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Seminarios en Biotecnología y
Bioseguridad de OGMs
Agro-infiltración (expresión transitoria por
transformación de Agrobacterium)
Dra. Rocío Díaz de la Garza
ITESM
14 de noviembre de 2014
10:00 a 12:00 Hrs
Agro-infiltración
(expresión transitoria por transformación de
Agrobacterium)
TRANSFORMACIÓN ESTABLE vs
TRANSITORIA EN PLANTAS
UNA TRANSFORMACIÓN
ESTABLE SIGNIFICA QUE ES
HEREDABLE
PARA QUE ESTO SUCEDA, EL
ADN FORÁNEO DEBE DE
INTEGRARSE AL GENOMA
NUCLEAR O AL DEL
CLOROPLASTO DE LAS
CÉLULAS GERMINALES
EN UNA TRANSFORMACIÓN
TRANSITORIA EL ADN
FORÁNEO NO SE INTEGRA AL
GENOMA DE LA CÉLULA EN
TODOS SUS TEJIDOS (ÓVULOS
O POLEN)
¿PARA QUÉ TRANSFORMACIÓN TRANSITORIA
EN PLANTAS?
DOGMA CENTRAL DE LA
BIOLOGÍA MOLECULAR
TRANSCRIPCIÓN
TRADUCCIÓN
A. ADN (ácido
desoxirribonucleico)
B. mARN (ácido
ribonuleico mensajero)
C. tARN (transferencia)
D. Ribosoma
E. Proteína
Las proteínas pueden ser
estructurales o pueden ser
enzimas (catalizadores
biológicos) que generen
compuestos de interés
¿PARA QUÉ TRANSFORMACIÓN
TRANSITORIA EN PLANTAS?
TRANSCRIPCIÓN
TRADUCCIÓN
Aún si el ADN no se integra al núcleo en
todos los tejidos, éste puede leerse para
generar proteínas de interés en la célula
vegetal por un corto tiempo
Estas proteínas por lo general son de alto
valor (farmacia)
También esta transformación es muy
rápida (toma días expresar una proteína) y
en el laboratorio es una técnica muy útil
para estudiar múltiples aspectos de la
biología vegetal desde el punto de vista
científico
TRANSFORMACIÓN VEGETAL
• DOS TÉCNICAS BÁSICAS
– AGROBACTERIUM (TUMEFACIENS o
RHIZOGENES)
• Transfiere el ADN a la célula vegetal y puede dar
transformantes estables o transientes dependiendo
del método de transformación
– BIOBALÍSTICA
• Utiliza micropartículas de oro o tugnsteno cubiertas
de ADN y las dispara al tejido vegetal
• Genera transformantes estables cuando el ADN se
incorpora al genoma del núcleo o cloroplasto de la
célula
AGROBACTERIUM TUMEFACIENS
Agrobacterium tumefaciens
Agalla de corona
• Bacteria fitopatógena que
se encuentra usualmente
en suelos y causa la
enfermedad conocida
como agalla de corona en
las plantas
• Esta bacteria tiene la
habilidad de transferir
genes a las plantas para
que éstas produzcan
metabolitos que
benefician a la bacteria
TRANSFERENCIA DE ADN DEL
AGROBACTERIUM A LA PLANTA
Los genes que
normalmente transfiere
son para que la planta
genere compuestos que
sirven de alimento al
Agrobacterium y además
genes que ocasionan un
crecimiento indeterminado
de la célula vegetal
USO DEL AGROBACTERIUM EN
BIOTECNOLOGÍA VEGETAL
Estos genes de la
bacteria se cambian
por los de interés
Ti = Tumor- inducing plasmid
Así, el Agrobacterium le
puede transferir a la célula
vegetal genes de cualquier
origen (vegetal, animal,
bacteriano, etc.)
¿Cómo se genera una transformación
estable?
• A través de cultivo de tejidos in vitro
– Se infectan tejidos de la planta con el Agrobacterium que
contiene nuestro gen de interés y otro de resistencia a un
herbicida/antibiótico
– Se cultivan los tejidos in vitro y se induce la formación de una
planta con el uso de fitohormonas
Planta resistente al
herbicida/antibiótico
Alta posibilidad de que
esté transformada de
manera estable (sus
semillas serán
transgénicas y generarán
plantas transformadas
también)
¿Cómo se genera una transformación
transitoria?
