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Agrobiotecnología. Curso 2011
Sistemas de transformación vegetal
Sistemas de transferencia genética en plantas
Transparencias 3-6
Antes de elegir un sistema de transformación vegetal, es importante establecer
un
protocolo de cultivo de tejidos y de regeneración de las plantas. Este protocolo
es
parte integral de la mayoría de las estrategias de transformación y es
generalmente el
aspecto más exigente de las mismas. La clave para integrar exitosamente las
técnicas
de cultivo de tejidos dentro en una estrategia de transformación es la obtención
de un
sistema de regeneración rápido y eficiente. No todos los protocolos de
regeneración
son compatibles con todas las técnicas de transformación. Mientras una gran
variedad
de estrategias de regeneración y transformación son aplicables a muchos
cultivos, se
requieren protocolos muy particulares y específicos para la modificación de
determinadas especies. En términos generales, algunos protocolos son claramente
más eficientes que otros. Por ejemplo, la regeneración de embriones maduros a
partir
de embriones somáticos es el método más adecuado para la regeneración de
especies monocotiledóneas. Por lo tanto, establecer una buena estrategia de
regeneración y cultivo de tejidos es primordial antes de implementar una técnica
de
transformación. La transparencia 4 muestra un diagrama de flujo orientativo para
establecer un protocolo de transformación. Primero, hay que identificar el
tejido o
células de las que se puede regenerar una planta, establecer los agentes de
selección
apropiados, las hormonas requeridas, los medios de cultivos adecuados para
desarrollar una regeneración eficiente de plantas enteras y fértiles (recuadro
superior
de la transparencia 4). Una vez establecidos estos parámetros hay que realizar
las
construcciones genéticas, y recién entonces determinar el sistema de más
apropiado
para la introducción del material genético y establecer los principales
parámetros del
procedimiento correspondiente (recuadro inferior).
La transformación de plantas se refiere al evento de introducir e integrar ADN
foráneo
en células vegetales y regenerar plantas transgénicas. La transparencia 6
enumera las
diferentes técnicas de transformación de plantas que se han desarrollado con el
objeto
de hacer más fácil y eficiente esta metodología. Los sistemas de trasferencia
pueden
dividirse en dos grupos:
Sistemas basados en vectores biológicos:
• Transferencia mediada por Agrobacterium
• Transferencia basada en virus vegetales.
Sistemas de transferencia directa de ADN, sistemas basados en transferencia
física,
surgidos como alternativa para transformar especies monocotiledóneas que no son
hospedantes naturales de Agrobacterium:
• Transferencia por bombardeo de partículas o biobalística.
• Transferencia por cationes divalentes y/o electroporación.
• Transferencia con whiskers de carburo de silicio.
• Transferencia por microinyección.
Los métodos de transformación desarrollados permiten la expresión transitoria o
la
expresión estable del ADN introducido. La expresión transitoria ocurre durante
un
período corto de tiempo (pocos días) o hasta culminar el ciclo de vida de la
planta,
pero no es heredable por la progenie. La expresión estable permite la
integración del
ADN foráneo al genoma vegetal y la consiguiente transmisión a las siguientes
generaciones.
Biología de Agrobacterium tumefaciens
Transparencias 7-19
Pese al desarrollo de otros métodos para la transferencia de genes, el método
más
difundido es la transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens. A.
tumefaciens es una bacteria del suelo gram negativa que ataca a un amplio rango
de
plantas dicotiledóneas. Muchas especies agronómicamente importantes han sido
transformadas usando esta bacteria del suelo (micrografía de la transparencia 8)
y la
lista de especies susceptibles a la transformación por Agrobacterium se
incrementa
continuamente. La fotografía del panel inferior de la transparencia 8 muestra un
tumor
típico causado por A. tumefaciens, comúnmente denominado agalla del tallo. El
género Agrobacterium ataca a un amplio rango de huéspedes, principalmente entre
las
especies dicotiledóneas. Con baja eficiencia puede infectar también a varias
especies
monocotiledóneas.
La transformación mediada por Agrobacterium puede lograrse utilizando explantos
de
tejido muy variados, los que deben seleccionarse de acuerdo con las
características
de la especie vegetal o de la variedad con la que se trabaje. En algunos casos
(tabaco, papa), es posible utilizar tejidos muy diferentes con este fin. En
otros casos, el
explanto de elección es sumamente específico. La tabla de la transparencia 5
presenta
ejemplos de los explantos más comúnmente utilizados.
El género Agrobacterium incluye varias especies patogénicas que presentan un
amplio
rango de huéspedes y de sintomatologías. La bacteria causa la formación de
tumores
en la zona cercana al sitio de infección. El desarrollo de estos tumores se debe
a que
Agrobacterium ha desarrollado la capacidad de transferir parte de su propio
material
genético a la planta hospedante. La transparencia 9 muestra el ciclo de la
enfermedad
de la agalla de corona causada por Agrobacterium tumefaciens. La formación de
tumores ocurre generalmente en el tallo de la planta, inmediatamente sobre el
nivel del
suelo. La formación de estos tumores se debe a la transferencia de genes
bacterianos
que intervienen en la síntesis de fitohormonas. La bacteria transfiere también
genes
que participan de la síntesis de una serie de compuestos de conjugación
denominados
opinas, los que son secretados al medio y utilizados como fuente de carbono y
nitrógeno en forma exclusiva frente a otros microorganismos del suelo. Debido a
que
su sistema de patogenia se basa en redirigir genéticamente el metabolismo de la
planta para su propio beneficio, las distintas especies de Agrobacterium pueden
considerarse “colonizadores genéticos”.
La transparencia 10 muestra los procesos celulares involucrados en las
principales
etapas de interacción entre Agrobacterium tumefaciens y una planta susceptible.
Estos
procesos son:
A: Reconocimiento célula-célula. La colonización por Agrobacterium requiere la
existencia de heridas en las raíces de la planta. Agrobacterium se desplaza
hacia el
tejido herido siguiendo un gradiente de concentración de señales químicas
establecido
por exudados del tejido vegetal.
B, C y D: Corresponden a tres etapas consecutivas que involucran el
procesamiento
del ADN, el empaquetamiento de la hebra T luego de su escisión, y el transporte
del
complejo T desde la célula bacteriana hacia la célula vegetal. La transparencia
muestra una microscopía electrónica (C) del complejo T maduro, compuesto por el
ADN T de simple cadena y las proteínas VirE y VirD. Este complejo es
probablemente
transportado a la célula huésped a través del pilus (señalado por flechas en D).
E: Se muestra la importación del complejo T maduro al interior del núcleo de la
célula
vegetal. La foto muestra acumulación de proteína VirD fusionada a GFP en el
núcleo,
la que se observa como fluorescencia verde.
F: Luego de la integración y expresión del ADN bacteriano al genoma vegetal se
observa la formación del tumor de agalla. El tejido indiferenciado prolifera
desde el
sitio de la herida y secreta distintas opinas que son catabolizadas
específicamente por
Agrobacterium.
La porción de material genético transferido desde la bacteria que se integra al
genoma
de la planta corresponde a una región de un plásmido residente en la bacteria
denominado plásmido Ti (transparencia 11). La región que es transferida recibe
el
nombre de ADN o hebra T (indicada en el esquema como región T) y está flanqueada
por dos repeticiones directas denominadas borde derecho (BD) e izquierdo (BI).
Los
plásmidos Ti tienen un tamaño de entre 200 y 800 Kpb. La región T corresponde a
una
secuencia de ADN de entre 10 y 30 Kpb y comprende tanto los oncogenes (genes
responsables de la síntesis de auxinas y citoquininas) como los genes
involucrados en
la síntesis y el transporte de opinas. La región de virulencia (vir), comprende
varios
operones bacterianos que participan en la escisión de la hebra T y en la
formación del
intermediario de transferencia (complejo T). La región vir comprende unos 40
Kpb.
Otros elementos importantes localizados en los plásmidos Ti son los orígenes de
replicación y de transferencia (oriT, implicado en el proceso de conjugación
bacteriana) y las regiones que contienen genes responsables del catabolismo de
las
opinas.
Todos los plásmidos Ti tienen una estructura similar. Las especies de
Agrobacterium
sintetizan diferentes tipos de opinas y son referidas de acuerdo con ello. La
transparencia 12 muestra las regiones de homología entre los plásmidos Ti de dos
cepas comunes de Agrobacterium, una de octopina (oct) y otra de nopalina (nop).
