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rEVISIÓN
Mejoras en el diagnóstico de distrofinopatías:
¿qué hemos aprendido después de 20 años?
Luz B. López-Hernández, M. Luz Ayala-Madrigal, Dave van Heusden, Francisco J. Estrada-Mena,
Patricia Canto, Lucila Sandoval-Ramírez, Benjamín Gómez-Díaz, Ramón M. Coral-Vázquez
Introducción. Las distrofinopatías son trastornos genéticos ligados al cromosoma X causados por mutaciones en el gen
DMD. Las pruebas genéticas son de suma importancia para la gestión y el asesoramiento genético de estas enfermedades. Sin embargo, la complejidad del gen DMD es un desafío para el diagnóstico.
Objetivo. Describir los avances recientes en el diagnóstico de distrofinopatías, después de 20 años de los primeros ensayos moleculares para la detección genética de estas enfermedades.
Desarrollo. En la actualidad, se han desarrollado una variedad de estrategias, como la detección de mutaciones automatizada, los métodos basados en células y la haplotipificación de alto rendimiento, para facilitar el diagnóstico de distrofinopatías, la detección de portadoras, el diagnóstico prenatal y preimplantacional.
Conclusión. Las nuevas tecnologías han mejorado la detección temprana y el manejo óptimo de distrofinopatías, y han
establecido la base para la medicina molecular en el futuro. Los avances más importantes en el diagnóstico de distrofinopatías se revisan en este documento.
Palabras clave. Diagnóstico genético preimplantacional. Diagnóstico prenatal. Distrofina. Duchenne. Portadora.
Introducción
En los últimos 20 años, los avances en el diagnóstico de enfermedades monogénicas no sólo han permitido una gestión óptima de los pacientes y el asesoramiento genético, sino también han abierto opciones terapéuticas prometedoras en medicina molecular. Desde los ensayos iniciales para la detección
de mutaciones en pacientes con distrofinopatías a
principios de los años noventa, se han producido varios avances [1,2].
Las distrofinopatías son un grupo de enfermedades que incluyen la distrofia muscular de Duchenne
(DMD) (OMIM 310200), la distrofia muscular de
Becker (DMB) (OMIM 300376) y la cardiomiopatía
dilatada ligada al cromosoma X (CDLX) (OMIM
302045), todas causadas por mutaciones en el gen
DMD. La esperanza de vida en la DMD, la más grave
de las distrofinopatías, ha cambiado sorprendentemente desde 14 años en los años sesenta a 25,3 años
en 2002 como resultado de un diagnóstico precoz y
un tratamiento multidisciplinario [3]. A pesar de estos avances, algunos autores han señalado que, en la
actualidad, hay un retraso de 2,5 años entre la aparición de los síntomas de la DMD y el diagnóstico definitivo en los casos no familiares [4]. Para complicar
este panorama, los últimos informes sobre series nu-
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merosas de pacientes han demostrado que la mayoría de ellos tienen mutaciones ‘privadas’ (mutaciones
únicas de un árbol genealógico), lo cual complica el
diagnóstico [5]. De esta manera, se destaca la necesidad de un sistema que combine algoritmos diagnósticos y de tratamiento para las distrofinopatías [6,7].
A partir del desarrollo de los primeros ensayos de
reacción en cadena de la polimerasa (PCR) múltiple
para detectar los exones eliminados con mayor frecuencia en pacientes con DMD hace 20 años, el progreso logrado en el diagnóstico de distrofinopatías
es considerable, por lo que el objetivo de esta revisión es proporcionar una descripción actual de las técnicas disponibles para la detección de portadora, el
diagnóstico prenatal (DP) y el diagnóstico genético
previo a la implantación (DGP) en distrofinopatías.
Distrofinopatías
La distrofina es una proteína estructural del músculo que forma parte de un complejo multiproteínico denominado DGC (dystrophin glycoprotein complex). Su función principal es formar un vínculo
entre el citoesqueleto y la matriz extracelular para
proteger a las células del músculo del daño mecánico experimentado durante la contracción [8] [Ló-
Instituto de Genética Humana
Doctor Enrique Corona Rivera;
Universidad de Guadalajara;
Guadalajara, Jalisco (L.B. LópezHernández, M.L. Ayala-Madrigal,
L. Sandoval-Ramírez). Escuela
Superior de Medicina; Instituto
Politécnico Nacional; México DF
(R.M. Coral-Vázquez). Centro
Médico Nacional 20 de Noviembre;
Instituto de Seguridad y Servicios
Sociales de los Trabajadores del
Estado; México DF (L.B. LópezHernández, P. Canto, R.M. CoralVázquez). Escuela de Medicina;
Universidad Panamericana;
México DF (F.J. Estrada-Mena).
Centro de Investigación Biomédica
de Occidente; Instituto Mexicano
del Seguro Social; Guadalajara,
Jalisco (L. Sandoval-Ramírez).
