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Dr.SergioPAPIER MédicoTocoginecólogo EspecialistaenMedicinaReproduc6va DirectorMédicodelCEGyR(CentrodeEstudiosenGené6cayReproducción) ExPresidentedeSAMeR(SociedadArgen6nadeMedicinaReproduc6va) PresidentedeALMeR(AsociaciónLa6noamericanadeMedicinaReproduc6va) Seleccióndegametosyembriones JornadadeActualizaciónen MedicinaReproduc?va POSTASRM “Seleccióndegametosy embriones” SimposioALMER-ASRM 21Octubre2016 San?agoMunné GastónReyValzacchi Cris?anAlvarezSedó WorkshopALMER 10-11-12marzode2016 "TrasplanteUterinodelaUtopíaalaRealidad" AMÉRICASTOWERSHOTEL Libertad1070-CiudadAutónomadeBuenosAires,ArgenCna Directores: Dr.MatsBrännström(Suecia) Dr.SergioPapier(Argen?na) DirectoresdelCursoPrác6co: Dr.Sebas?ánGogorza(Argen?na) InvitadosExtranjeros: Dr.MatsBrännström(Suecia) Dr.NiclasKvarnstron(Suecia) Dr.CesarDíaz(España) Organiza ALMER|AsociaciónLa?noamericanadeMedicinaReproduc?va conlaColaboracióndel ServiciodeGinecologíadelHospitalItaliano. ARANCELES:Teórico:$1.000-TeóricoyPrác?co:$3.000(ARGENTINOS) Teórico:u$s100-TeóricoyPrác?co:u$s300(EXTRANJEROS) CUPOSLIMITADOS ALMERlAsociaciónLa?noamericanadeMedicinaReproduc?va Viamonte14301°Piso,of.510-CiudaddeBuenosAires-Argen?na [email protected] Clasificación de blastocistos ü Blastocele ü MCI ü Trofoblasto Gardner y col. 2002. Journal of Reproductive Inmunology; 55: 85-100 Glujovskyetal.,2012 Gardner y col. 2000. Fertil and Steril; 73: 1155-1158 Limitantesypreguntasquesurgen • ResultadosdetrabajosRCTsencuantoamorfología embrionaria? • Loscriteriosmorfológicospuedenseru6lizadosentodoslos pacientes? Pérdidadecorrelaciónconlaimplantacióncuandoincrementalaedadmaterna(Stensen,2010) • Puedelamorfologíaseru6lizadaentodosloslaboratoriosdela Mismamanera?Existenconsensos? Limitantesypreguntasquesurgen • Variabilidadintraeinterobservador(Paternot,2009). • No invasivo? , requiere excelentes condiciones del LaboratoriodeEmbriología • Engeneralnomuestrabuenacorrelaciónconlagene6cadel embrión,sobretodoenERA La correlación entre la morfología y la implantación siguen siendobuenas….perosepuedenmejorar TIMELAPSE • 53%delosblastocistosseleccionadosfueron aneuploides* • Nohaydiferenciaen%deaneuploidíasentre blastocistoslentosyrápidos** Euploid Euploid Complex abn. trisomy 21,22 *Melzer K, McCaffrey C, Colls P, Munne S, Grifo J. (2013) **Stevens,a M. Rawlins,a A. Janesch,a N. Treff,b W. B. Schoolcraft,a M. G. Katz-Jaffe (2012) Capalboycols.,2014 AlvarezSedóycols.,2015(ASRM) Genómica Análisis genómico: Estudiando la constitución del ADN de las células Indicación Riesgo Cariotipo Screening Solución portadores Infertilidad y Fallas en la implantación edad materna 50-80% avanzada aneuploidia Normal Normal Aborto Aborto recurrente translocación Normal PGD y PGS Aborto Aborto recurrente Normal Normal PGS Historia familiar, Grupo étnico Enfermedades Normal genéticas Pareja portadora PGD para mutación Infertilidad Variantes génicas Normal Marcadores Tratamiento de personalizado infertilidad Edad paterna avanzada Mutaciones de novo, autismo Normal Normal PGS PGD completa secuenciación Biopsiadeblastocisto,estudiodetodoslos cromosomasytransferenciadiferida ventajas: • MasADN:menosnoresultados • Menosmosaicismo=menoserrores • Reduceelimpactodelabiopsia • Menosembrionesabiopsiar • FacilitaSET Transferenciaaunendometriomasrecep?vo Aneuploidiaincrementaconla edadperonoconelnumerode embriones #de blastocisto OvoDon s %Euploides <3535-37 38-40 41-42 >42 años años años años años 1-3 58% 61% 51% 39% 22% 13% 4-6 62% 60% 52% 38% 23% 17% 7-10 65% 62% 51% 36% 21% 14% >7-10 68% 63% 55% 37% 25% n/a N=4,747ciclosy29,803embriones,hasta12/2013. Ata,Munneetal.