Dichas regiones abarcan principalmente la región T y la región vir. Una
característica
del plásmido Ti de octopina es que contiene tres regiones T cortas de 13, 1,5 y
7,8
Kpb, los cuales son transferidos independientemente unos de los otros, mientras
que
el de nopalina lleva un único plásmido Ti de 22 Kpb. Existen muchas otras
opinas,
tales como manopina, agropina agrocitopina, etc. En los plásmidos representados
en
esta transparencia se muestran cuatro regiones de homología que contienen
respectivamente a los genes que codifican proteínas involucradas en la síntesis
de
auxinas y citoquininas (región A), el origen de replicación (región B), los
genes que
codifican proteínas involucradas en el catabolismo de octopinas y nopalinas
(región C)
y los genes de virulencia (región D).
La transparencia 13 muestra una representación esquemática de la región T. La
región
T está definida por dos repeticiones directas de 25 pb altamente homólogas.
Tanto el
borde derecho como izquierdo son importantes para el reconocimiento de las
endonucleasas VirD1/VirD2 que estarían involucradas en la liberación de la hebra
T.
Sin embargo, el proceso de escisión tendría características polares, como lo
sugiere el
hecho de que la proteína VirD2 se une preferentemente al borde derecho (extremo
5’
de la hebra T). También se han identificado secuencias próximas al borde derecho
que
contribuirían a establecer la polaridad del proceso. En los plásmidos de
octopina, una
de estas secuencias (overdrive) incrementa el transporte del ADN T a la célula
vegetal.
La proteína VirC se une a esta secuencia favoreciendo el clivaje del borde
derecho por
la endonucleasa VirD1/D2. El borde derecho es requerido en forma absoluta para
la
patogenicidad de Agrobacterium tumefaciens, mientras que el borde izquierdo es
prescindible.
Entre los bordes izquierdo y derecho se encuentran los genes que codifican para
la
síntesis de auxinas, citoquininas y opinas. En condiciones de alta concentración
de
auxinas y baja de citoquininas, el tejido vegetal se diferencia en raíces. Una
situación
inversa corresponde el desarrollo de tallos. La síntesis no regulada de auxinas
y
citoquininas induce el crecimiento indiferenciado del tejido vegetal y conduce,
en el
caso de una síntesis elevada de los dos tipos de hormonas, a la formación de
tejido
tumoral. Los oncogenes transferidos por Agrobacterium, si bien son controlados
por
promotores de tipo eucariota, no responden a los mecanismos de regulación
endógenos. Como consecuencia, la integración del ADN T en el genoma de la
planta,
induce la desdiferenciación del tejido y el desarrollo de un tumor de agalla. El
esquema
de la transparencia 14 indica también la ubicación de la región overdrive
(enhancer de
la síntesis de la hebra T).
La colonización genética por Agrobacterium requiere la presencia de dos regiones
localizadas en el plásmido Ti: 1) el ADN de la región T, cuya secuencia será
transferida al genoma de la planta y, 2) la región de virulencia (vir),
compuesta por
siete loci principales (virA, virB, virC, virD, virE, virG y virH), que
codifican la mayor
parte de la maquinaria proteica involucrada en la transferencia del ADN T.
Además de
estas regiones, se requiere de un grupo de genes de virulencia localizado en el
cromosoma de la bacteria (genes chv) que participan en los estadios tempranos de
unión a las células de la planta. Las interacciones que tienen lugar durante la
transformación genética mediada por Agrobacterium conforman un proceso que puede
dividirse en ocho pasos distintivos, resumidos en la transparencia 15. 1)
Agrobacterium reconoce y se une a la célula huésped. Esta unión es mediada por
proteínas codificadas en el cromosoma de la bacteria y por receptores
específicos de
la célula huésped; 2) El sistema de traducción de señales de Agrobacterium
reconoce
señales químicas específicas de la planta; 3) La proteína virG media la
transducción
de señales y la activación transcripcional de los genes vir; 4) La formación de
la copia
de ADN T y del complejo T inmaduro; 5) La formación del complejo de transporte a
través de las membranas de la bacteria y de la pared celular, compuesto
principalmente por las proteínas de la familia VirB y la proteína VirD4, lo que
permite la
exportación de la hebra T y de las proteínas VirD2 y VirE1 al citoplasma de la
célula
vegetal; 6) La formación del complejo T maduro, formado por la hebra T y las
proteínas VirD2 y VirE2; 7). La importación del complejo T al núcleo, proceso
que es
facilitado por proteínas de la planta entre las que se ha identificado a AtKAPa
y VIP1;
8) El transporte dentro del núcleo y la integración del ADN T al genoma de la
planta,
mediado por VirD2/VirE2 y por factores nucleares. Se ha reportado que VirD2 es
capaz de unirse a las ciclofilinas RocA, Roc4 y CypA, proteínas que actúan como
chaperonas y contribuiría a mantener la conformación de VirD2. Otra proteína
vegetal
que se une a VirD2 es una fosfatasa tipo 2C (PP2C) es requerida para la
acumulación
de VirD2 en el núcleo. Finalmente, VirD2 también interacciona con AtKApa. Esta
proteína, participa en la importación de proteínas que contienen sitios NLS al
núcleo. A
diferencia de VirD2, VirE2 no se une a AtKapa, pero si lo hace a otras dos
proteínas
VIP1 y VIP2. La proteína VIP1 es capaz de importar la proteína VirE1 al núcleo
en un
sistema de levaduras. A su vez, VIP2 no sólo se une a VirE2, sino también VIP1
en
ensayos de doble híbrido. Por lo tanto, VIP1, VIP2 y VirE2 pueden funcionar como
un
complejo multiproteico facilitando y participando el transporte hacia el núcleo
de la
proteína VirE2 y contribuir así a la integración del complejo T. Además de
AtKAPa y
VIP1, se ha descripto que el complejo RAN, con actividad GTPasa, es requerido
para
la importación al núcleo en otros sistemas, sugiriendo que también participaría
en la
importación del complejo T al núcleo. Los análogos de GTP no hidrolizables
bloquearían la importación al núcleo de las proteínas VirE2 y VirD2 por
inhibición de
RAN.
El reconocimiento y la unión de las células de Agrobacterium a la célula vegetal
es
esencial para el proceso de infección. Luego de un primer paso de unión, la
bacteria
sintetiza filamentos de celulosa que permiten el anclaje de ésta a la pared
celular de la
planta. Se han identificado varios genes cromosómicos (ChvA, chvB, pscA, att)
que
participarían del proceso de unión a la pared de la célula vegetal. Sin embargo,
este
proceso está poco caracterizado y la funcionalidad de estos genes en el proceso
de
anclaje no ha sido completamente dilucidada. Agrobacterium ha desarrollado un
sistema regulatorio de dos componentes para reconocer la presencia de células
huéspedes susceptibles, compuesto por una proteína de membrana (VirA) y una
proteína citoplasmática (VirG). Estas proteínas actúan como un par
receptor/transductor frente a moléculas provenientes de las heridas en la planta
y
promueven la transcripción de los genes vir (transparencia 16). El inductor
mejor
estudiado es la acetosiringona, un compuesto fenólico. Algunos monosacáridos,
tales
como glucosa y galactosa también contribuyen a la expresión de los genes vir. La
señalización se inicia a través de compuestos fenólicos secretados por la planta
los
que se unen a la proteína VirA. Dos proteínas codificadas por genes cromosómicos
de
Agrobacterium, p10 y p21, contribuyen en este reconocimiento. La primera se
uniría a
los compuestos fenólicos y mediaría directa o indirectamente la unión a VirA. En
cambio, la inducción de los genes vir por azúcares es mediada por otra proteína
de
origen cromosómico (ChvE) que une glucosa/galactosa e interactúa con VirA. VirA
funciona como una proteín quinasa y como fosfotransferasa. En el primer caso,
ocurre
una autofosforilación en un residuo de histidina situado dentro de su región Cterminal,
la que también contiene el dominio quinasa. La proteína VirA fosforilada se une
a la
proteína VirG que es a su vez fosforilada en un residuo aspartato. La forma
fosforilada
de VirG es mucho más estable y posiblemente permita maximizar los niveles de
inducción de los restantes genes vir. La inducción de los genes vir ocurre
cuando VirG
fosforilado se une específicamente a los dominios vir, una secuencia conservada
de
12 pb localizada en la región promotora de los genes vir.
Una vez inducidos los genes vir, se produce la escisión de la hebra T libre.
Este
evento se inicia en el borde derecho, continúa en dirección 5’-3’, y termina en
el borde
izquierdo de la hebra antisentido. Un complejo de proteínas denominadas
VirD1/D2,
que funcionan como endonucleasas específicas, se une a la forma supercoiled del
plásmido Ti, relajan el plásmido, hace un corte entre la tercera y cuarta base
de los
bordes derecho e izquierdo en la hebra antisentido de la región T y liberan
dicha
hebra. La reacción de corte comprende la unión covalente de la proteína VirD2 al
extremo 5’ del borde derecho. Luego, la maquinaria de síntesis de ADN repara la
brecha entre los bordes derecho e izquierdo de la hebra antisentido. La proteína
VirD2
permanece unida al ADN-T durante todo el trayecto hasta la célula huésped. Las
proteínas VirD2 y VirE2 (una proteína de unión a ADN de simple cadena) junto con
la
hebra T constituyen el complejo T maduro. La unión de VirE2 ocurre antes de que
la
hebra T sea transportada a través del canal de pasaje a través de las membranas
de
la bacteria. Otra proteína recientemente identificada, la proteína VirE1, se une
a VirE2,
facilitando la unión de VirE2 al ADN, pero no interviene en la exportación de la
hebra T
a la célula de la planta.