Instituto Nacional de Rehabilitación;
México DF, México (B. Gómez-Díaz).
Center for Human and Clinical
Genetics; Leiden University Medical
Center; Leiden, Países Bajos
(D. van Heusden).
Correspondencia:
Dr. Ramón Mauricio Coral Vázquez.
Sección de Posgrado. Escuela
Superior de Medicina-IPN.
Plan de San Luis y Díaz Mirón, s/n.
Col. Casco de Santo Tomás. Del.
Miguel Hidalgo. CP 11340. México
DF, México.
Fax:
(5255) 57296300-16820.
E-mail:
[email protected]
Financiación:
CONACYT (México) y Asociación de
Distrofia Muscular de Occidente A.C.,
APBP-CEMEFI-SSA.
Agradecimientos:
A J. den Dunnen e I. Fokkema, por
sus útiles sugerencias y comentarios;
a S. Haskovec, por la ayuda en la
edición del texto, y a L. Jiménez,
por los dibujos.
Aceptado tras revisión externa:
20.10.10.
Cómo citar este artículo:
López-Hernández LB, AyalaMadrigal ML, Van Heusden D,
239
L.B. López-Hernández, et al
Estrada-Mena FJ, Canto P,
Sandoval-Ramírez L, et al.
Mejoras en el diagnóstico de
distrofinopatías: ¿qué hemos
aprendido después de 20 años?
Rev Neurol 2011; 52: 239-49.
© 2011 Revista de Neurología
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240
pez-Hernández et al, enviado]. En un principio se
definió a las distrofinopatías como ‘el fenotipo en
expansión’, ya que, además de la DMD, un amplio
espectro de fenotipos son causados por mutaciones
en el gen DMD [9].
Los pacientes con DMB conservan la capacidad
de caminar más de 16 años y muestran una progresión de la enfermedad menos grave, mientras que
los pacientes con DMD muestran síntomas de manera temprana; empiezan a caminar alrededor de
los 18 meses de edad y, cuando la enfermedad progresa, los pacientes se debilitan, y a los 9-12 años en
promedio, pierden la deambulación. La explicación
más simple para las diferencias fenotípicas entre
DMD y DMB es la ‘hipótesis del marco de lectura’,
que establece que en la DMB la mutación mantiene
el marco de lectura en el transcrito, mientras que
en los pacientes con DMD las mutaciones provocan una pérdida del marco de lectura [10]; la mayoría de los casos concuerda con esta regla.
Además de la distrofina en músculo esquelético,
existen otras isoformas (p. ej., Dp260, Dp71) [11]
generadas por diferentes sitios de inicio de la transcripción o por procesos de empalme alternativo.
Por otra parte, se ha documentado que la CDLX
(cardiomiopatía dilatada 3B) se debe a mutaciones
en el gen DMD que exhiben participación casi exclusivamente en la función cardíaca [11]. Las diferencias fenotípicas entre la DMB y la CDLX no están completamente claras en el nivel molecular,
pero se ha publicado, en una familia con CDLX, una
mutación intrónica en el extremo 5’ del gen DMD
que induce un empalme aberrante del transcrito que
produce un exón que rompe el marco de lectura
normal; asimismo, se han descrito mutaciones en la
parte media del gen DMD asociadas a CMDLX [12].
Las distrofinopatías en las mujeres son un tema
a menudo poco estudiado, pero se ha demostrado
recientemente que la superposición clínica puede
ocurrir entre las distrofias musculares de cinturas
(LGMD) y las distrofinopatías de niñas afectadas
[13]. También se ha descrito el fenotipo DMD grave
en mujeres, originado por diferentes mecanismos:
– Inactivación sesgada del cromosoma X en portadoras de DMD [14].
– Translocación equilibrada X:autosoma con puntos de interrupción en el gen DMD e inactivación preferencial del cromosoma X normal [15].
– Monosomía del cromosoma X con mutaciones
en el gen DMD [16].
– Isodisomía materna del cromosoma X con mutación en el gen DMD [17].
– Aparición simultánea de mutaciones en el gen
DMD y el gen del receptor androgénico [18].
– Mutación homocigota en el gen DMD (fenotipo
DMB, debido a que la deleción no modifica el
marco de lectura) [19].
A partir de lo anterior, se puede postular que, cuando exista sospecha de distrofinopatía en una mujer,
la confirmación del diagnóstico debe hacerse mediante pruebas genéticas.