(2012)ReprodBiomedOnlineydatosnopublicadosdeReprogeneHcs ElPGS(arrays)eliminanelefectodelaedad maternaenlatasadeimplantación 60% implnatacion 50% 40% 30% No PGS * SART 20% PGS (aCGH) ** blastocyst 10% n/a 0% <35 35-37 39-40 Edadmaterna 41-42 >42 * SART 2011 ** Harton, Munné et al. (2013) Fertil Steril. And unpublished data to 8/2013. N >800 blast biopsies Abortoespontaneodespuésde PGS ComparadoanoPGS(SART): 40% 35% 30% 25% 20% 15% 10% 5% 0% SART ComparadoaotrosDGPs: Embara zos edad % aborto Hartonet 307 al.2013 34.9 7.5% Scoeet al.2013 32.2 8.3% 72 <35 35-37 38-40 41-42 Hartonetal.(2013)Fer6lSteril,+datosnopublicados,Reprogene6cs Estudiosrandomizados: Meta-Analisis Tasas de implantación: Control Yangetal.2012(arrayCGH) 46% Scoeetal.2013(qPCR) 63% Formanetal.2013(qPCR) 40% TOTAL 53% PGS 69% 80% 58% 73% P<0.001 Resultadossegunelcentrode infer?lidad promedio rango Signif. causa Embrionessin resultado 3.1% 1%-14% P<0.001 Competenteen biopsia Aneuploidiaen Ovodonación 33.5% 20%-51% P<0.001 Selección,Cul?vo, es?mulación P<0.01 Soporte faselútea, mozaicismos,causas génicas,recep?vidad endometrial Tasadeaborto despuesdePGS 10.3% 5%-28% EstosfactoressonindependientesdelaedadmaternaeindicaciondePGS LatasadeabortodespuesdePGSesindependientedelaedadmaterna(Hartonetal.2013) DatosdeReprogene6csencentrosconmasde>40ciclos TodoslosestudiosdeDGPparaA.R. muestranundescensoenabortos WerlinL,etal.(2003)Preimplanta6ongene6cdiagnosis(PGD)asbothatherapeu6cand diagnos6ctoolinassistedreproduc6vetechnology.Fer6lSteril,80:467 Munnéetal.(2005)Preimplanta6ongene6cdiagnosisreducespregnancylossin women35andolderwithahistoryofrecurrentmiscarriages.Fer6lSteril84:331 Garrisietal.(2009)Effectofinfer6lity,maternalage,andnumberofprevious miscarriagesontheoutcomeofpreimplanta6ongene6cdiagnosisforidiopathic recurrentpregnancyloss.Fer6l.Steril92:288 Rubioetal.(2009)PrognosisfactorsforPreimplanta6onGene6cScreeninginrepeated pregnancyloss.ReprodBiomedOnline Hodes-Wertzetal.(2012)Idiopathicrecurrentmiscarriageiscausedmostlybyaneuploid embryos.Fer6lSteril.98(3):675-80 Tasadeabortodependiendode latécnicadePGSusada Técnica NoPGS1 aCGH2 qPCR3 qPCR4 SNP5 NGS edad Abortos 35.0 18.2% 34.9 7.5% 32.2 38.6 8.3% 10.5% ??? ??? ??? ??? 1SART2012,2Hartonetal.(2013)Fer6lSteril,andReprogene6csunpublisheddata, 3Scoeetal.2013,4Formanetal.2012,HumReprod27:1217,5(Natera) PGSypérdidarecurrentedelembarazo maternal age <35 ≥35 Total preg. cycles %loss expected %loss awerPGD 27 p<0.001 59 p<0.001 26.3% 3.7% 36.7% 8.5% 89 p<0.001 33.5% 7.0% Grifoetal.(ASRM2011) Disminucióndelatasadeabortos enpacientesconA.R:datosconaCGH Díade Biopsia día3 día5 Total embarazos %abortos esperados %abortos conaCGH 59 p<0.001 40 p<0.001 36% 9% 42% 3% 99 p<0.001 38% 7% Grifoetal.