Una vez formado el complejo T maduro, éste interactúa con distintos complejos
proteicos involucrados en su exportación al citoplasma de la célula vegetal. El
dispositivo de transporte del complejo T contiene alrededor de 12 proteínas que
forman dos componentes funcionales: un complejo secretorio que transporta
sustratos
a través de la membrana celular y un pilus filamentoso. La transparencia 18
muestra
un modelo que da cuenta de la estructura de estos complejos, elaborado sobre la
base
de evidencia indirecta. El complejo secretorio está compuesto por la proteína
codificada por el gen virD4 y por un conjunto de proteínas codificado por el
operón
virB, el que contiene once marcos abiertos de lectura. El pilus está compuesto
mayoritariamente por la proteína VirB2 y, en menor proporción, por la proteína
VirB5.
El pilus censaría el contacto con la célula vegetal y traduciría la información
al
complejo secretorio para iniciar la exportación del complejo T. Se piensa que la
proteína VirB1 tiene actividad transglucosilasa e interviene en la degradación
de los
peptidoglicanos bacterianos. Las proteínas VirB3 y VirB4 promoverían el
ensamblado
del pilus. Además de VirD4, VirB4 y VirB11 poseen también actividad ATPasa. Se
asume que el transporte del complejo T implica la hidrólisis de ATP y que por lo
tanto
se trata de un proceso de transporte activo. La proteína VirB6 participaría en
la
formación del poro del complejo secretorio de transporte. Se desconocen aún las
funciones de las proteínas VirB7, 8, 9 y 10.
Luego de pasar al citoplasma de la célula vegetal el complejo T es transportado
al
núcleo de la misma. A diferencia de los elementos genéticos transponibles, el
ADN-T
no codifica proteínas necesarias para su transporte e integración. Por lo tanto,
el ADNT no contiene secuencias específicas y cualquier fragmento de ADN
insertado entre
los bordes de la región T será transferido e integrado al genoma vegetal. Las
proteínas
VirD2 y VirE2, que componen el complejo T, están directamente implicadas en el
proceso de importación al núcleo vegetal. VirD2 contiene dos señales de
localización
nuclear (NLS) y VirE2 contiene una. VirD2 y VirE2 se unirían a proteínas de la
planta
involucradas con la importación e integración del ADN-T. Se ha reportado que
VirD2
es capaz de unirse a las ciclofilinas RocA, Roc4 y CypA, proteínas que actúan
como
chaperonas y contribuiría a mantener la conformación de VirD2. Otra proteína
vegetal
que se une a VirD2 es la ya mencionada fosfatasa tipo 2C (PP2C) es requerida
para la
acumulación de VirD2 en el núcleo. Finalmente, VirD2 también interacciona con
AtKApa. Esta proteína, de la familia de carioferinas, participa en la
importación de
proteínas que contienen sitios NLS al núcleo. A diferencia de VirD2, VirE2 no se
une a
AtKapa, pero si lo hace a otras dos proteínas VIP1 y VIP2. La proteína VIP1,
como ya
se dijo, es capaz de importar la proteína VirE1 al núcleo en un sistema de
levaduras, e
interactuar con VIP2. Por lo tanto, VIP1, VIP2 y VirE2 conformarían un complejo
de
proteínas que posibilita el transporte hacia el núcleo de VirE2 y contribuye así
a la
integración del complejo T.
Una vez en el núcleo, el complejo T participa de la integración de la hebra T al
genoma
de la planta. Se asume que tanto las proteínas VirD2 y VirE2 como otros factores
nucleares proveen actividades que posibilitan este proceso. La transparencia 19
ilustra
un posible modelo del mecanismo involucrado. La proteína VirD2 tiene actividad
ligasa
in vitro, lo que sugiere que podría participar en la ligación del extremo 5’ del
ADN T al
ADN de la planta. A este paso seguiría un paso de síntesis reparativa de la
hebra
complementaria en que intervendría la maquinaria nuclear de la planta. Sin
embargo,
otros estudios sugieren que la doble cadena se sintetizaría previamente a la
integración al genoma vegetal. La proteína VirD2 tiene en su extremo C-terminal
motivos presentes en la familia de las recombinasas. La proteína VirE2 se
requeriría
para la integración del extremo 3’ del ADN T. También se ha sugerido una
participación de la histona H2A en el proceso de integración.
En resumen, podemos dividir el proceso de transformación mediada por
Agrobacterium en cuatro tipos de interacciones diferentes: a) interacciones
extracelulares, b) interacciones dentro de Agrobacterium, c) interacciones
dentro de la
célula vegetal, y d) interacciones en el núcleo de la célula vegetal (ver Anexo,
transparencias 104-106).
Interacciones extracelulares (transparencia 104): Las proteínas bacterianas
ChvA,
ChvB, PscA y Att reconocen los receptores (proteínas tipo vitronectina) de la
pared
celular de la célula vegetal, resultando en la unión de las agrobacterias a la
célula
huésped. ChvE interacciona con azúcares y transfiere la señal a VirA, o VirA
interacciona con compuestos fenólicos, en forma directa o vía p10 y p21. Ambas
vías
de señalización resultan en la autofosforilación de VirA. La transferencia del
grupo
fosfato de VirA a VirG transmite las señales de la planta a la célula
bacteriana, donde
VirG activa la expresión de los genes vir.
Interacciones dentro de Agrobacterium (transparencia 105): Esta etapa comienza
con
la activación de los genes vir. Las proteínas VirB1, VirB3, VirB4, VirB6, VirB7,
VirB8,
VirB9, VirB10, VirB11 y VirD4 se ensamblan formando un complejo secretorio
transmembrana, que junto con el pilus formado por VirB2/VirB5, funcionan como un
canal que conecta la célula vegetal con la célula bacteriana. VirD1 y VirD2
forman un
complejo de endonucleasas que con la ayuda de VirC1, cortan la cadena
antisentido
en los bordes del ADN T. Durante este proceso, VirD2 se une covalentemente al
extremo 5’ de la hebra T generando un complejo T inmaduro. Este complejo T puede
madurar por dos mecanismos diferentes: a) el complejo T inmaduro y VirE2 unida a
VirE1 se exportarían a través del canal de manera separada. En la célula
huésped,
VirE2 y VirE1 se desunen y VirE2 se une a la cadena T, formando el complejo T
maduro (ADN T, VirD2 y VirE2); ó b) VirE2 se une al ADN T en el citoplasma
bacteriano, y el complejo T maduro es luego exportado.
Interacciones dentro de la célula vegetal (transparencia 106, panel superior):
Dentro
del citoplasma de la célula vegetal, VirD2 interacciona con las ciclofilinas
RocA, Roc4 y
CypA para mantener su conformación, con la proteína AtKAPa para importar el
complejo T dentro del núcleo y, posiblemente, con PP2C para regular esta
importación. VirE2 interacciona con VIP1 para favorecer su importación al
núcleo. Las
interacciones VirD2-AtKAPa y VirE2-VIP1 resultan en una eficiente importación
del
complejo T al núcleo.
Interacciones en el núcleo de la célula vegetal (transparencia 106, panel
inferior): Una
vez en el núcleo, VIP1 y VIP2 podrían participar en el transporte intranuclear
del
complejo T, guiándolo al sitio de integración en el cromosoma de la planta.
Finalmente,
factores nucleares actúan en forma concertada con VirD2 y VirE2 para integrar la
cadena T en el ADN cromosómico, resultando en una transformación genética
estable.
Vectores basados en plásmidos Ti
Transparencias 20-31
La capacidad natural de Agrobacterium de introducir ADN en el genoma nuclear de
la
planta permitió desarrollar vectores basados en las secuencias del plásmido Ti
de
Agrobacterium. Se constató que, si se remueven todos los genes comprendidos
dentro
de la región T (oncogenes y genes de síntesis de opinas), no se afecta la
transferencia
e integración del ADN T. Sobre esta base, se desarrollaron vectores de expresión
que
permiten clonar genes de interés dentro de la región T. Existen dos tipos
diferentes de
vectores de transformación. Las partes A y B de la transparencia 21 muestran los
fundamentos de un vector de tipo cointegrativo. El gen de interés es introducido
dentro
de un plásmido Ti mediante un paso de recombinación simple a partir del llamado
vector intermediario (un plásmido común de trabajo para Escherichia coli). En
este
plásmido Ti, las secuencias comprendidas entre los bordes de la región T han
sido
reemplazadas por secuencias que permiten la cointegración del vector
intermediario.