Fuentes biológicas para el
diagnóstico de distrofinopatías
La disponibilidad de la muestra y el tipo de la variante patógenica desempeñan un papel central en
el diagnóstico de distrofinopatías y el diagnóstico
de portadoras, especialmente en los casos sin antecedentes familiares (casos esporádicos). Asimismo,
es relevante mencionar que el diagnóstico del caso
índice es la primera etapa necesaria para encausar
el asesoramiento genético. Para realizar el diagnóstico, se aísla ADN genómico (ADNg) de sangre, el
cual se utiliza normalmente para las pruebas genéticas, tanto para el diagnóstico del paciente como
para el diagnóstico de la portadora. Sin embargo,
no todos los cambios en el ADN revelan el defecto
en el ARN, y viceversa. En este sentido, se ha demostrado [20] que, con eliminaciones en el gen DMD
en las que se predice la ausencia de la proteína y un
fenotipo grave, los pacientes desarrollan una enfermedad tipo DMB debido a fenómenos de empalmes
alternativos del ARN mensajero (ARNm) y a la presencia de proteínas truncadas parcialmente funcionales; por otra parte, se describió un paciente con
ausencia de los exones 61-79 en el transcrito del
gen DMD, pero que estaban presentes en el ADN
genómico. Además, hemos demostrado previamente que la RT-PCR (utilizando ARNm de linfocitos)
para la detección de portadores no es factible, ya
que eventos normales de empalme alternativo pueden causar resultados falsos positivos [21]. En conjunto, estas observaciones implican que el diagnóstico de distrofinopatías no es tan simple como se
pensaba anteriormente. Recientemente, algunos investigadores han utilizado la biopsia de músculo o
de piel para análisis de genes y de la proteína distrofina, especialmente en pacientes esporádicos con
DMD [22]. La estrategia de la biopsia muscular
también se ha empleado para el diagnóstico de las
mujeres en situación de riesgo. El hallazgo de las fibras negativas de distrofina en combinación con
espectrina normal es indicativo del estado de portadora cuando se encuentra en una biopsia muscular de una mujer en riesgo [23]. Sin embargo, este
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Mejoras en el diagnóstico de distrofinopatías
Figura 1. Miogénesis forzada por MyoD para detección de portadoras y diagnóstico prenatal. Las células (amniocitos o vellosidades coriónicas) son
inducidas a expresar distrofina a través de la inducción viral del gen MyoD, que permite evaluar la capacidad del paciente para expresar distrofina.
Por otra parte, las células cultivadas se pueden utilizar para aislar ARN para buscar mutaciones mediante la prueba de truncamiento de proteínas.
enfoque no es suficientemente preciso (sensibilidad
global del 20% y 26% para las no portadoras de síntomas) [23]. Se recomienda utilizar sólo en manos
experimentadas y, a menudo, se considera como un
procedimiento invasivo. Aunado a lo anterior, la
miogénesis inducida en fibroblastos por MyoD es
otra alternativa para el diagnóstico de portadoras y
DP. En este sentido, las células cultivadas de los pacientes y las mujeres en situación de riesgo se utilizan para la detección de la mutación y el análisis de
proteínas. Las vellosidades coriónicas, amniocitos y
fibroblastos de la piel pueden utilizarse para realizar la miodiferenciación inducida por MyoD. La expresión de proteínas específicas de músculo revela
el defecto molecular en el paciente y en las mujeres
en riesgo [24] (Fig. 1). MyoD es un factor de transcripción clave para la diferenciación miogénica. Su
sobreexpresión en células no musculares, inducida
por vectores virales (por ejemplo, lentivirus, adenovirus o retrovirus) produce miotubos multinucleados fusionados con una estructura sarcomérica integral; después de eso, el análisis de proteínas se
lleva a cabo por Western blot e inmunofluorescencia. El primero tiene la ventaja de que permite detectar el tamaño anormal y la cantidad de distrofina
(que facilita la distinción de los casos de DMB).
Además, puede llevarse a cabo de forma múltiple,
para el diagnóstico diferencial, con otras proteínas
relacionadas con distrofia muscular [25]. La miodiferenciación con MyoD en combinación con la
prueba de truncamiento de la proteína detecta específicamente mutaciones sin sentido en la región
codificante de proteínas sintetizadas in vitro. Esta
técnica es especialmente útil cuando la mutación
causante de la enfermedad se desconoce, pero eli-
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mina o reduce significativamente la expresión de distrofina [25,26] (Tabla).
Tomando en cuenta lo antes mencionado, es evidente que hasta que se prueba la patogenicidad de
una mutación, es necesario tener una muestra biológica apropiada del individuo afectado, para integrar
análisis de ADN, ARN y de proteínas [27] (p. ej.,
Western blot, inmunohistoquimica, RT-MLPA). Esto
es muy relevante, ya que, en un estudio reciente, se
mostró que el 12% de los casos determinados como
DMD/DMB resultó estar causado por una mutación
en el residuo L276I de la proteína del gen FKRP (proteína relacionada con fukutina) localizado en 19q13.3,
que normalmente causa LGMD2I, una forma autosómica recesiva de distrofia muscular de cinturas. El
diagnóstico se realizó en casos esporádicos con variantes no detectadas, incluso después de análisis
con inmunotinción en algunos casos. Considerando
este diagnóstico erróneo, el DP ya se había hecho en
algunas familias [28]. Por otra parte, las deleciones
en el gen DMD no siempre causan enfermedad, existe la noticia de un hombre sano portador de una deleción del exón 16 del gen DMD [29].
