propusieron el término de carga energética para expresar el
estado energético del adenilato:
Carga energética = ATP + ½ ADP/ ATP + ADP+ AMP
La carga energética del adenilato será igual a 1 cuanto todo el adenilato esté como ATP, y
será igual a 0 si está totalmente convertido en AMP. Las enzimas que forman ATP (por ej.
la fosfofructoquinasa) son activas a bajos valores de carga energética y poco activas a altos
valores. Las enzimas que utilizan el ATP (por ej. la ADP-glucosa pirofosforilasa) con fines
biosintéticos, en cambio, son menos activas a bajos valores de carga energética y muy
activas a altos valores.
Ambos tipos de enzimas son altamente sensibles a variaciones de la carga energética en la
zona de 0,8.
Se constató que un considerable número de células tienen valores de carga energética entre
0,8 y 0,95. Se piensa que las enzimas reguladas por la carga energética están diseñadas para
mantener constante el nivel de carga energética de la célula.
Enzimas de vegetales superiores moduladas por la carga energética del adenilato:
La 3-fosfoglicerato quinasa de cloroplastos y de citoplasma de hojas de arveja son
reguladas por cambios de la carga energética del adenilato. El AMP inhibe tanto la
actividad de formación del 3-fosfoglicerato (reacción de formación de ATP) como la de
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formación de 1,3-difosfoglicerato (reacción de consumo de ATP). En cambio el ATP inhibe
la formación de 3-fosfoglicerato. La región de mayor sensibilidad a los cambios energéticos
está entre 0,8 y 1 para ambas reacciones. A alta carga energética la actividad de formación
del 1,3-difosfoglicerato se acentúa, acentuando con ello la síntesis de carbohidratos,
mientras que a baja carga energética (menor que 0,8) se formaría, preferencialmente, 3fosfoglicerato, es decir, se favorece la glicólisis.
Estudios efectuados con cloroplastos y citoplasma de Elodea demostraron que a la luz, la
carga energética es muy alta (mayor que 0,9), mientras que es baja en la oscuridad (del
orden de 0,67 en cloroplastos y de 0,76 en el citoplasma), lo que sugiere que la dirección de
la reacción de la 3-fosfoglicerato quinasa puede estar siendo regulada durante la fotosíntesis
y en la oscuridad.
Estudiando la fosfofructoquinasa vegetal se encontró que ni el ADP ni el AMP son
inhibidores de la enzima. El ATP y el citrato son inhibidores, y sus inhibiciones son
parcialmente suprimidas por el Pi. Además, el Pi es un potente inhibidor de las ADPglucosa pirofosforilasas de algas y plantas superiores, por lo cual también debería
considerarse el Pi en el estudio de los efectos de la carga energética del adenilato en las
plantas.
Regulación por compartimentalización
Existen dos tipos de compartimentalizaciones que interviene en la regulación de la
actividad enzimática. Una es la compartimentalización por membranas que hacen las veces
de tabiques aislando compartimientos, otra es la efectuada por complejos enzimáticos.
Compartimentalización efectuada por complejos multienzimáticos:
Los sistemas multienzimáticos han sido descriptos como agregados de enzimas diferentes
pero funcionalmente relacionadas, unidas por fuerzas no covalentes en una estructura
altamente organizada. Estos sistemas pueden ser solubles o asociados a membranas, pero
puesto que las fuerzas que unen a estas enzimas entre sí o a estructuras citoplasmáticas
pueden ser muy laxas, los procesos de extracción son capaces de separar las enzimas
individuales y existe la posibilidad de que muchas secuencias metabólicas que se cree son
ejercídas por enzimas solubles, físicamente independientes, sean artificios de los procesos
de obtención.