Este plásmido Ti conserva también todos los genes comprendidos en la región vir.
La
parte C de la transparencia ilustra un sistema basado en un vector binario. En
éste, el
gen de interés y los genes vir residen en dos replicones separados capaces de
coexistir y replicarse autónomamente en Agrobacterium. El replicón que contiene
el
gen de interés (en general de tamaño pequeño) se denomina vector binario. El
replicón que contiene los genes vir se denomina plásmido Ti desarmado (obsérvese
que la región T ha sido completamente eliminada de éste elemento). El desarrollo
de
vectores binarios y la disponibilidad de un amplio rango de cepas de
Agrobacterium
que contienen plásmidos Ti desarmados convirtieron a la transformación basada en
esta bacteria en un método preferencial de transformación vegetal.
Inicialmente, el método para introducir ADN foráneo en un plásmido Ti
cointegrado,
como el que se muestra en la transparencia 22, requería introducir un replicón
de tipo
ColE1, como pBR322, dentro de la región T del plásmido Ti. El ADN que se
integrable
en la región T se clonaba en un derivado de pBR322 que portaba un gen de
resistencia a un antibiótico. Este plásmido se introducía en la cepa de
Agrobacterium y
la cepa se seleccionada por resistencia a dicho antibiótico. Como el ColE1 no
puede
replicarse en Agrobacterium, el plásmido pBR322 deberá cointegrarse al segmento
pBR322 homólogo de la región T para acceder a una expresión estable. La
desventaja
principal de esta técnica es que resulta engorrosa y poco accesible para
laboratorios
con poca experiencia en microbiología. La ventaja principal es que este sistema
permite mantener al gen foráneo en un bajo número de copias dentro de un
plásmido
Ti de Agrobacterium. La transparencia muestra un ejemplo basado en un vector
cointegrativo tradicional.
Los vectores binarios surgen como una alternativa al uso de los vectores
cointegrativos debido a la fácil implementación de su uso en todo tipo de
laboratorios.
Estos vectores se basan en que la región T y los genes vir se encuentran en dos
replicones separados. Cuando estos replicones son introducidos en Agrobacterium,
los
productos de los genes vir pueden actuar en trans sobre la región T procesando y
transfiriendo el ADN T a la célula vegetal. El plásmido que contiene la región T
es
denominado vector binario, mientras que el replicón que lleva los genes vir se
denomina plásmido helper o plásmido Ti desarmado. En general, el plásmido helper
contiene deleciones de la región T y es incapaz de generar tumores. En la
transparencia 23 se muestran cuatro tipos de plásmidos binarios, todos los
cuales
contienen genes con secuencias no homólogas que confieren resistencia a
kanamicina. Los plásmidos binarios son pequeños y fáciles de manipular tanto en
Escherichia coli como en Agrobacterium. Generalmente, contienen sitios múltiples
para enzimas de restricción dentro de la región T donde puede clonarse
fácilmente el
gen de interés. Muchos de los primeros plásmidos binarios tienen los genes de
selección para plantas cerca del borde derecho (por ejemplo, pBIN19). Más
recientemente, los nuevos vectores binarios se desarrollaron con el gen marcador
de
selección para plantas más cerca del borde izquierdo, lo que asegura que el gen
de
interés sea transferido antes que el gen selector (por ejemplo, pGreen0029).
Debe
recordarse que el borde derecho precede borde izquierdo en la transferencia del
ADNT.
Muchos vectores fueron diseñados con propósitos específicos y contienen
diferentes
genes selectores, promotores y señales de poliadenilación. La tabla de la
transparencia 24 refleja la optimización gradual experimentada desde la
introducción
de los primeros vectores. Ello ha permitido incrementar la flexibilidad de los
sistemas
de vectores para distintos usos en un amplio rango especies vegetales. Los genes
selectores más comúnmente usados en bacterias son los de resistencia a
kanamicina,
gentamicina, tetraciclina y estreptomicina y/o espectinomicina. También ha
ocurrido
una progresiva reducción del tamaño de los plásmidos binarios. Los plásmidos
pPZP
poseen un origen de replicación pVS1 cuya secuencia es considerablemente más
corta que las de otros orígenes de replicación, como pRK2 o Ri. Por ello, los
vectores
con orígenes de replicación tipo pVS1 tienen un tamaño menor comparado con los
que
poseen los orígenes de replicación pRK2 o Ri. El pGreen usa un locus de
replicación
pSa más pequeño, subdividido en el origen de replicación pSa ori y el gen de la
replicasa pSa (rep A). El gen de rep A proviene de un plásmido (psoup) de
Agrobacterium y permite la replicación de pGreen en trans.
Los vectores binarios que hoy se utilizan proveen un amplio número de genes
selectores para plantas. Esta gama de genes permite así responder a
requerimientos
de las técnicas de cultivo de tejidos y expandir el rango de especies
transformables.
De esta forma, se han desarrollado en muchos casos diversas versiones de un
mismo
vector binario. El vector pGreen, por ejemplo, permite realizar distintas
combinaciones
de genes selectores con el propósito de desarrollar protocolos de selección con
uno o
más marcadores. Este grado de flexibilidad permitirá también la incorporación de
nuevos genes selectores en el futuro. En la mayoría de los casos, la selección
se basa
en el agregado de una sustancia tóxica para el tejido no transformado al medio
de
cultivo (selección negativa). Al expresarse en las células transformadas, el gen
selector permite su supervivencia y la regeneración de plantas a partir de las
mismas.
Los genes de resistencia a antibióticos han sido frecuentemente utilizados como
selectores. El más utilizado de ellos es el gen nptII que confiere resistencia
al
antibiótico kanamicina. Otros genes ampliamente utilizados son los que confieren
resistencia a espectinomicina e higromicina y los que confieren resistencia a
herbicidas, como glufosinato y glifosato. El uso de un determinado selector está
vinculado con la susceptibilidad específica de cada especie vegetal, por lo que
la
transformación de una especie nueva implica generalmente ensayos con distintos
selectores. Es conveniente disponer de más de un gen selector si se prevé la
necesidad de retransformar una especie con varios transgenes de interés. El
debate
sobre el uso de genes de resistencia a antibióticos en plantas transgénicas
comerciales promovió la búsqueda de selectores más aceptables para la percepción
pública que no poseen propiedades tóxicas para el tejido (selección positiva).
Asimismo, se han desarrollado diferentes estrategias para eliminar los genes
selectores en el cultivo transgénico.
Una opción para evitar el uso de genes de resistencia a antibióticos u
herbicidas es el
uso de genes de selección positiva, llamados así, porque permiten la
proliferación del
tejido transformado e inhiben la del tejido no transformado, el que sin embargo
no
muere. Una de las estrategias más interesantes de selección positiva se basa en
la
utilización de las fuentes de carbono, para las cuales se han usado genes de
origen
bacteriano que permiten la modificación de manosa o xilosa (monosacáridos que no
pueden ser directamente utilizados por las plantas) como genes de selección en
la
transformación de plantas. El ejemplo descrito en la transparencia 27
corresponde a la
selección mediada por el gen de la manosa-6P isomerasa (man A), el que
interviene
en el pasaje de manosa-6P a fructosa 6P. Se compara la eficiencia de
transformación
de la remolacha utilizando el gen nptII y el gen man A. La parte A de la figura
muestra
la eficiencia (en porcentaje) de brotes transformados usando métodos de
selección
positiva (manosa-6P isomerasa) o negativa (nptII). En la parte B se observa el
porcentaje de brotes capaces de enraizar usando uno y otro método. Este método
de
selección positiva se ha utilizado en otros cultivos como cebada, tomate y
girasol.