(2012)FerHlSteril Blastocistosnecesariosparaobtenerla máximatasadeembarazo Edad materna 30-34 35-39 40-42 tasa euploidia blastocistos necesarios* 70% 53% 33% 4.3(3euploides) 5.7(3euploides) 9.1(3euploides) *ParaquelatasadeembarazoconSETseaigualaDETserequieren3blastocistoseuploides Banqueodeembriones:Ventajas - Menorfa6gadelpaciente:noserindeantesde quedarseembarazada - PGDmaseconómico:solounoparavariosciclos - Mayorposibilidadesdeéxito - Nosepierde6empoentreciclosfallidos Conclusiones:PorquePGS? • Segúnlaedadmaterna,el30-80%delosembriones sonaneuploides • Losembrionesaneuploidesnoimplantan,abortano naceunniñoconanomalíacromosómica • ElerrordelPGSesbajo(<2%) • Labiopsiadeblastocistonodaña PortantoelPGSybiopsiadeblastocisto: • IncrementalatasadeImplantación • Eliminaelefectodelaedadmaternaenla implantaciónyriesgoenelRN DGPdetranslocaciones:Todoslosestudios muestranunadisminuciónenabortos DGPparatranslocaciones: • Munnéetal(1998).Spontaneousabor6onsarereducedaperpre-concep6ondiagnosisoftransloca6ons.J AssistedReprodGenet290: • MunnéSetal.(2000)OutcomeofPreimplanta6onGene6cDiagnosisoftransloca6ons.Fer6lSteril.73:1209 • Verlinskyetal.(2005)Preimplanta6ontes6ngforchromosomaldisordersimprovesreproduc6veoutcome ofpoorprognosispa6ents.ReprodBiomedOnline11:219 • MunnéS(2006)Preimplanta6ongene6cdiagnosisfortransloca6ons. HumReprod21:839 • Otanietal.(2006)Preimplanta6ongene6cdiagnosissignificantlyimprovesthepregnancyoutcomeof transloca6oncarrierswithahistoryofrecurrentmiscarriageandfailingtoproducealivebirth.Reprod BiomedOnline13:879 • FischerJ,CollsP,EscuderoT,MunnéS(2010)Preimplanta6onGene6cDiagnosis(PGD)improvespregnancy outcomefortransloca6oncarrierswithahistoryofrecurrentlosses.Fer6lSteril,Inpress ValidacióndeaCGHpara Translocaciones+Aneuploidia • 0%-2%deerroresconaCGH(a,b) • Todaslas931translocacionespreviamenteestudiadasporFISH puedenseriden6ficadasconaCGH(a) Gain3q Loss11q Pa6ent:46,XY,t(3;11)(q22.2;q23.3) Tel3p(green) Tel3q(orange) Cent11(green) Tel11q(orange) a:Collsetal.(2012)RBO,b:FiorenHnoetal.(2011) HumanReprod Translocacioneseinfer?lidad: Altatasadeanomalíascromosómicas Robertsonianas Reciprocas ciclos embriones normales sin transferencia 34 76 27.5% 16.5% 36% 54% Fioren6noetal.(2011)HumanReprod+Collsetal.(2012)RBO DGP para monogénicas SepuedehacerDGPparacualquierenfermedadconunamutaciónconocida. >300enfermedadestratadasconDGP: Acetil Co Oxidase type I defficiency, Adrenoleucodistrophy, Alphathalassemia, Alport syndrome, Autosomal Dominant Polycystic Kidney Disease (ADPKD), Autosomal Recesive Polycystic Kidney Disease (ARPKD), Beta-thalassemia, Branchio-Oto-Renal syndrome (BOR), BRCA1 breast cancer predisposition, BRCA2 breast cancer predisposition, CanavanCharcot-Marie-Tooth type IA (CMT1a), Choroideremia, Congenital adrenal hyperplasia (CAH), Congenital neutropenia, Connexin 26 hearing loss, Cystic fibrosis, Duchenne/Becker Muscular Dystrophy (DMD), Ectrodactyly, Ectodermal dysplasia, and Cleft lip/palate syndrome (EEC1), Fabry Disease, Familial adenomatous poliposis coli (FAP), Familial dysautonomia, Familial intrahepatic cholestasis 2, Fanconi anemia, Fragile site mental retardation , Gangliosidosis type 1 (GM1), Gaucher disease, Glomuvenous malformations (GVM), Glycogenstorage disease type I (GSD1), Glycosylation type 1C, Hemoglobin SC disease, Hemophilia A, Hemophilia B, Hereditary nonpolyposis colon cancer (HNPCC), Hereditary pancreatitis, HLA matching Huntington disease, Hurler syndrome, Hypophosphatasia, Incontinential pigmenti, Krabbe disease (Globoid cell leukodystrophy), Long