Los complejos multienzimáticos poseen una eficiencia catalítica aumentada con respecto a
la acción que tendrían sus enzimas componentes si estas estuvieran libres en la solución. La
mayor eficiencia catalítica de las enzimas complejadas sería debido a la canalización del
flujo de metabolitos los que pueden ser directamente transferidos en el complejo de enzima
a enzima o bien puede deberse al decrecimiento del período de difusión de los
intermediarios, el que estará esencialmente limitado al microambiente del complejo. En las
enzimas solubles los intermediarios deben equilibrarse con el medioambiente en que se
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encuentran las enzimas. Los sistemas multienzimáticos también presentan un potencial
mayor para la captación afinada de controles coordinados de activación o inhibición,
cambios del pH, etc. Debido a que hay ausencia o limitaciones de intermediarios libres los
productos intermediarios inestables están protegidos. Los sistemas transportadores de
electrones de las mitocondrias y de los cloroplastos son ejemplos de este tipo.
Criterios para la detección de sistemas multienzimáticos complejados: Para la detección de
un sistema multienzimático complejado debe establecerse, ante todo, que la transformación
de un compuesto sucede por pasos múltiples. Se determinan las condiciones óptimas del
proceso global y, si es factible, la de cada paso. Al purificar el sistema se presentará
copurificación, la que puede demostrarse por una relación constante entre la actividad
global y por lo menos una reacción parcial. Además, el añadido de intermediarios, con una
concentración limitante del metabolito inicial no debe aumentar la velocidad de la reacción
global. Finalmente puede compararse la razón 3H/14C del producto y de los intermediarios
luego de una incubación con cantidades limitantes del sustrato inicial marcado con 3H e
intermediario exógeno marcado con 14 C. Razones mayores que 1 indican que no hay
intercambio entre el intermediario exógeno y el endógeno del sistema.
Ejemplos específicos: un ejemplo de este tipo de regulación en vegetales ha sido descripto
para un alga y para plantas superiores, ejemplo localizado en una secuencia de dos etapas
ubicadas en la via metabólica del fenilpropano. En esta secuencia la fenilalanina es
convertida en el ácido P-cumárico e involucra dos enzimas, la fenilalanina amonio liasa
(PAL) y la cinamato-4-hidroxilasa (C4H).
En esta secuencia el ácido P-cumárico es formado a mayor velocidad a partir de la
fenilalanina que cuando se parte del ácido cinámico. Esto se cumple cuando el ácido
cinámico es utilizado a una concentración equivalente a la producida por la actividad de la
PAL.
Fenil alanina
Fenilalanina amonio liasa (PAL)
Cinamato
Ácido p-cumarico
Ácido cafeico
Ácido ferúlico
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Estos datos indican la existencia de una canalización de los sustratos intermediarios.
Utilizando la técnica descripta de la doble marcación se confirmó la presencia de una
canalización de sustratos. Para ello se incubó una mezcla de enzimas con el sustrato de
partida (Fenilalanina marcada con 3H) y el intermediaro exógeno (cinamato 14C). Luego de
cierto tiempo de incubación se aislaron los ácidos cinámico y P-cumárico, determinándose
la relación 3H/14C de cada producto. Luego se determina el cociente de las razones del
producto respecto al intermediario:
3
H/14C ácido p-cumárico/3H/14C ácido cinámico
Si el cociente es menor que 1 el sistema está compuesto por enzimas solubles
independientes, pero si es mayor que 1 demuestra la presencia de un complejo con
canalización de metabolitos. Cuanto más alto que 1 resulte el cociente tanto más
estrechamente estará unido el complejo. La tabla muestra los resultados obtenidos con
varios vegetales.
Recientemente se ha comunicado la existencia, en tilacoides de algas, de un complejo
multienzimático que lleva desde la fenilalanina al ac. Cafeico, y de ésteres del ac. Ferúlico
que completa aún más la vía biosintética del fenil-propano que acabamos de describir.
Otros complejos enzimáticos descriptos en plantas actuando con compartimentalización son
el de la durrina (Glicósido cianogénico) cuya síntesis se inicia con la tirosina, la que es
transformada en N-hidroxitirosina, y esta a su vez es la oxima correspondiente (phidroxifenilacetaldoxima), la que luego pasa a nitrilo (p-hidroxifenilacetonitrilo), el que se
descompone espontáneamente a 4-hidroxibenzaldehido por ausencia de los pasos que faltan
en el sistema aislado para la formación de la durrina. Hay otros complejos multienzimáticos
descriptos en plantas pero los estudios correspondientes aún no fueron completados.