Para evitar la presencia de marcadores resistentes a antibióticos se han
desarrollado
varios métodos que permiten su remoción del tejido transgénico. La estrategia
más
sencilla es la co-transformación de una misma célula con dos cepas de
Agrobacterium
portando construcciones diferentes, una conteniendo el transgén de interés y
otra el
gen selector. La base de esta estrategia consiste en que, de producirse la
cotransformación, ambos transgenes se insertarán en diferentes regiones del
genoma en
forma no ligada, por lo cual será factible su segregación posterior en la
progenie de la
planta transgénica. Como una alternativa a la co-transformación, se han
desarrollado
varios sistemas que utilizan elementos transponibles y/o sistemas de
recombinación
sitio-específico. Estos sistemas requieren la expresión simultánea de
transposasas o
recombinasas que promueven la deleción específica de la región que debe ser
eliminada. La eliminación del gen selector y de la transposasa/recombinasa se
realiza
posteriormente por segregación genética. La transparencia 28 muestra el diseño
de
los dos principales tipos de vectores utilizados con este propósito. Los de Tipo
1
contienen al gen de la transposasa y al gen selector en el mismo cassette de
expresión, mientras que, en los de Tipo 2, la transposasa es aportada en trans
por un
vector helper. En los vectores de Tipo 1, las secuencias Ds, sobre las cuales
actúa la
transposasa, flanquean al gen de interés; en los de Tipo 2, las secuencias Ds
flanquean al marcador de selección. El gen de la transposasa se muestra como un
componente integrante de los vectores de Tipo 1, mientras que en el caso de los
de
Tipo 2 debe ser introducido por cruzamiento a partir de plantas transformadas
con una
construcción independiente. Una desventaja de estos sistemas es que la
eliminación y
selección posterior de las secuencias indeseables en la descendencia consumen
tiempos considerables. Estas estrategias no son viables en plantas de
propagación
vegetativa, para las cuales se han desarrollado métodos alternativos.
Un sistema menos complicado, como el que se muestra en la transparencia 29,
implica la deleción de ADN mediante recombinación de regiones intracromosómicas
(ICR) entre dos secuencias homólogas. Dado que la frecuencia de ICR es baja,
esto
permite una eficiente aplicación de este sistema. El vector de transformación
diseñado
(OattO-ICR, contiene dos regiones de 352 pb de la secuencia de unión (attP) del
bacteriófago l que rodean al gen de resistencia nptII, al gen GFP y al gen tms2.
A la
izquierda del sitio attP, se encuentra la secuencia booster de transformación
(TBS),
que favorecería el apareamiento de las secuencias attP evitando la recombinación
ilegítima; también se encuentra el gen efector que será integrado al genoma por
el
sistema attP (esquema superior). La recombinación homóloga entre las dos
regiones
attP permite delecionar un fragmento de 5.9 Kpb y produce un transgén que
contiene
el gen efector y la secuencia TBS (esquema inferior). El gen tms2 , usado como
selector, codifica una enzima que convierte NAM (naftaleno acetamida) a la
auxina
ANA (ácido naftalen acético). Las plantas que expresan el gen tms2 producen
altos
niveles de auxina que evitan el desarrollo de raíces e inducen la producción de
callos.
Por lo tanto, cuando se elimina la región entre las secuencias attP, se habilita
el
desarrollo de raíces y se pueden identificar las plantas positivas. En la
transparencia
30 se muestran resultados obtenidos utilizando el sistema descrito. Una
construcción
similar a la detallada previamente se introdujo en de explantos de hojas de
tabaco y se
seleccionaron callos resistentes a kanamicina. Después de tres a cinco meses se
observó que varios brotes que se habían desarrollado mostraban una coloración
blanca. Cuando se analizaron estos brotes por PCR se observó que habían perdido
el
gen de resistencia a nptII y el gen tms2. Para seleccionar plantas de tabaco
transgénicas libres de marcador (panel A, se desarrollaron brotes verdes y
blancos en
medio conteniendo kanamicina). En el tejido blanco, que potencialmente ha
perdido el
marcador nptII, se ensayó la actividad del gen tms2 (panel B). En medio
conteniendo
NAM, las raíces con actividad tms2 produjeron abundantes callos en lugar de
raíces
(izquierda), mientras que las raíces regeneradas a partir de tejido blanco que
han
perdido el gen nptII, debido a que también perdieron el gen tms2, producen
raíces
normales (derecha).
El sistema que se muestra en la transparencia 31 se basa en un sistema inducible
por
estradiol, que permite la remoción de ADN en un sitio específico en plantas
transgénicas de Arabidopsis, denominado CLX (por sistema de remoción de ADN
Cre/loxP). Este sistema es controlado por otro sistema denominado XVE. Comparado
con otros sistemas, el sistema CLX puede ser finamente controlado y es altamente
eficiente. Este sistema puede usarse en todo tipo de regeneración de explantos,
tanto
por organogénesis como por embriogénesis somática. El sistema de expresión
inducible XVE se eligió para el sistema CLX. La recombinasa Cre del bacteriófago
P1,
que reconoce específicamente los sitios loxP, se ubicó bajo el control del
sistema XVE.
Dado que el promotor OlexA-46 tiene una expresión basal en células bacterianas,
la
secuencia que codifica Cre se interrumpió con un intrón para evitar su expresión
en las
mismas. El marcador de selección (gen nptII) se ubicó entre las unidades de
transcripción XVE y cre. En este ejemplo, el gen reportero GFP es utilizado como
gen
de interés. Las tres unidades de transcripción están flanqueadas por los dos
sitios
loxP, de tal forma que la recombinación inducida por estradiol permite la
remoción de
todos estos componentes y la activación del gen GFP por el promotor G10-90.
Protocolos de transformación mediante Agrobacterium tumefaciens
Transparencias 32-37
Los protocolos de transformación por Agrobacterium tumefaciens son, en rasgos
generales, muy similares. La base de la técnica radica en poner en contacto el
explanto que se va a utilizar para transformar con la cepa de Agrobacterium
crecida en
condiciones apropiadas. De acuerdo con la cepa utilizada, el requerimiento de
antibióticos puede ser diferente. En general, las cepas de Agrobacterium se
cultivan en
medio LB suplementado con MgSO4 en presencia de los antibióticos requeridos. El
Agrobacterium se cultiva toda la noche a 27-28 ºC. En el caso de la
transformación de
hojas de tabaco, se cortan discos de hoja (explantos) de aproximadamente 1 cm de
diámetro. El explanto se coloca en una caja de Petri que contiene medio MS
líquido y
el cultivo de Agrobacterium. Se incuba unos minutos en presencia de la bacteria
y
luego se pasa a un medio MS sólido en presencia de las hormonas ANA y BAP para
inducir la formación de brotes. Luego, los explantos se traspasan a un medio MS
sólido suplementado con los antibióticos requeridos para seleccionar sólo
aquellos
brotes que hayan incorporado el ADN-T y cefotaxime, un bacteriostático que
inhibe el
crecimiento de Agrobacterium. Los explantos se repican cada 3 semanas durante 2
meses. Cuando se obtienen los brotes, estos se pasan a medio MS sólido
suplementado con los agentes de selección, pero en ausencia de hormonas para
favorecer el desarrollo de raíces y tallos. Las plantas que enraízan en medio
con
selección se pasan a tierra en invernadero. La transparencia 33 ilustra este
proceso.
Panel A: control de selección: explantos que no fueron incubados con
Agrobacterium
para confirmar que el agente selector está actuando. Panel B: control de
regeneración:
para confirmar que las hormonas están actuando dado que en ausencia de agente
selector se observa regeneración de brotes. Paneles C, D, E y F: transformantes
en
medio suplementado con hormonas y agente selector. En el panel F se observa que
el
brote es capaz de enraizar en medio suplementado con el agente selector.
La transparencia 34 ilustra la transformación de soja a partir de cotiledones
mediante
Agrobacterium y usando higromicina como agente selector. El uso de higromicina
como agente selector disminuyó el número de escapes (plantas no transformadas).
A:
explantos obtenidos a partir de plantas de soja de 5 días de edad. B:
cotiledones
incubados en un medio conteniendo Agrobacterium. C: explantos incubados en medio
de inducción de tallos durante 28 días, los primeros 14 días en ausencia de
higromicina, y los segundos 14 días en presencia de higromicina. E, F, G:
evolución de
los explantos en medio selectivo conteniendo higromicina durante 4 meses. H:
plantas
seleccionadas in vitro de una altura de 4 cm. I: plantas transferidas a tierra
en
condiciones de invernáculo.
El protocolo de transformación de Arabidopsis thaliana por Agrobacterium es
extremadamente simple y la eficiencia de transformación radica fundamentalmente
en
el buen estado fisiológico de las plantas durante el proceso de transformación y
fecundación. La transparencia 35 muestra pasos de este protocolo. Una vez que
las
plantas florecen (panel A), se prepara la cepa de Agrobacterium tumefaciens que
lleva
el gen de interés en un vector binario. El cultivo de Agrobacterium se
resuspende en
una solución de sacarosa al 5% y la planta se sumerge en la solución de
bacterias
dejando en contacto las flores durante unos segundos con agitación suave (panel
B).
Luego, las plantas se cultivan normalmente hasta la obtención de semillas (panel
C).
Una vez obtenidas, las semillas se recolectan, se secan y se esterilizan usando
ácido
clorhídrico. Las semillas transformadas se seleccionan durante 7 a 10 días en
medio
MS sólido en presencia del agente selector. El panel D muestra las plantas
potencialmente transformadas que crecieron en el medio selectivo.
La transparencia 36 resume los tiempos estimados para cada uno de los pasos de
un
protocolo de una transformación estándar mediado por Agrobacterium tumefaciens.