QT syndrome, Marfan syndrome, Meckle gruber, Metachromatic leukodystrophy (MLD), Methylmalonic aciduria cblC type (MMACHC), Myotonic Dystrophy 1, Myotubular myopathy, Neurofibromatosis 1, Neurofibromatosis 2, Niemann-Pick Disease, Noonan syndrome, Oculocutaneous albinism 1 (OCA1), Ornithine carbamoyltransferase deficiency (OTC), Osteogenesis Imperfecta 1, Rapp Hodgkin ectodermal dysplasia, Retinitis pigmentosa, Retinoblastoma, Sickle Cell Anemia, SmithLemli-Opitz syndrome (SLOS), Spinal bulbar muscular atrophy (SBMA), Spinal Muscular Atrophy Type 1 (SMA1), Tay Sachs, Tuberous sclerosis 1 (TSC1), Tuberous sclerosis 2 (TSC2), Von Hippel-Lindau Syndrome (vHL), X-linked dominant Charcot–Marie–Tooth (CMTX), etc…… (see review Gutierrez et al. (2008)) CombinacióndePCRyaCGH Análisisde PCR Amplificación análisisaCGH Pratesetal.(2012)Fer6lityandSterility98:S137 RequiresBlastocystbiopsy CombinacióndePCRyaCGH Ciclos: Enfermedades: Edadmaterna: Blastocistosconresultados: Noafectadosyeuploides: Portadoresyeuploides: Afectadosyeuploides: Aneuploides: 43 25 33.6 93% 18% 10% 25% 47% Pratesetal.(2012)ASRMandReprogeneHcsunpublishedresults Mejortasadeembarazosise hacePGD+PGS edad PGD 31.6 Embarazo/ transferencia 54% PGD+aCGH 32.3 86% Pratesetal.(2013)Fer6lSteril,ASRMplusunpublishedReprogene6csdata <0.05 DiferenciasentremétodosparaPGDde enfermedadeshereditarias PCR PCR+ aCGH SNP arrays* NGS no si si no si si si si no si si si no si no si si no no si Detectaaneuploidia Detectadefectosgénicos 1-2mesesdepreparación Requiereunfamiliarafecto Aplicableacualquiercaso *KaryomappingusandoBlueGnome ValidacióndeNGSparaDGP Tasadeerror: BlastocistospreviamenteanalizadosconaCGHfueron reanalizadosciegamente: 62/62euploides 131/131aneuploides 100%concordancia Kung et al. (2013) ESHRE (n=145) y datos de Reprogenetics no publicados (n=50) NGSymozaicismos NGS:+7pter-p15.2andmosaicmonosomy1and10 aCGH:+7pter-p15.2andmonosomy1and10 Fragouliycols.,2014/2015 Primerasecuenciacióncompleta debiopsiasdeembrión • Seanalizaron>20biopsiasdeblastocisto • Plataforma:CompleteGenomics • Sesecuencióun97%delgenoma • Unpromediode20genesfuncionalesestabanafectadospor embriónperosolo1/20erangenesconfunciónconocida. PROBLEMA:DEMASIADAINFORMACION • Seencontraron3000variacionesdenovoporembrión,con solo30deellasconefectosnega6vosconocidos Pietersetal.,CompleteGenomicsandReprogene6cs,unpublished Queventajastendríala secuenciacióncompletaenPGD? • Con<10%secuenciadosepuedendetectarsimultaneamente anomaliascromosómicasygénicas(conscreeningpreviodelos padres). Queventajas6enesecuenciartodoelgenomaembrionario? • Laedadpaternaestaligadaaunaumentoenlas mutacionesdenovo(1) • Unpadrequetenga45añosomas6enex3.5vecesmas riesgodetenerunRNconau6smoyx2.7vecesmascon sindromebipolarqueunpadrede<25años(2) (1):Kongetal.2012,Nature,(2):D’Onofrioetal.2014,JAMA Estrategiasdeseleccióny terapeúCcaespermáCca Dr. Gastón J. Rey Valzacchi Sección Andrología y Reproducción - Hospital Italiano de Buenos Aires Procrearte – Red de Medicina Reproductiva y Molecular Evaluaciónandrólogicaydelapatologíaespermá?ca • Teratozoospermiasevera(0%denormales)seasociaconmenortasade implantación • ShoukirY,HumReprod13:1632,1998 • Lallegadaablastocistoesmenorenalteracionesespermá6casseveras • Balaban,HumReprod16:125,2001 • EnODhayhombresqueformanrepe6damenteembrionesdepobre