Métodos para diagnóstico genético
Las eliminaciones mayores son las mutaciones más
frecuentes en el gen DMD (67,4%); por lo tanto, estos cambios son los que se deben analizar primero.
Las eliminaciones, duplicaciones [30-37] y algunas
mutaciones puntuales [38] pueden analizarse simul­
táneamente (Fig. 2). Después de esto, si no se determina la mutación, deben investigarse otros cambios
en el nucleótido (p. ej., sustituciones, inserciones o
241
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Tabla. Métodos para diagnóstico genético de distrofinopatías.
Mutación
Técnica
Comentarios
MLPA
Amplificación múltiple
de sondas dependientes
de ligando
Hibridación directa con sondas específicas a exones (longitud: 20-30 nt) y posterior amplificación por reacción
en cadena de la polimerasa múltiple fluorescente de sondas ligadas con cebadores universales en una fase
líquida. Permite detección simultánea de los cambios de número de copias y mutaciones puntuales con un alto
rendimiento. Cambios de una sola base cerca del sitio de ligación, podrían afectar la amplificación del producto,
debe confirmarse por otras técnicas
MAPH
Amplificación múltiple
de hibridación
Detección de cambios en el número de copias con sondas específicas a exones (longitud: 100-200 nt). Una
membrana se utiliza para fijar el ADN genómico antes de la hibridación; las diferencias en el área del pico se
relacionan entre los controles sanos y los pacientes para determinar el rearreglo. Los pequeños cambios no
afectarán la amplificación
QF-PCR-CSCE
Rearreglos grandes Electroforesis capilar sensible Es una combinación de enfoques para la detección de cambios en el número de copias y pequeños cambios de
a cambios conformacionales
(eliminaciones/
base usando 12 ensayos de reacción en cadena de la polimerasa múltiple para detectar los 79 exones del gen
y reacción en cadena de la
duplicaciones)
DMD. Sensibilidad cercana al 100%
polimerasa fluorescente
cuantitativa
Pequeñas
mutaciones
Haplotipificación
(análisis de
ligamiento)
242
Ref.
[30,31]
[32]
[33]
Reacción en cadena de la
polimerasa en tiempo real
múltiple
Utilizando SYBR Green I o sondas TaqMan se amplifican simultáneamente un gran número de exones.
El número de exones es limitado
Hibridación fluorescente
in situ
Hibridación de sondas fluorescentes en cromosomas metafásicos, núcleos en interfaz o fibras de cromatina.
El rendimiento es menor al de otras técnicas
[36]
Southern blot
Hibridación con sondas en membranas seguida de varios lavados y autorradiografía para detectar cambios en
el número de copias. Es laborioso y requiere mayor tiempo en comparación con otras técnicas (se requieren
7-9 sondas de ADNc para cubrir la secuencia codificante de 14 kb)
[37]
HRMA
Análisis de curvas
de desnaturalización
de alta resolución
Caracteriza las muestras de ADN de acuerdo con su comportamiento de desnaturalización; en su transición de
ADN de doble cadena a cadena sencilla liberan al medio una marca fluorescente a medida que se incrementa la
temperatura. La fluorescencia es continuamente colectada para mostrar un perfil de desnaturalización. Las curvas
de desnaturalización se comparan entre el tipo silvestre y las muestras mutadas
[43]
SCAIP
Amplificación con
cebador Interno
Secuenciación directa del gen DMD, método eficaz, pero el equipo especializado que se requiere y el costo
limitan su aplicación
[39]
PTT
Prueba de truncamiento
de proteína
Detecta mutaciones sin sentido a partir de ARN obtenido de músculo o linfocitos. Es técnicamente difícil
y requiere mucho tiempo
DGGE
Electroforesis en gel
desnaturalizante
de gradiente
Los amplicones se someten a una electroforesis con agentes desnaturalizantes de ADN, los dominios se disocian
de acuerdo con su perfil de desnaturalización. Se pueden encontrar cambios sutiles con una sensibilidad cercana
al 100% (se requieren 95 amplicones para abarcar el gen DMD). Conveniente para determinar pacientes y
portadoras
[40]
DHPLC
Cromatografía líquida
desnaturalizante de alta
resolución
Realineamiento de diferentes secuencias después de la desnaturalización permite la formación de heterodúplex;
alelos mutados y silvestres se pueden distinguir por diferentes tiempos de retención (se requieren 86 amplicones
para abarcar el gen DMD)
[41]
Secuenciación de ADNc
Después de realizar RT-PCR, los amplicones se secuencian directamente para buscar variantes. Una desventaja
es el alto costo de la secuenciación
[42]
SSCP/DOVAM
Debido a que las cadenas simples de ADN forman estructuras secundarias y, en función de la secuencia, tienen
Polimorfismo conformacional
diferente movilidad en electroforesis, es probable encontrar cambios de base
de cadena sencilla
[43]
STR
Repeticiones en
tándem cortas
Es más útil cuando se conoce la mutación y la historia familiar es positiva, es necesario un panel grande de
loci para un análisis preciso. Una reacción múltiple de STR tiene mayor costo-efectividad y, por tanto, es más
rentable
[59]
SNP
Polimorfismos de nucleótido
único/polimorfismo en la
longitud de los fragmentos
de restricción
Ensayos con enzimas de restricción, se puede realizar para los estudios de ligamiento. Sin embargo, los RFLP
no son una técnica de tan alto rendimiento como las otras
[62]
[34,35]
[26,46]
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Mejoras en el diagnóstico de distrofinopatías
Figura 2. Análisis de dosis por amplificación múltiple de sondas dependientes de ligación. Se detectan cambios en el número de copias de exones
después de la normalización de picos relacionados con sondas control y muestras control. En el diagrama, la deleción de los exones 24-41 del gen
de la distrofina se representa como cuadros en la parte inferior, mientras que en el electroferograma se indica con flechas.