Estos tiempos son variables y dependen de la especie a ser transformada, la
variedad
elegida, el explanto utilizado y el protocolo elegido para la selección.
Otro de los usos posibles de los sistemas basados en A. tumefaciens, es la
mutagénesis por inserción con ADN-T, insertándose éste teóricamente al azar en
cualquier sitio de la eucromatina, y representando un marcador molecular de
secuencia conocida (tag) en el sitio de inserción. Pueden generarse así
colecciones de
mutantes estables, para estudios de genética inversa.
Protocolo de transformación mediante Agrobacterium rhizogenes
Transparencias 38-42
Agrobacterium rhizogenes induce la formación de raíces en forma de cabellera
(hairy
roots, ver transparencia 39) en plantas dicotiledóneas debido a la incorporación
del
ADN-T contenido en el plásmido Ri al genoma de la planta huésped. Se muestra el
sobre crecimiento de raíces en discos de remolacha transformadas con el plásmido
Ri
de A. rhizogenes.
Inicialmente, se pensó que la transformación vía Agrobacterium rhizogenes era un
método de elección, dado la facilidad para rescatar plantas transformadas a
partir de
raíces inoculadas con esta bacteria, en comparación con las dificultades que
implica el
rescate a partir de tumores de Agrobacterium tumefaciens. Sin embargo, una vez
que
el plásmido Ti fue exitosamente desarmado y estuvieron disponibles vectores no
oncogénicos, la transformación con Agrobacterium tumefaciens pasó a ser rutina y
la
utilización de Agrobacterium rhizogenes se vio restringida a usos específicos.
Las
plantas transformadas con Agrobacterium rhizogenes pueden rescatarse a partir de
pelos de explantos transformados (cada pelo representa un evento individual de
transformación), mediante el uso de medios hormonales adecuados. Sin embargo,
las
plantas transformadas y sus progenies son morfológicamente anormales (panel
inferior
de la transparencia 40) y presentan el denominado fenotipo Ri (entrenudos
cortos,
hojas retorcidas, etc.). La transformación de raíces por Agrobacterium
rhizogenes ha
encontrado una importante aplicación alternativa. Las raíces de las plantas en
su
estado natural son capaces de sintetizar una extraordinaria diversidad de
metabolitos
secundarios y las raíces transformadas tienen el potencial de capitalizar esta
habilidad.
Debido a que las raíces son capaces de proliferar indefinidamente in vitro con
altas
tasas de crecimiento, esta habilidad podría ser usada para la producción de
altos
niveles de metabolitos secundarios en cultivos en gran escala.
La transparencia 41 resume el procedimiento utilizado para la transformación
mediada
por Agrobacterium rhizogenes. Inicialmente, se clona el gen de interés en un
vector
intermediario que contenga el ADN-T del plásmido Ri. Luego, se transforma
Agrobacterium rhizogenes con este vector intermediario, el que sólo se va a
poder
replicar como un cointegrado con el plásmido pRi. El cultivo de Agrobacterium
rhizogenes se co-cultiva con los explantos (en este caso, tallos decapitados) y
éstos
se transfieren a un medio donde se induce la formación de raíces transformadas.
Luego las raíces se transfieren a un medio apropiado para inducir la formación
de
tallos a partir de los cuales se regeneran plantas enteras. Las plantas
genéticamente
transformadas se transfieren a invernadero.
Genes reporteros
Transparencias 43-52
Los genes reporteros son ampliamente usados en muchos vectores de expresión para
medir la actividad de distintas regiones reguladoras. Idealmente, un gen
reportero
debe ser fácil de ensayar, si es posible en condiciones no destructivas del
tejido. Se
requiere también que la actividad endógena asociada al gen reportero sea muy
baja o
inexistente en las plantas a transformar. Actualmente, se cuenta con un pequeño
número de genes reporteros de uso frecuente, siendo los más utilizados el de la
glucuronidasa, la proteína de fluorescencia verde, los de luciferasa y, en
menor grado,
el de cloranfenicol acetiltransferasa. La transparencia 44 enumera los orígenes
y tipos
de ensayos que se utilizan para detectar las actividades asociadas con estos
genes.
Los genes reporteros han utilizados desde muy temprano como indicadores de que
la
transformación vegetal realmente ha ocurrido. En general, los genes reporteros
son
codificados por enzimas que actúan sobre sustratos que normalmente no están
presentes en la célula huésped. Uno de los genes reporteros más comúnmente
utilizado en plantas es el gen de la -glucuronidasa (uidA) de Escherichia coli.
La
proteína GUS es bastante estable y conserva su actividad aún cuando está
fusionada
a otras proteínas. La actividad GUS puede detectarse a través de una sencilla
reacción histoquímica usando una variedad de sustratos que están disponibles
comercialmente. Desafortunadamente, la mayoría de los sustratos son caros y la
reacción histoquímica es destructiva, por lo que este ensayo no puede realizarse
en
tejido vivo. Sin embargo, la detección de la actividad GUS es muy sensible,
pudiéndose detectar a nivel de unas pocas células. La transparencia 45 muestra
la
tinción de óvulos, sacos embrionarios y lóculos enteros de Arabidopsis thaliana
mediante la reacción histoquímica de la enzima -glucuronidasa luego de la
infiltración
con Agrobacterium tumefaciens. En este caso, el gen uidA está regulado por un
promotor constitutivo y lo que se visualiza son los tejidos inicialmente
transformados
por este método. A: fotografía de una flor completa donde se observan varios
óvulos
teñidos. B: Fotografía ampliada de un segmento floral donde se pueden ver óvulos
completamente teñidos y óvulos no teñidos. C: Tinción del embrión o saco
embrionario, en vez del óvulo entero. D: Cavidad del lóculo completamente
teñido.
Los genes reporteros son comúnmente usados para explorar la localización
espaciotemporal de la expresión génica. Para ello, las regiones reguladoras de
los genes que
se desea estudiar son ligadas al gen reportero y las construcciones así
obtenidas son
transferidas al genoma de la planta. El panel de la parte superior de la
transparencia
46 muestra la expresión del gen reportero uidA mediada por el promotor tejido
específico AtpT2 en flores y frutos de Arabidopsis thaliana. 1) Expresión del
gen uidA
en flores, 2) La expresión del gen uidA es confinada a la porción entre la
silicua y el
pecíolo. 3 y 4). Cortes histológicos del fruto donde se observa la expresión del
gen
uidA en células del estrato superior (3) y en algunas células del tejido
vacuolar (4). El
panel de la parte inferior de la transparencia muestra la expresión del gen
reportero
uidA bajo la regulación de un promotor tejido específico AtpT2 en raíces de
Nicotiana
tabacum. (5) y (6): Fotografías de las raíces completamente teñidas debido a la
expresión del gen uidA. (7): Corte transversal de raíz mostrando la expresión
del gen
uidA.
Los genes reporteros se utilizan también para la puesta a punto y seguimiento de
un
sistema de transformación. La transparencia 47 muestra embriones cigóticos
inmaduros de Zea mays co-cultivados con agrobacterias que portan una
construcción
en que el gen uidA es dirigido por un promotor constitutivo. En el panel A se
observa la
distribución de puntos azules (expresión transitoria del gen uidA) en embriones
cigóticos de maíz. En el panel B se observa la expresión estable del gen uidA en
callos
que emergieron de un único embrión. El callo de la derecha no muestra actividad
GUS
porque proviene de un embrión no transformado. El panel C muestra un segmento de
hoja aislada de una planta transgénica que expresa el gen uidA. La hoja de la
derecha
proviene de una planta no transgénica (control negativo). El panel D muestra
plantas
transgénicas de maíz en invernadero expresando el gen uidA.
Aequorea victoria es una medusa con puntos luminiscentes en sus bordes
(transparencia 48, panel inferior izquierdo). La luz proviene de una masa de
tejido
amarillo que contiene entre 6.000 a 7.000 células fotogénicas. El citoplasma de
estas
células contiene los componentes necesarios para generar bioluminiscencia. Estos
componentes son una fotoproteína que se activa por Ca2+ (aequorina) que emite
luz
azul y verde, y una proteína accesoria, la green fluorescent protein (GFP), que
acepta
energía de la aequorina y re-emite esta energía como luz verde. La fluorescencia
intrínseca de la proteína GFP se debe a una unión covalente a un cromóforo que
se
forma por modificaciones postranscripcionales de la proteína y que involucran el
ciclado y la oxidación de los residuos, 65-67 (Ser-Tyr-Gly). El ADNc de GFP fue
clonado y expresado en varios organismos procariotas y eucariotas, como
bacterias,
levaduras, nematodos, Drosophila y mamíferos. La proteína GFP tiene las
características de un gen reportero deseable. Su expresión es autónoma e
independiente de la localización celular y se requiere solamente la presencia de
luz UV
o azul y de oxígeno para la emisión de la fluorescencia verde. Además, GFP
permanece activa cuando otras proteínas se fusionan a su extremo C- y Nterminal,
sin afectar tampoco la distribución o compartimentalización de la proteína
fusionada.