• También se utiliza Agrobacterium
• Pero no hay regeneración de una planta completa
• Se realiza por medio de infiltración del Agrobacterium a
la célula vegetal
• Usualmente se utilizan vectores virales para tener más
proteína acumulada en los tejidos de la planta
Chen et al., Adv Tech Biol Med 2013
USO DE VECTORES VIRALES
Las primeras transformaciones transitorias tomaron ventaja
de la capacidad de los virus de viajar a través de la planta
(movimiento sistémico) para que así se expresara el
transgén en la planta entera
Gleba et al., Cur Op Plant Biotech 2007
COMPOSICIÓN GENÉTICA DE UN
VECTOR DE VIRUS COMPLETO
Gleba et al, Cur Op Plant Biol 2004
Vectores basados en el virus
VIRUS DEL MOSAICO DEL
TABACO (TMV siglas en inglés)
TIENE LA CAPACIDAD DE REPLICARSE
EN LA PLANTA Y FORMAR
PARTÍCULAS VIRALES
P - Promotor
TMV Pol – RNA- dependiente RNA polimerasa
para la producción del mensajero
MP – Proteína de mobilidad
GOI – Gen de interés
CP – Proteína de la cápside
T - terminador
Nota: estos virus utilizados son fitopatógenos, es
decir no representan ningún riesgo para la salud
humana, sólo infectan plantas
VECTORES VIRALES
Zhang et al., Plant Methods 2013
• Las plantas se infectan
ya desarrolladas con
virus que expresan
nuestro gen de interés
• Los virus se pueden
mover sistémicamente a
través de la planta
– Se infecta una célula
vegetal
– El virus se mueve de
célula a célula a través
del plasmodesmata
(canales de
comunicación que
existen en células
vegetales)
Virus del mosaico del narciso
utilizado como vector para producir
antocianinas
VECTORES VIRALES
“DECONSTRUIDOS”
• La desventaja de utilizar virus completos
es que la planta emplea muchos recursos
en sintetizar las proteínas de la cápside
viral
• Así, se empezaron a modificar estos
vectores para que ya no la expresaran
X
X
Gleba et al, Cur Op Plant Biol 2004
VECTORES VIRALES “DECONSTRUIDOS”
Además se han hecho otros cambios en la
secuencia de los vectores para que tuviera
mejor expresión de los genes en la célula
vegetal
Aumentos en
eficiencia de
transfección y en los
niveles de expresión
de la proteína verde
fluorescente (GFP)
Marillonnet et al., Nat Biotech 2005
Marillonnet et al., Nat Biotech 2005
VECTORES DECONSTRUIDOS
PARA INFILTRACIÓN
• magnICON® - Vectores producidos por Icon Genetics
(compañía alemana). Son los más utilizados para las
“magninfecciones” con Agrobacterium. Este sistema está
basado en el virus del mosaico del tabaco (TMV) y el
virus X de la papa
• Sistema de replicación de ADN geminiviral. Está basado
en el virus del mosaico enano amarillo del frijol (BeYDV)
• Sistema de replicación basado en el virus del mosaico del
caupí (CPMV)
Vectores virales
deconstruídos
Estas mejoras han dado
como resultado que se
necesite menos
concentración de
Agrobacterium para
infectar con mayor
eficiencia la planta y una
mayor expresión de las
proteínas de interés
Más células transfectadas
Chung et al., 2005
DIFERENCIAS EN EXPRESIÓN DE VECTORES
VIRALES COMPLETOS Y DECONSTRUIDOS
Las partículas virales
completas viajan a través del
floema de la planta hacia
tejidos jóvenes
Infectando con Agrobacterium
que contiene los vectores
deconstruidos (que inclujyen
una proteína de movilidad), en
una semana se cubre casi toda
la superficie foliar
Gleba et al., Cur Op Plant Biotech 2007
AGROINFILTRACIÓN
Chen et al., Adv Tech Biol Med 2013
A nivel laboratorio se puede hacer con una jeringa
A. Primero se realiza una pequeña herida en el envés de la hoja (en la figura
se muestran hojas de Nicotiana benthamiana de plantas de 6 semanas)
B. Luego se agrega la solución del Agrobacterium tumefaciens ya
modificado con el vector viral y el gen de interés utilizando una jeringa
sin aguja a través de la herida en los espacios intracelulares de la hoja
AGROINFILTRACIÓN DE PLANTA COMPLETA
UTILIZANDO VACÍO
La aplicación del vacío fuerza la
formación burbujas de aire fuera de
los estomas, entonces cuando se
libera, entra con mayor facilidad del
Agrobacterium por los estomas
(orificios en las plantas en donde se
realiza el intercambio de gases)
Loh&Wayah, Asian Journal of Biotechnology, 2014
Al sumergir toda la planta en una solución
diluida del Agrobacterium, y aplicar vacío se
busca que entren miles de células en todas las
hojas de la planta
EXPRESIÓN DE PROTEÍNA
FLUORESCENTE DESPUÉS DE
LA AGROINFILTRACIÓN
JERINGA
VACÍO
ASPERJADO DE
SOLUCIÓN DE
AGROBACTERIUM
Chen et al., Adv Tech Biol Med 2013
ESCALAMIENTO
Gleba et al., Cur Op Plant Biotech 2007