deleciones de bases) [39-43]; sin embargo, debido al
tamaño del gen DMD, la búsqueda de mutaciones
puntuales es compleja. Recientemente, el análisis
denominado HR-MCA (high resolution melting curve analysis) se ha validado como método de presecuenciación para la detección de variantes pequeñas en pacientes con DMD y portadoras [44] (Tabla).
Estudios de detección basados en población
La variación en frecuencia y distribución de mutaciones en el gen DMD en poblaciones diferentes
tiene implicaciones importantes para el establecimiento de estrategias diagnósticas y también para
el futuro acceso de terapia génica ‘personalizada’
(p. ej., omisión de exón, lectura a través de los codones de parada) que requiere una delimitación
exacta del defecto molecular en el paciente [45].
Debido a que cambios grandes, así como cambios
pequeños de secuencia, causan el fenotipo Duchenne, la frecuencia de variantes patógenicas podría
ser diferente en poblaciones distintas sin cambiar
la incidencia de la enfermedad. Se ha sugerido que la
DMD tiene una incidencia menor en poblaciones
de origen africano y que los casos causados por
mutaciones distintas a las grandes eliminaciones
son más frecuentes (al contrario de lo que ocurre
en el mundo), pero se requieren comunicaciones
más detalladas para confirmar esta hipótesis [46].
En Singapur, la frecuencia de eliminaciones es relativamente pequeña comparada con otras poblaciones, aproximadamente del 40%, a diferencia del 72%
notificado en la base de datos Leiden [5,47]. Por
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otra parte, en este estudio, el número reducido de
individuos en las familias estudiadas puede proporcionar genealogías no informativas, haciendo difícil
de interpretar el análisis de segregación para este
grupo, por lo que la búsqueda de mutaciones puntuales es el acercamiento más apropiado para el
diagnóstico genético [47]. Una presunta alta frecuencia de eliminaciones de novo se comunicó en la
población mexicana, aunque se requieren estudios
más extensos y detallados que confirmen esta hipótesis [48]. Debemos hacer notar que varios informes sugieren que algunas familias son más propensas a cambios de novo en el gen DMD [49]. Esto fue
revelado por varios eventos de nueva recombinación/eliminación en la misma genealogía. Además,
se ha sugerido un estado premutado en algunos individuos, en los cuales secuencias repetidas en tándem pueden propiciar la inestabilidad del gen DMD,
haciéndolo propenso a rearreglos genómicos debido a mecanismos diferentes, como NHEJ (non homologous end joining) y FoSTeS (replication-dependent fork stalling and template switching) [50,51].
Detección de portadoras
Las mujeres portadoras de mutaciones en el gen
DMD normalmente no muestran el fenotipo grave
exhibido por los hombres, ya que regularmente son
heterocigotas para la mutación. Sin embargo, alrededor del 3% de las mujeres es portador manifestado (mujeres con síntomas leves de DMD) [52]. En
estas mujeres, la prevalencia de anormalidades cardíacas en el ecocardiograma y electrocardiograma
243
L.B. López-Hernández, et al
Figura 3. Marcadores genéticos descritos en el gen DMD para el análisis de ligamiento. Se muestra un gran panel de marcadores genéticos que
abarcan las regiones 5’, central y 3’ del gen DMD. En la parte superior, se observan los sitios de restricción para RFLP/SNP, y en la parte inferior, se
indican STR y los puntos calientes de deleción (URL: http://www.dmd.nl).
