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Tinción de Gram Laboratorio
PSI Biología
Nombre____________________________________
Propósito
Distinguir entre las bacterias Gram-positivas y Gram-negativas.
Conocimientos previos
La técnica de tinción de Gram es una técnica útil para ayudar a distinguir y clasificar los diferentes
tipos de bacterias. Esta técnica se utiliza en el campo médico para ayudar a los médicos a diagnosticar
y tratar diversas enfermedades. La mancha es una mancha diferencial, ya que le permite a uno
clasificar bacterias como Gram positivos o Gram negativos en la naturaleza. Las (G+) bacterias Gram
positivas retienen una mancha violeta utilizado el método de tinción de Gram debido a que tiene una
pared célula expuesta, mientras que las Gram negativas (G-), son bacterias que no tienen una pared
celular expuesta y por lo tanto no retienen la mancha violeta. La pared celular de G+ se identifica por la
presencia de una capa gruesa de peptidoglicano que permite la a tinción de cristal violeta que se
adhieran a ella. La pared de las células G-, sin embargo, contiene una capa de peptidoglicano mucho
más delgada cubierta con un recubrimiento de lípidos-polisacárido o "cápsula". Esta cápsula se asocia
a menudo con bacterias que causan enfermedades más virulentas y el aumento de resistencia a los
antibióticos.
Las bacterias Gram negativas se pueden identificar mejor utilizando otra mancha en el método de
tinción de Gram llamado safranina. La safranina le da estas bacterias un color rojizo.
El proceso de tinción de Gram se compone de los siguientes pasos:
1. Aplicación de cristal violeta, la mancha principal. Una vez expuestas a la mancha, todas las
bacterias en una muestra parecen púrpuras bajo el microscopio.
2. Aplicación de mordiente, que también se conoce como yodo de Gram. Una vez que el
mordiente se combina con la mancha principal de cristal violeta en la pared celular de las
bacterias, adopta forma complejas de cristal violeta en su interior lo que le permite conservar
su color.
3. Aplicación de un agente decolorante, que lava la tinción primaria de cristal violeta en bacterias
Gram negativas.
4. La aplicación de una mancha secundaria llamado safranina. Esta mancha colorea las bacterias
Gram negativas de un color rojo o rosado.
Seguridad
Se deben usar guantes para evitar una contaminación cruzada.
Materiales
Microscopio
Platinas de microscopio
Lápices de cera
Asas de siembra
Mechero Bunsen
Colonia Bacterial (preparada en una placa de
agar)
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PSI Biología
Pequeño lavabo o recipiente
Tinción de cristal violeta
Iodo de Gram
Mancha de safranina
Agente decolorante: Alcohol
Papel secante
Procariotas y virus
Procedimiento
A. Preparar una mancha bacteriana con fijación de calor
1. Usando un lápiz de cera, dibuja un pequeño círculo en el centro de la platina del
microscopio.
2. Calienta el extremo en bucle del asa de siembra en el mechero Bunsen durante 10
segundos. Deja enfriar el bucle durante 1 minuto. No coloques el bucle hacia abajo
mientras se está enfriando.
3. Coloca una gota de agua en medio del círculo de cera de la platina.
4. Usando tu asa de siembra esterilizada y enfriada, obtiene suavemente una pequeña
muestra de una colonia bacteriana.
5. Mezcla suavemente el final de tu bucle de inoculación en la gota de agua en la platina.
6. Deja que la gota de agua inoculada se seque al aire.
7. Una vez seca, pasa la platina, con la mancha hacia arriba, con cuidado a través de la llama
del mechero Bunsen 3 a 4 veces. La platina está ahora fijada por el calor.
B. Manchando las bacterias
1. Sobre un pequeño recipiente o tazón, cubre la mancha con tinción de cristal violeta durante
60 segundos.
2. Enjuaga la mancha con agua destilada.
3. Cubre la mancha con yodo de Gram durante 60 segundos.
4. Enjuaga la mancha con agua destilada.
5. Gotea el alcohol de los agentes decolorantes en la mancha con cuidado hasta que la
escorrentía se haga evidente. No se debe abusar del agente decolorante.
6. Enjuaga la mancha con agua destilada.
7. Cubre la mancha con la safranina durante 45 segundos
8. Enjuaga la mancha con agua destilada.
9. Seca suavemente la mancha del lado de la platina con papel secante. No limpies la platina,
bórrala suavemente.
C. Observando las bacterias
1. Observa la mancha a 100X.
2. Observa la mancha a 1000X (con inmersión en aceite). Identifica las bacterias Gram
positivas y Gram negativas y anota tus observaciones.
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Procariotas y virus
Análisis
1. ¿Por qué se llamó a la tinción de Gram una técnica de tinción diferencial?
2. Describe la (s) estructura (s) celular(es) implicadas en la tinción de Gram.
3. ¿Por qué fue necesario colocar tu asa de siembra en la llama del mechero Bunsen?
4. ¿Por qué la solución decolorante afecta a las bacterias Gram negativas?
5. ¿Cuáles podían haber sido algunas fuentes de error para el laboratorio?
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Procariotas y virus