Compartimentalización por membranas: El metabolismo vegetal se muestra regulado por la
existencia de compartimentos en un grado muy superior al del organismo animal. Es bien
conocida la ocurrencia de la fotosíntesis en el cloroplasto de los vegetales, un órganulo
celular y como tal previsto de membranas. La biosíntesis de ácidos grasos es
exclusivamente cloroplastídica y la bio síntesis de estos compuestos en tejidos no verdes
parecería, también, efectuarse en plástidos. Otras enzimas que se encuentran en los
plástidos son las enzimas sintetizantes de los terpenos y las de varios pigmentos, así como
las enzimas que llevan al N de los nitratos a nivel de los aminoácidos.
Se acepta que los cloroplastos contienen las enzimas del ciclo reductor de las pentosas
fosfato, pero debemos considerara que hay enzimas citosólicas que catalizan reacciones
similares a las del ciclo en la glicólisis y en la via oxidativa de las pentosas fosfato. Por
Dra María Inés Isla
ejemplo, se han descripto las siguientes enzimas localizadas tanto en citosol como en
cloroplastos: ribosa-5-fosfoisomerasa, fosfoglicerato quinasa, fructosa-1, 6-difosfato
aldolasa y triofosfato isomerasa. Las enzimas homólogas de ambos compartimentos son
isoenzimas (es decir enzimas con la misma función catalítica pero con diferencias menores
o mayores en la estructura, que pueden conferirles diferentes propiedades físicas, cinéticas
o reguladoras). Sin embargo las propiedades físicas y cinéticas de estas isoenzimas están
muy próximas.
Un caso particular es la compartimentalización de ciertas enzimas en vacuolas. Entre ellas
parece particularmente importante la presencia de toda o casi toda la invertasa ácida soluble
en la vacuola (la invertasa es la enzima que hidroliza la sacarosa a glucosa y fructosa).
Merece destacarse que los azúcares de reserva más importantes en las plantas superiores
son el almidón y la sacarosa y que es en forma de sacarosa como se transporta la mayor
parte del fotosintato en las plantas superiores. Se han hecho ensayos con un derivado
fluorado de la sacarosa, la 1-fluorosacarosa, que no es atacado por las invertasas pero si por
la sacarosa sintetasa (la sacarosa sintetasa, en una reacción reversible, es capaz de convertir
la sacarosa y el UDP en UDPG y fructosa), enzima que lo convierte en UDPG y fructosa
fluorada. Suministrando este compuesto marcado con 14C a tejidos de vegetales superiores
la marcación no se distribuye a ningún metabolito. Esto parece confirmar que la
degradación de la sacarosa se hace, en los vegetales superiores, por la intervención de la
invertasa. Ya se había demostrado que algunos tejidos de la caña de azúcar en los que no se
detectó la presencia de sacarosa sintetasa pero sí de invertasa, son capaces de metabolizar la
sacarosa. Por otra parte se demostró que en las vacuolas de las plantas superiores hay,
también sacarosa. Por tanto debe existir un mecanismo que, dentro del compartimento,
impida la rotura ilimitada de sacarosa. Hay, además, isoenzimas de la invertasa localizadas
en la pared celular, las que actuarían en el transporte de la sacarosa.
CONTROL DE METABOLISMO POR INDUCCIÓN-REPRESIÓN ENZIMÁTICA.
Tanto en los organismos procariotas como en los eucariotas existen dos tipos de enzimas,
uno cuyo nivel se mantiene constante e independiente de los estados metabólicos de la
células, denominadas enzimas constitutivas, y otro cuya presencia puede ser débil, o
inclusive indetectable, y que según los estados metabólicos de la célula su concentración
puede aumentar centenares de veces. La concentración de estas últimas enzimas suele
aumentar o disminuir frente a la presencia de determinados metabolitos, y se las conoce
como enzimas inducibles y al metabolito que provoca su aumento se lo denomina inductor.
A su vez el fenómeno por el cual se produce el aumento de la cantidad de enzima es
conocido como inducción.