Sin embargo, la expresión de GFP en plantas presenta ciertos problemas que deben
ser tenidos en cuenta: a) la fluorescencia endógena que puede presentar las
plantas
puede confundir la interpretación de los resultados; b) la presencia de
secuencias que
codifican intrones crípticos puede llevar a la síntesis de una proteína
inactiva; c) la
obtención de radicales libres debido a la fuerte expresión de GFP puede resultar
en
muerte celular. Para evitar estos problemas, se han realizado varias
modificaciones a
la secuencia codificante de GFP: a) el uso de codones fue modificado para evitar
el
reconocimiento de intrones crípticos por la maquinaria de splicing de la planta;
b) la
serina 65 se reemplazó por una treonina para aumentar la luminiscencia de la
proteína
original y c) se adicionaron señales de transporte que permitieron la expresión
de GFP
en organelas donde los efectos tóxicos pueden tolerarse mejor.
La transparencia 49 muestra la expresión de GFP bajo microscopio de
epifluorescencia usando excitación de luz azul. En los paneles A y B se muestra
la
expresión del gen de GFP utilizando un promotor específico de polen (LAT59 de
tomate). El polen expresando GFP se desarrolló como una herramienta para
rastrear
el movimiento del polen transgénico en el ambiente. Las fotos muestran polen de
Nicotiana tabacum cv Xanthi que exhibe una segregación mendeliana 1:1 (A; 400x
de
aumento) y polen segregante transgénico y no transgénico sobre los pelos de la
pata
de una abeja (B; 100x de aumento). Los paneles C y D muestran expresión de GFP
en
plantas transgénicas de Arabidopsis thaliana. El panel C muestra cuerpos
fusiformes
dentro del retículo endoplásmico en células corticales del tallo. La proteína
GFP ha
sido dirigida al retículo por adición de una secuencia de anclaje HDEL. El panel
D
muestra células epidermales de hoja que exhiben fluorescencia en los tonoplastos
y
sub-poblaciones de vacuolas dentro de una vacuola central. El panel E muestra un
cultivo de células en suspensión de la línea BY2 de tabaco transformadas con el
gen
GFP, en las que se observa acumulación de la proteína GFP dentro del retículo
endoplásmico.
La transparencia 50 muestra plantas de tabaco transgénicas que expresan el gen
gfp
bajo el promotor AtSUC2 de la proteína de transporte de sacarosa en células del
floema de Arabidopsis thaliana. Las plantas AtSUC2-GFP se examinaron usando un
microscopio confocal para localizar la expresión de GFP e identificar los
patrones de
desarrollo del floema en diferentes estadios del desarrollo. La parte superior
de la
transparencia muestra el desarrollo basipétalo del floema (desde la base hacia
la
punta de la hoja) de la vena mayor en los cotiledones. GFP se expresa
inicialmente en
la vena central (vena clase I; A y B) y luego se extiende hacia la punta de la
hoja (vena
clase II; C). Finalmente, se expresa alrededor de la base de la hoja (D, E y F).
La parte
inferior de la figura muestra el desarrollo acropétalo de la vena central en
hojas
inmaduras. La descarga de GFP dentro de las hojas inmaduras en desarrollo ocurre
inicialmente desde la vena clase I (A y B), sigue por la parte basal de las
venas clase II
(C y D) y finaliza en la parte apical de las venas clase II (E y F).
Los genes reporteros no destructivos pueden usarse para observar el desarrollo
de
ciertos fenómenos biológicos en tiempo real. La transparencia 51 muestra la
expresión
de GFP en tabacos transgénicos de Nicotiana benthamiana. El gen gfp esta
dirigido
por un promotor constitutivo que permite su expresión en todos los tejidos. El
propósito
del ensayo es mostrar el desencadenamiento del fenómeno de silenciamiento génico
postranscripcional en plantas transgénicas en las que este fenómeno ha sido
inducido
artificialmente. La presencia de la proteína GFP se revela por la aparición de
color
verde o amarillo bajo iluminación ultravioleta. En ausencia de GFP, el tejido se
observa
de color rojo debido a la fluorescencia de la clorofila. A: Hoja de una planta
de
Nicotiana benthamiana no transgénica que emite fluorescencia roja debido a la
presencia de clorofila. B: Hoja de una planta transgénica de Nicotiana
benthamiana
que emite una fuerte fluorescencia verde debido a la expresión del transgen gfp.
C:
Planta transgénica para gfp infiltrada 18 d antes con Agrobacterium tumefaciens
portador del gen reportero gfp en que se puede observar la progresión del
silenciamiento de GFP en una hoja inferior (flecha).
Un gen reportero no destructivo menos utilizado (básicamente por el costo de los
sustratos y por los tiempos implicados en el ensayo) es el de la luciferasa. La
transparencia 52 muestra una planta de Nicotiana tabacum expresando el gen Luc
de
Photinus pyralis bajo el promotor constitutivo 35S de Cauliflower mosaic virus.
La
detección de fluorescencia se realizó sobre una película fotográfica expuesta
por
varios días a la emisión de la planta. El ensayo se basa en la medición de los
niveles
de luz producidas en una reacción catalizada por la enzima luciferasa:
luciferasa
ATP + luciferina + O2 
oxiluciferina + ampicilina + PPi + CO2 + luz
La intensidad de luz emitida es proporcional a la actividad de la enzima
luciferasa, la
que a su vez es dependiente de la temperatura. La temperatura óptima para la
actividad de la luciferasa es de entre 20 y 25 °C.
Sistemas de transferencia directa de ADN
Transparencias 53-99
Los diferentes métodos desarrollados para la transformación genética de plantas
pueden agruparse en dos clases principales de acuerdo con el mecanismo utilizado
para la transferencia de ADN. Como muestra la transparencia 4, en una clase se
encuentran aquellos métodos basados en la utilización de vectores biológicos,
como el
Agrobacterium o los virus vegetales, y en otra clase, aquellos que consisten en
la
transferencia directa del ADN. El rango natural de hospedantes de Agrobacterium
se
constituyó en un importante factor limitante en los primeros intentos por
transformar
monocotiledóneas y algunas dicotiledóneas que no eran susceptibles a la
bacteria. En
consecuencia, se desarrollaron métodos alternativos de transferencia de ADN
basados
en procedimientos de naturaleza química, fisicoquímica, o mecánica. Estos nuevos
métodos, conocidos como de transferencia directa, permiten transferir ADN
desnudo
sin la mediación de vectores biológicos. Entre estos últimos, se incluyen
métodos tales
como el bombardeo con micropartículas (biobalística), la permeabilización de
membranas celulares inducida por corrientes eléctricas (electroporación) y/o por
tratamientos químicos con policationes (PEG, PVP) o fusógenos lipídicos, la
abrasión
con fibras de carburo de silicio y la microinyección. El bombardeo de
micropartículas
es el más ampliamente utilizado.
Los métodos de transferencia directa presentan diversas ventajas y desventajas
al ser
comparados con los métodos mediados por vectores biológicos. Entre las ventajas:
a)
son considerados universales porque, al no incluir organismos vectores, pueden
aplicarse a cualquier especie, independientemente de su susceptibilidad a la
infección
por parte de los mismos. Es decir, que su expresión no será dependiente de la
interacción vector-hospedador; b) no requieren la eliminación de las células del
organismo vector de los tejidos o plantas transgénicas, como sucede en la
transformación mediada por Agrobacterium; c) las construcciones son más simples
y
pequeñas, ya que no son necesarias secuencias particulares, como las de la
región vir
o los bordes del plásmido Ti; d) es más fácil la co-transformación con dos o más
genes; e) son útiles para estudiar función y regulación génica, como así también
actividad de promotores, ya que en este tipo de métodos la expresión transitoria
suele
ocurrir en forma muy temprana. El transgén puede ser transcripto en el núcleo y
traducido en el citoplasma independientemente de su integración al genoma
nuclear.
Entre sus desventajas: a) pueden conducir a una alta frecuencia de re-arreglos
del
transgén; las células transformadas generalmente contienen secuencias
fragmentadas
del transgén y del vector en varios sitios del genoma; b) la inserción de
múltiples
copias del transgén es más frecuente que en el caso de los sistemas basados en
vectores biológicos. Estas dos cuestiones implican que en la transformación
directa
existe una mayor probabilidad de ocurrencia del silenciamiento génico, tanto a
nivel
transcripcional como post-transcripcional. Por regla general, con el fin de
atenuar su
incidencia de este fenómeno, se recomienda tomar ciertas precauciones: a)
reducir el
número de transgenes a transferir, b) evitar el uso de múltiples copias del
mismo
promotor o terminador y c) evitar el uso de promotores y transgenes con un alto
grado
de similitud a promotores o genes endógenos.