COMPAÑÍAS PRODUCTORAS DE PROTEÍNAS
RECOMBINANTES EN PLANTAS
Produce vacunas y
proteínas
terapéuticas en
plantas a través de la
expresión transiente
Prueba clínica fase II
en vacuna contra la
influenza H5N1
Va a empezar fase II
en vacuna
tetravalente contra
H1N1, H3N2 y dos
influenzas B
http://www.medicago.com/English/Technologies/medicago-technologies/default.aspx
COMPAÑÍAS
Chen et al., Adv Tech Biol Med 2013
ZMAPP – COCTEL DE ANTICUERPOS
MONOCLONALES CONTRA EL ÉBOLA
PROTEÍNAS TERAPÉUTICAS
DISEÑADAS POR MAPP
BIOPHARMACEUTICAL,
COMPAÑÍA QUE CONTRATÓ
A KENTUCKY
BIOPROCESSING PARA
PRODUCIRLAS EN PLANTAS
DE TABACO
TRANSFORMADAS DE FORMA
TRANSIENTE
COMO RESPUESTA AL
CONTAGIO DE
TRABAJADORES
ESTADOUNIDENSES Y
ESPAÑOLES EN AFRICA, SE
LES PROPORCIONÓ EL SUERO
EXPERIMENTAL COMO
TRATAMIENTO
OTRAS VACUNAS
Y PROTEÍNAS
TERAPÉUTICAS EN
DESARROLLO
Gleba et al., Curr Topics in Microbiology &
Immunology 2013
ENSAYOS PRECLÍNICOS DE PROTEÍNAS GENERADAS EN
PLANTAS AGROINFILTRADAS CON VECTORES VIRALES
Gleba et al., Curr Topics in Microbiology &
Immunology 2013
VENTAJAS DE LA PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS
TERAPÉUTICAS EN PLANTAS vs. CÉLULAS DE MAMÍFERO




COSTOS DE PRODUCCIÓN
RENDIMIENTO
RAPIDEZ EN EXPRESIÓN
RAPIDEZ EN MANUFACTURA
*datos traducidos de
PNAS 2006, 103:14645
Sistema de expresión
Tiempo para obtener
miligramos de
anticuerpo
Tiempo para obtener
gramos de anticuerpo
Cultivo de células de
mamífero
2-6 meses
6-12 meses
Animales transgénicos
> 12 meses
> 12 meses
Plantas transgénicas
estables
12 meses
> 24 meses
Magnifection
(expresión transitoria
con magnICON®)
14 días
14-20 días
AGROSPRAY
• Tecnología desarrollada por Nomad
Bioscience GmbH, donde se asperja
Agrobacterium con surfactantes
(detergentes)
• Esta tecnología está en etapas
tempranas, pero tiene gran
potencial en agricultura y
manufactura de biomateriales
• En agricultura se podría
“reprogramar” transitoriamente un
cultivo para ser resistente a plagas,
a estrés abiótico o mejorar la
producción de compuestos
• Las plantas no serían transgénicas y
sólo se tendría que comprar el
producto a asperjar
Chen et al., Adv Tech Biol Med 2013
Esta técnica de transformación transitoria está desarrollándose
y representa un potencial para mejorar cultivos en
invernadero o en el campo. Se tendría que crear un marco
regulatorio para liberar Agrobacterium transformado (en el
caso de asperjar en campo)
REGULACIÓN
• Todavía no existe un producto de expresión
transitoria de plantas aprobado por alguna
agencia regulatoria
• Hay discusiones preliminares en cómo regular
estas plantas modificadas para su expresión
transitoria y cómo manejar los productos de éstas
• Aun no existen guías claras sobre su regulación
• La agroinfiltración está considerada como una
técnica nueva de mejoramiento vegetal en la
mayoría de los foros
TALLER DE REGULACIÓN ORGANIZADO POR LA UNIÓN
EUROPEA 2012 (JRC- Joined Research Center)
PARTICIPARON DELEGACIONES DE
ARGENTINA, AUSTRALIA,
CANADÁ, JAPÓN, ESTADOS UNIDOS
Y SUDÁFRICA
DEFINICIÓN - FAO
DINAMARCA
Agroinfiltración de flores: Puede llegar a
dar plantas transformadas
• Se utiliza en el laboratorio
muy comunmente para
transformar Arabidopsis,
la planta modelo
• En otras plantas es difícil
utilizar esta técnica
• Se transforman células
germinales y las semillas
pueden llevar el transgén
Arabidopsis thaliana — photo by Vijay Singh
Procedimiento
Se sumergen las plantas
con inflorescencias en
medio con
Agrobacterium diluido
(se puede aplicar vacío)
Se dejan desarrollar y se
colectan las semillas
Además del transgén de
interés se añade un gen
de resistencia para poder
seleccionar las semillas
transgénicas, que son las
que germinan y
sobreviven
No son necesarios los
vectores virales
Zang et al., Nat Protocols 2006
CONCLUSIONES
 La transformación transitoria de plantas con vectores de base
viral es capaz de producir proteínas de alto valor en grandes
cantidades y en corto tiempo
 En Norteamérica y Europa se han logrado desarrollos precomerciales importantes, los cuales incluyen pruebas de
proteínas terapéuticas y vacunas en humanos en fase I
 La tecnología está a poco tiempo de tener productos
aprobados por las agencias regulatorias
 Variantes de la transformación transitoria por agroinfiltración
se están probando para mejorar agronómicamente plantas
bajo cultivo protegido y en campo abierto
 Es necesario un marco regulatorio basado en un análisis de
bioseguridad que permita el desarrollo de estas tecnologías en
el país
¡Gracias!