es del 18%, aproximadamente el 7% desarrolla cardiomiopatía dilatada, y el 12% presenta debilidad
muscular [53]. Los niveles de creatincinasa (CK) se
elevan generalmente cerca del 50-60%; no obstante,
se requiere el desarrollo de nuevas metodologías
para establecer el diagnóstico más preciso. En este
sentido, se ha observado que, en los casos en los
que la mutación altera la isoforma retinal de la distrofina (Dp260), las mujeres heterocigotas para la
mutación pueden presentar un electrorretinograma
anormal; sin embargo, debido a que este informe se
obtuvo de una sola familia, un estudio a gran escala
es obligatorio. De manera interesante, esto puede
abrir la posibilidad de detectar el estado de portadora en las mujeres usando un método no invasivo
[54]. En la mayoría de los casos, la debilidad y la
afección cardíaca no afectan significativamente las
actividades normales o la esperanza de vida [55].
Portadoras y riesgo de recurrencia
Las mujeres son portadoras obligadas de mutaciones en el gen DMD cuando tienen ya sea un hijo
afectado y otro familiar varón afectado, o cuando
tienen dos hijos afectados. En los casos de mutaciones de novo, la madre y mujeres de la familia del paciente no son portadoras y el riesgo de tener otro
hijo afectado no es diferente al riesgo que presenta
la población general. Para el caso de mosaicismo
germinal (mutación presente en las células germinales, pero ausente en las células somáticas de un
individuo originado de el mismo cigoto), en este
mismo estudio, se observó que el riesgo de recurrencia era diferente dependiendo de la localización
de una eliminación (el 15,6% para las proximales y el
6,4% para las distales), y que en el caso de las dupli-
244
caciones el riesgo de recurrencia era del 12,1% y 4,4%
para mutaciones puntuales. En los casos en los que
no se conoce el haplotipo que segrega con la enfermedad, el riesgo de recurrencia debido a un mosaicismo germinal es la mitad de los valores antes mencionados [56]. RISCALW es un software con aplicaciones para la estimación del riesgo de recurrencia
en familias con DMD. Está diseñado para combinar
diferentes tipos de mutación en función del sexo, la
estructura familiar, los niveles de CK, el contenido
informativo polimórfico y el número de marcadores
genéticos analizados para el cálculo de riesgo [57].
Marcadores genéticos para
haplotipificación en el gen DMD:
análisis directo e indirecto
Diferentes marcadores genéticos, útiles para el diagnóstico de portadoras, DP y el DGP se han identificado en el gen DMD (Fig. 3). En aproximadamente
el 20% de los casos, la muestra del varón afectado
no está disponible [58]; aun así, el diagnóstico de
portadoras, el DP y el DGP se pueden realizar; esto,
por coincidencia de haplotipos entre un pariente
sano del sexo masculino y el individuo a estudiar
(análisis indirecto) [59]. Los análisis con marcadores indirectos informativos potencialmente pueden
permitir la detección de casos familiares de CDLX
en la etapa presintomática (incluso cuando la mutación se desconoce), ya que se espera que todos los
varones afectados en una genealogía compartan el
mismo haplotipo de riesgo. Eliminaciones en el gen
DMD involucran a menudo uno o más STR o sitios
RFLP, que permiten el análisis directo de mutación
en la familia (Tabla). En esos casos, es posible excluir la condición de portadora de las madres, cuan-
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Mejoras en el diagnóstico de distrofinopatías
do son heterocigotas para los marcadores que abarca la eliminación. Aun así, el mosaicismo germinal
no se puede descartar fácilmente y se debe tomar
en cuenta para la estimación del riesgo.
Figura 4. Análisis de segregación. La hermana (II-1) de dos varones
afectados (II-3 y II-4) y un varón no afectado (II-2) no es portadora, debido a que heredó el alelo de 233 pb del marcador DXS1236 (intrón 49)
de ambos padres. Este alelo (233 bp) no se segrega con el fenotipo DMD.
La madre y los dos varones afectados tienen el alelo 241.3 pb del mismo locus, que se relaciona con el fenotipo de la enfermedad.