Hay, además, mecanismos adicionales en que ciertos catabolitos minimizan la cantidad de
enzima inducida aún cuando en el medio celular haya un inductor. Este tipo de mecanismo
es conocido como represión por catabolito o represión catabólica.
Dra María Inés Isla
Estos mecanismo se ejercen, según se indicó, por aumento o disminución de la cantidad de
enzima y por tanto supone la síntesis, de novo, de proteínas, es decir, que involucran la
expresión y regulación genética.
Inducción y represión en eucariotas: Hay varias diferencias importantes entre los
organismos procariotas y eucariotas. En efecto, a diferencia de los procariotas que sólo
poseen un tipo de RNA polimerasa, los eucariotas poseen tres tipo de RNA polimerasas
DNA dependientes que se encuentran en los núcleos. La RNA polimerasa I, que transcribe
los genes de RNA ribosómico, está localizada en el nucleoplasma y su actividad elongante
es específicamente inhibida por la α-amanitina (toxina de Amanita phalloides). La RNA
polimerasas I y II inician la transcripción en regiones de DNA de cadena simple. La RNA
polimerasa III transcribe los tRNA y los 5S, estando localizada en el nucleoplasma. Esta
última enzima es capaz de trabajar tanto con DNA de cadena simple como doble.
Una diferencia notoria es el hecho de que el genoma procariota suele expresarse por genes
coordinados, esto es, por operones. El genoma eucariota, por el contrario, no sólo no se
expresa de esta manera sino que las secuencias nucleótidas del mRNA no se corresponden
con una única secuencia del DNA sino con varias secuencias separadas a los largo del
genoma. Finalmente, los mRNA eucariotas necesitan un proceso de maduración pues
poseen intercaladas secuencias no codificantes, intrones, y secuencias codificantes, exones,
siendo necesaria la eliminación de los intrones. El conjunto de estos segmentos no
codificante del mRNA recibe el nombre de RNA heterogéneo (HnRNA). Por tanto el
concepto de un gen una proteína no corresponde a los organismos eucariotas. En
consecuencia no podemos hablar de cistrones sino de unidades de transcripción. El proceso
de transcripción es más lento en los eucariotas y menos intenso.
Métodos utilizados en el estudio de la inducción en plantas:
Los estudios de inducción en plantas están largamente basado en análisis genéticos,
tecnología de muy difícil aplicación a los vegetales superiores. Por esta razón el enfoque de
esta cuestión en plantas superiores debe hacerse utilizando otras tecnologías.
Cuando la actividad de una enzima en un tejido u órgano vegetal aumenta rápidamente
como respuesta a un metabolito se agrega, al proceso, inhibidores de las síntesis proteíca
capaces de actuar a diferentes niveles en el proceso biosintético de las proteínas. De este
modo se procura establecer si el cambio de la actividad en cuestión es debido a la síntesis,
de novo, o si se debe a la formación de enzima a partir de proteína preexistente. Es
necesario conocer el efecto del inhibidor empleado sobre la actividad in vitro de la enzima
en estudio a fin de asegurar de que cualquier registro de disminución de la enzima no sea
causado por fenómenos de inhibición de la actividad enzimática del tejido.
Este método ha brindado resultados positivos hasta el presente. Algunos autores utilizaron
el estudio comparado simultáneo de varias enzimas que se estén sintetizando (actividad en
aumento) al mismo tiempo en el tejido, observando, en todas ellas el efecto de los
inhibidores de la síntesis proteíca y de los probables metabolitos inductores. Según los
Dra María Inés Isla
resultados que se obtengan es posible inferir cual es la base de los fenómenos observados.
La mejor recomendación que se puede dar para estos y otros tipos de estudios es la de
aplicar más de un tipo de tecnología, cuando esto es posible, para el análisis del problema,
y ver si no es posible, además para mayor rigor, la aplicación de métodos propios.