calidad • TesarikJ,HumReprod17:184,2002,TesarikJ,HumReprod19:611,2004 • LoshombresconNOA6enenmenortasadeimplantaciónyembarazo • PasqualoRoF,etalFertSteril83,606,2005 • LospacientesconNOA6enenmayornúmerodeembrionescon alteracionescromosómicas. • SilberS,FertSter2003 Factorac?vadorespermá?co(PLCζ) BerridgeMJ,2009 Posibilidadesdetratamiento • Ionoforodecalcio(A23187,ionomicina),producen elevacióndeCanoconlospicos|picos • InyeccióndeARNmPLCζ(experimental,di~cila imitarlospicos,puedeincorporarsealgenomapor transcriptasareversa) • InyeccióndePLCζrecombinante(experimental,no evidenciasenhumanos,muyinestableperdiendo ac6vidad) ARTIFICIALOOCYTEACTIVATIONWITHCALCIUMIONOPHORE(A+23187) FOLLOWINGICSIFERTILIZATIONFAILURE A.Sdrigo•,G.J.ReyValzacchi,F.A.LeocataNieto,V.E.Canada. BuenosAires,Argen6na.PROCREARTE Fer?liza?onrate onpreviouscycle (%) (mean) Fer?liza?onrate withcalcium ionophore(%) (mean) Pvalue 0–20% 10,87 55,57 0,003 21–35% 27,34 57,9 <0,001 36–49% 43,46 75,23 <0,001 Fer?liza?on category Sospechadedeficitcentriolar Evaluacióndefuncióndelcentrosoma Selecciónespermá?caporIMSI Formacióndeaster 80,5% 33,3% UgainT,JAssistReprodGenet2010 Desarrolloembrionario • Lamayoríadelosgenespaternoscomienzana expresarseenelembriónenelestadode4a8 células • Braude1988 • AlteracionesenelADNseasociaríaapobre desarrolloembrionarioluegodel3erdía • Tesarik2004 Técnicasparaladeterminacióndela fragmentacióndelADNespermá?co • Fragmentacióndirecta – Tunel:UnióndedUridinaTP+citometríao microscopía • Desnaturalizacióninducida – SCSA:Naranjadeacridina+citometríadeflujo – Comet:Electroforésis+fluorescencia AnexinaeICSI Grupo estudio Grupo control 122 74 Tasa de fertilización 69,5 % 69,9 % NS Tasa de clivaje 97,2 % 88,2 % <0.01 Tasa de embarazo químico 61,4% 45,9 % <0.05 Tasa de embarazo clínico 48,3 % 36,4 % 0.05 Casos Valor p Dirican EK J Assist Reprod Genet 2008 Columnasdeanexinaenovodonación AlvarezSedóC TUNEL+ ANEXINASI TUNEL+ ANEXINANO TUNEL- N 76 35 44 Embarazoclínico (%) 43 23* 46 Tasade implantación(%) 29 14* 30 *p<0.05 PICSI Grupo estudio Grupo control 125 107 93,4 % 87,1 % NS Tasa de clivaje 95 % 84 % <0.01 Embriones G1 35,1% 22,3% 0.011 Tasa de embarazo clínico 32,3 % 21,6 % 0.163 17,1% 10,3% 0.047 Casos Tasa de fertilización Tasa de implantación Valor p Parmegiani J Assist Reprod Genet 2010 Anexinavs.PICSI Anexina PICSI 59 41 Tasa de fertilización 82 % 79 % NS Tasa de clivaje 82 % 89 % NS Tasa de embarazo 37% 34 % NS Tasa de implantación 21 16 NS Tasa de aborto 30 % 38 % NS Casos Valor p Rey Valzacchi G y col 2011 Deficit Manifestación Diagnós?co Tratamiento ARN -Pobredesarrollo embrionario temprano Transcriptoma InyeccióndeARN? PLCζ Fallaobaja fer6lización Inmunomar cación Westerblot Ac6vación ovocitariaar6ficial Centrosoma -Detenciónen pronucleos -Embriones caó6cos -Microscopía electrónica -Testconovocitos porcinos -IMSI -Inyecciónde colas? Nuclear -Pobredesarrolloa Estudiosde blastocisto fragmentaciónde -Fallaimplantatoria ADNespermá6co -Aborto -Anexina -PICSI -TESE Mensaje para llevar a casa….. • Seleccióndelmejorembrión:PGSeselmejor marcador,integracióndelasdiferentestécnicasde selecciónembrionaria • SeleccióndeEspermatozoides:Evaluaciónadecuada delfactormasculinoydedelapatología espermá6ca.Necesidaddeestudiosquevalidenlos tratamientospropuestosypoblaciónquesebeneficie.