Análisis indirectos con marcadores genéticos
La haplotipificación o estudios de ligamiento (el establecimiento de la correlación del alelo con el fenotipo de la enfermedad a través de un análisis de pedigrí, usando marcadores genéticos) (Fig. 4) se utiliza para detectar el haplotipo en riesgo segregado en
la familia cuando la mutación se desconoce. El contenido polimórfico informativo de marcadores genéticos para haplotipificación es determinante para
alcanzar el diagnóstico. La variabilidad de estos marcadores genéticos debe probarse en una población
específica, para garantizar su utilidad como prueba
genética [60,61]. La estimación de la frecuencia de
recombinación en una población, así como la asignación de los eventos de recombinación, son esenciales para el consejo genético basado en haplotipificación. Una ventaja de los STR sobre SNP es la existencia de más alelos y mayor heterocigosidad, que
finalmente conduce a la detección de eventos de recombinación, ya que los SNP/RFLP a menudo no
son informativos [61,62]. Éstos pueden detectarse
por los estudios de segregación de haplotipos, en
dos o tres generaciónes de familias, donde meiosis
informativas son lo suficientemente representativas
del grupo de estudio. Carsana et al [63] encontraron, en 273 meiosis correspondientes a 93 familias
no emparentadas con DMD en el sur de Italia, un
24% de eventos de recombinación en el extremo 3’
del gen DMD. El grado de asociación alélica entre
pares de loci, también llamado desequilibrio de ligamiento, es una medida indirecta de la recombinación relacionada con la distancia física entre dichos
pares, y puede estimarse a partir de los datos de una
población. Un estudio demostró desequilibrio de ligamiento significativo entre dos marcadores STR en
el gen DMD: DXS1235 (intrón 50) y DXS1236 (intrón 49), de lo cual se puede concluir que los eventos de recombinación son raros entre estos marcadores [64]. No se ha descrito un desequilibrio de ligamiento significativo entre otros marcadores en el
gen DMD hasta el momento.
Diagnóstico prenatal
En 1985 se realizó por primera vez el DP en una
portadora de DMD [65]. En la actualidad, el DP se
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I
II
realiza por muestreo de vellosidades coriónicas a las
10-13 semanas de gestación, o por amniocentesis a
las 16 semanas de gestación. Hay varias noticias sobre el DP con éxito utilizando haplotipificación para
casos familiares o detección de variantes específicas
para mutaciones conocidas. Sin embargo, cuando
otras estrategias no son informativas, es necesario
usar una combinación de técnicas para establecer el
estado genético del feto. Por ejemplo, se notificaron
haplotipificación, análisis semicuantitativo múltiple
y secuenciación directa de los exones con migración
anormal en un estudio prospectivo; el análisis llegó
al diagnóstico de un varón sano y la continuación
exitosa del embarazo [66]. Similar a esto, un análisis
costo-beneficio se desarrolló mediante el uso de
PCR/IP-RR HPLC para un rápido y preciso DP por
análisis de alteraciones en el número de copias utilizando un sistema de detección basado en ultravioleta [67]. Para el DP, la confirmación por métodos independientes y la supervisión de los niveles de CK
después del parto son muy recomendables [67]. La
primera noticia de DP para CDLX debida a una eliminación puramente intrónica suprimió la expresión de distrofina en el corazón, pero no en el músculo esquelético. Este hallazgo evidenció la importancia de integrar los estudios de genómica y de
transcripción, donde el empalme de distrofina desempeña un papel crucial en la patogénesis y podría
perderse por pruebas sólo genómicas del ADN [12].
245
L.B. López-Hernández, et al
Figura 5. Diagnóstico genético preimplantacional. Se pueden utilizar diferentes métodos de determinación para realizar el diagnóstico de distrofinopatía en blastómeras o blastocistos, como FISH, reacción en
cadena de la polimerasa múltiple (para grandes rearreglos) o haplotipificación (para variantes pequeñas
o desconocidas). Algunos de estos métodos requieren la amplificación de todo el genoma.
Diagnóstico genético preimplantacional
El DGP se realiza generalmente para evitar la interrupción del embarazo en parejas con riesgo de enfermedades genéticas. El DGP puede analizar una o
dos blastómeras (biopsia de blastómera), la biopsia
de blastocistos o la biopsia de cuerpo polar (Fig. 5).
La biopsia de blastómera generalmente se realiza el
tercer día después de la fecundación, en la etapa de
ocho células. Tomando en cuenta la cantidad de ADN
de una sola célula, la extracción y análisis de una o
dos blastómeras podría originar pruebas diagnósticas con distinta eficiencia. Existe la tendencia a analizar una célula del embrión para alcanzar mayores
tasas de embarazo clínico en comparación con analizar dos células embrionarias, debido a que cuando
se toma sólo una célula hay más probabilidad de que
el embrión preserve su viabilidad [68]; esto se puede
evitar mediante la amplificación de todo el genoma
por amplificación de desplazamiento múltiple para
generar más ADN para el análisis. Este problema
también puede minimizarse por una biopsia de
blastocistos (a los cinco días después de la fecundación); sin embargo, la reducción en el tiempo para
realizar el diagnóstico genético es un tema emergente, ya que los blastocistos necesitan transferirse
a más tardar el sexto día de desarrollo in vitro y, por
lo general, sólo la mitad de embriones llega a la fase
de blastocisto [68]. Para la DMD, el DGP utilizando
marcadores genéticos polimórficos se logró inicialmente por análisis de haplotipos. El embrión que
heredó un haplotipo diferente que el del hermano
afectado fue el transferido [69]. El primer niño que
nació después del DGP para una mutación específi-
246
ca de DMD era el hijo de una portadora de una eliminación de los exones 3-18 [70]. Un análisis de amplificación para determinar cuatro exones de distrofina (6, 8, 18 y 32) y los genes para la determinación
del sexo ZFX/ZFY se hizo posteriormente. Sin embargo, el pequeño grupo de regiones analizadas limita su aplicabilidad a las familias en las que al menos uno de estos exones se elimina [71]. Desde entonces, nuevas pruebas se desarrollaron: la primera
amplifica 11 sitios en el gen DMD y el marcador de
género SRY mediante PCR anidada triple, que abarca los exones de los puntos caliente mayor y caliente
menor para deleciones [72]; la segunda utiliza MDA
para la DGP, está diseñada para la determinar seis
exones, ocho STR en el gen DMD y la amplificación
de amelogenina para determinar el sexo, y fue implementada con el 94,2% de éxito en blastómeros
[73]. El DGP también se logró mediante FISH través
del uso de sondas específicas para los exones del
gen DMD, en combinación con sondas para los cromosomas X y Y para la determinación del sexo. Este
enfoque tiene la ventaja de detectar deleciones y
duplicaciones [36] y evitar la ‘caída de alelo’ (no amplificación al azar de un alelo presente en una muestra) de los métodos basados en la PCR [74]. El DGP
es la opción más adecuada cuando se detecta mosaicismo germinal.