Principales inhibidores de la síntesis proteica utilizados para el estudio de inducciónrepresión en plantas: Ya indicamos que la síntesis de proteínas puede ser inhibida a
diferentes niveles. Así tenemos los inhibidores de las síntesis del RNA, entre los que se
utilizaron la actinomicina D y la 6-metilpurina. Como inhibidores de la traducción del
código también se utilizaron la cicloheximida (actidiona), que inhibe la formación de la
unión peptídica y afecta la iniciación de las cadenas polipeptídicas en sistemas libres de
células de embriones de trigo. Las cicloheximida sólo actúa en eucariotas, pero no en
procariotas. La puromicina también ha sido empleada en la inhibición de la síntesis proteíca
en tejidos vegetales y en sistemas libres de células. La puromicina interrumpe la elongación
de la cadena polipeptídica provocando la liberación de un derivado covalente peptidilpuromicina.
Se ha comunicado un efecto represor de la biosíntesis de la invertasa ácida soluble
(vacuolar) de tallos de caña de azúcar por la glucosa y la fructosa. Esta interpretación está
basada en que la velocidad máxima de pérdida de actividad invertásica en presencia de
glucosa fue la misma que en presencia de inhibidores generales de la biosíntesis de
proteínas. Además, la síntesis de peroxidasa no fue inhibida por la glucosa y por tanto, la
glucosa no parece alterar los niveles de sutratos, ribosomas ni enzimas requeridos para la
biosíntesis de proteínas.
Regulación por proteínas: Un ejemplo típico de la regulación enzimática por proteínas,
tomado de la literatura, es el de la invertasa ácida soluble de tubérculos de Solanum
tuberosum (papa). Esta encima está regulada por un inhibidor proteico, el que ha sido
purificado, primero por Pressey (1967) y luego por varios otros investigadores. El peso
molecular del inhibidor es de 17.000, es decir que se trata de una proteína relativamente
pequeña. El producto purificado actúa como un inhibidor no-competitivo irreversible,
llegando a suprimir completamente la actividad de la invertasa a cualquier pH. Sin
embargo, esta capacidad inhibitoria es máxima a pH 4,5 pero a medida que nos alejamos de
este pH, tanto hacia valores superiores como inferiores, las concentraciones de inhibidor
capaces de producir la inhibición total va aumentando.
Otra característica del inhibidor es que, cuando se utiliza a concentraciones moderadas
como efector de la invertasa ácida soluble de papa, la actividad invertásica exhibe dos
óptimos de pH, uno a 5,5-6 y otro mayor por debajo de pH 3.
Sin embargo se demostró (Isla y col., 1991) que el inhibidor proteico de la invertasa ácida
soluble de S. tuberosum es una lectina, las que por definición pueden unirse,
específicamente, a ciertos azucares, estén o no libres en la solución, o bien a secuencias
glicosídicas particulares para cada tipo de lectina. Como las invertasas son glicoproteínas
cualquier lectina capaz de reconocer los azúcares o secuencias de azúcares de sus cadenas
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glicosídicas pueden unirse a la invertasa, y por ende provocar cambios en las propiedades
de la enzima. Por esta razón podría ser completamente casual y no fisiológico el efecto
inhibitorio producido sobre la invertasa. Estudios posteriores (Isla y col. 1992) mostraron
que el inhibidor proteico de los tubérculos de papa se localiza en la pared celular, mientras
que la invertasa ácida soluble se encuentra en la vacuola junto con su sustrato, la sacarosa.
En consecuencia, es prácticamente improbable que el inhibidor proteico sea un inhibidor
fisiológico, in vivo, de la invertasa ácida soluble. Sin embargo, la pared celular de los
tubérculos de papa contiene otra invertasa, la que nunca fue tomada en cuenta para la teoría
de una posible función fisiológica del inhibidor. Esta invertasa de pared también es inhibida
por el inhibidor proteico y por consiguiente, en tanto no se tengan más datos, no puede
excluirse que esta enzima sea un posible blanco fisiológico del inhibidor.
Este inhibidor de papa actúa sobre otras invertasas de hojas, pero hay también invertasas
que nos inhibidas como puede verse en la tabla anterior.
Además, se han encontrado inhibidores proteicos para las invertasas de batata, remolacha
común y azucarera y maíz.
Dra María Inés Isla