Biopsia de cuerpo polar
Una variante del DGP es la biopsia de cuerpo polar,
también conocida como ‘diagnóstico genético antes
de la concepción’, que evita la manipulación de embriones, ya que sólo requiere el análisis del genoma
de una célula de origen materno. La biopsia de cuerpo polar se puede lograr en un período de 16-20 horas, antes de que la fusión de dos pronúcleos sea
completada [75]. Después de la estimulación ovárica, se logra la recuperación de los ovocitos; entonces, se realiza la inyección de esperma intracitoplasmática, llevando a la liberación al primer cuerpo polar, el cual puede removerse por disección asistida
con láser para el análisis de haplotipos o la detección
de variantes patogénicas. Recientemente, se ha combinado la biopsia de cuerpo polar con haplotificación
para ocho marcadores STR en el gen DMD, originando el nacimiento de un niño libre de la mutación
de una familia afectada con DMD en los que la mutación que causa la enfermedad fue c.1055T> G [76].
Ésta es una opción valiosa para los casos en los que
las mujeres portadoras no están dispuestas a terminar el embarazo y la biopsia del embrión para DGP
no es una opción. Por ejemplo, en Alemania, la ‘ley
www.neurologia.com Rev Neurol 2011; 52 (4): 239-249
Mejoras en el diagnóstico de distrofinopatías
Figura 6. Biopsia de cuerpo polar. Cuando el primer cuerpo polar lleva una mutación homocigota, el ovocito correspondiente no se ve afectado; si
el primer cuerpo polar es heterocigoto, se requiere un análisis adicional. Tras la fecundación, pero antes de la fusión de pronúcleos, se forma el segundo cuerpo polar, que puede también ser examinado. Cuando este cuerpo polar lleva la variante patógenica o el haplotipo de riesgo, el ovocito no
se ve afectado.
de protección de embriones’ evita el DGP en blastómeras; ahí, la biopsia de cuerpo polar es la única alternativa para realizar el DGP [75]. Una limitación
de la biopsia de cuerpo polar sería un alto índice de
heterocigosidad de marcadores genéticos en los primeros cuerpos polares, porque impide cualquier
predicción sobre el estado del oocito (Fig. 6).
Conclusión
Desde 1990 han surgido varias mejoras en el diagnóstico de distrofinopatías. En la actualidad, la temprana detección es una prioridad. Hoy día, estrategias diagnósticas rentables y de alto rendimiento mejoran el diagnóstico genético que facilita el asesoramiento genético y el aumento de nuestro conocimiento de esta enfermedad frecuente y devastadora.
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Improvements in the diagnosis of dystrophinopathies: what have we learnt in these last 20 years?
Introduction. Dystrophinopathies are X-linked genetic disorders caused by mutations in the DMD gene. Genetic tests are
of utmost importance for management and genetic counseling of these diseases. However, the complexity of the DMD
gene is a challenge for diagnosis.
Aim. To describe recent advances in the diagnosis of dystrophinopathies, after 20 years since the firsts molecular assays
for genetic screening for these diseases.
Development. Currently, a variety of strategies such as automated mutation detection, cell-based methods and high
throughput haplotyping have been developed to facilitate diagnosis of dystrophinopathies, carrier detection, prenatal
and preimplantation diagnosis.
Conclusion. New technologies have improved early detection and optimal management of dystrophinopathies and have
established the basis for future molecular medicine. The most significant advances in dystrophinopathy diagnosis are
reviewed herein.
Key words. Carrier. Duchenne. Dystrophin. Preimplantation genetics. Prenatal diagnosis.
www.neurologia.com Rev Neurol 2011; 52 (4): 239-249
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