Transformación por biobalística o bombardeo de micropartículas
Transparencias 55-82
El término “biobalística” deriva de la conjunción de “biológico y balística” o
dicho de
otro modo “balística biológica”. Es común referirse a este método como bombardeo
de
partículas, bombardeo de micropartículas, aceleración de partículas, método del
cañón
génico, etc. La biobalística fue ideada y refinada por John Sanford, Theodore
Klein,
Edward Wolf y Nelson Allen en la Universidad de Cornell en los años 80. Este
procedimiento consiste en la utilización de partículas microscópicas
(microproyectiles)
cubiertas con moléculas de ADN o de ARN que son acelerados a alta velocidad para
atravesar la pared y las membranas celulares. Una vez que las partículas son
atrapadas en las células, el ARN puede ser traducido directamente o el ADN puede
ser transcripto y traducido, lo que permite observar expresión transitoria entre
24 y 72
horas después del bombardeo. Si las partículas bombardeadas son atrapadas en el
núcleo, el ADN puede integrarse de forma estable en los cromosomas mediante un
proceso de recombinación al azar, lo que se considera como un evento de
transformación estable. La transformación estable ocurre a muy baja frecuencia,
por lo
que es necesario utilizar un sistema de selección in vitro que permita
distinguir células
transformadas y no transformadas. El primer cañón génico era similar a una
pistola de
calibre 22 en la que un percutor generaba una explosión de pólvora impulsando
una
bala de plástico (macroproyectil) con las partículas de metal (microproyectiles)
y ADN
o ARN, hacia el tejido blanco.
En 1987, Klein et al. reportaron que era posible introducir ADN plasmídico en
células
epidérmicas de Allium cepa mediante bombardeo con partículas de tungsteno, y que
el
gen marcador cat de la enzima cloranfenicol acetiltransferasa era expresado en
niveles muy altos. Poco después, numerosos investigadores pusieron a prueba este
método en diferentes organismos obteniendo resultados positivos. Desde entonces,
el
bombardeo de micropartículas se constituyó en el segundo método de
transformación
genética de plantas más empleado, luego del de Agrobacterium. El bombardeo de
micropartículas es considerado un mecanismo universal, ya que, por su
naturaleza,
permite introducir ADN desnudo virtualmente en cualquier tipo de tejido o
célula. Ha
sido utilizado para introducir y expresar material genético no sólo en el genoma
de
plantas superiores sino también en bacterias, protozoarios, algas, hongos,
células y
tejidos animales (insectos, peces, aves y mamíferos) y aún animales y plantas in
vivo.
Hasta el presente, constituye el único medio que permite transformar organelas
celulares, como mitocondrias y cloroplastos de modo reproducible.
Se han identificado varios parámetros físicos, químicos y biológicos que
interactúan
entre sí y que condicionan la eficiencia del bombardeo de micropartículas y la
integración del material genético transferido. En consecuencia, al establecer un
protocolo de transformación, es necesario optimizar cada parámetro en forma
independiente, priorizándolos por la magnitud de sus efectos, y luego determinar
sus
interacciones en una escala más limitada. En la transparencia 58 se enumeran los
factores que influyen en la transferencia del ADN y los relacionados con las
construcciones genéticas utilizadas. La transparencia 59 enumera los factores
biológicos que condicionan la eficiencia de un ensayo biobalístico en relación
con el
tejido blanco a ser utilizado en la transformación.
Desde la aparición del primer dispositivo para bombardeo de micropartículas en
los
años 80, se han desarrollado diferentes cañones génicos con el objetivo de
refinar la
técnica, incrementando su seguridad, simplicidad y eficiencia. Además, se
procuró
dañar menos el tejido, aplicar una mayor aceleración a las micropartículas y
bajar los
costos de operación. Los nuevos diseños incluyen en su mayoría: a) el uso de una
fuerza impulsora reproducible y precisamente regulada; b) el uso de un
macroproyectil
que permite acelerar a las micropartículas depositadas sobre su superficie.
Además,
en general, estos dispositivos incorporaron una cámara de vacío en la que se
realiza el
disparo, lo que permite disminuir la desaceleración de las micropartículas por
el
rozamiento con el aire. La transparencia 60 enumera distintos sistemas de
impulsión
basados en: a) explosión química de pólvora seca; b) descarga de helio a alta
presión;
c) descarga de aire, CO2 o N2 comprimido; d) descarga eléctrica de alto voltaje
y baja
capacitancia o de bajo voltaje y alta capacitancia; e) flujo de partículas o
flujo de helio
a baja presión por aspersión; f) flujo de helio con cañón de precisión. La
elección del
sistema de impulsión influye considerablemente en el número de partículas que
impacta por unidad de área bombardeada. La figura de la transparencia 60 muestra
el
cañón génico original ideado por Sandford y colaboradores.
El cañón génico desarrollado inicialmente en la Universidad de Cornell
(transparencia
56) operaba de forma similar a una pistola, en la que un macroproyectil
acelerado por
explosión de pólvora liberaba una salva de microproyectiles metálicos revestidos
de
ADN en el interior de las células blanco. Los primeros bombardeos se efectuaron
con
microproyectiles de tungsteno de 4 m de diámetro suspendidos en H2O,
depositados
sobre un macroproyectil de Teflón. El macroproyectil era acelerado por explosión
de
pólvora a una velocidad de unos 800 m/seg hacia las células blanco situadas a
10-15
cm de la salida del cañón. Como se muestra en el esquema, luego del impacto, el
macroproyectil quedaba retenido en una placa de retención ubicada en la
extremidad
del tubo de aceleración. Los microproyectiles eran impulsados hacia el tejido
blanco a
través de un orificio existente en la placa. Aunque el modelo de pólvora
permitió la
transferencia de ADN a diferentes especies, las dificultades para controlar la
potencia
del disparo en forma reproducible y el daño físico provocado a las células
limitó el
número de transformaciones estables.
Entre las modificaciones más notables introducidas al diseño de los cañones
génicos
figura el reemplazo de la carga de pólvora por presión de gas para generar el
impulso
de las micropartículas. El primer dispositivo que utilizó esta forma de
impulsión fue el
cañón PDS-1000 de Dupont, basado en una descarga de helio o nitrógeno
comprimido. El modelo más utilizado en la actualidad es el cañón de alta presión
de
helio PDS-1000/He, el que fue patentado por Dupont y es comercializado por la
compañía BioRad (transparencias 61 y 62). El mismo consta de los componentes
necesarios para la transferencia de alta presión de helio (regulador del helio,
válvula
solenoide, tubos conectores, membrana de ruptura), de un componente portador del
macroproyectil y de una cámara principal en donde se bombardea el tejido blanco
en
condiciones de vacío parcial. Al accionar el sistema, se establece vacío dentro
de la
cámara de disparo y el helio es liberado hacia la misma luego que la membrana de
ruptura se rompe por exceso de presión. El movimiento del helio a alta velocidad
impulsa el macroproyectil que porta las micropartículas recubiertas de ADN, las
que
son así aceleradas hacia el tejido blanco. Este dispositivo asegura una
aceleración
reproducible de las micropartículas y los tejidos resultan menos dañados que en
el
caso de los cañones impulsados por pólvora.
Las transparencias 63-64 ilustran los distintos pasos del procedimiento de
bombardeo.
El primer paso involucra la preparación de las micropartículas, la precipitación
del ADN
sobre las mismas y el ensamblaje de las distintas partes del cañón que
comprenden el
sistema de impulsión de los microproyectiles. Para ello, se desenrosca el
soporte de la
membrana de ruptura, se escoge una membrana de ruptura del espesor apropiado y
se la coloca en el soporte correspondiente. A continuación, se ajusta el soporte
al
extremo del tubo de salid de gas. El espesor de la membrana de ruptura varía
según la
presión de helio con la que se quiera trabajar (existen membranas que van de los
300
psi hasta los 2.200 psi). La presión de ruptura determina el poder de la onda de
choque que impacta en la cámara. Si se incrementa la presión de helio, se
incrementa
la aceleración de las micropartículas y, en consecuencia, su penetración en el
tejido
blanco.
La transparencia 64 ilustra los pasos siguientes en la preparación del cañón
para el
bombardeo. Una vez que se ha colocado el macroproyectil sobre su respectivo
retén,
se toma una alícuota de las micropartículas recubiertas de ADN y suspendidas en
H2O
o etanol y se la deposita sobre el mismo. Cuando la alícuota se seca, el retén
es
invertido (de manera tal que los microproyectiles queden enfrentados con las
células
blanco) y colocado en el lanzador. En el mismo dispositivo, se agrega una malla
de
retención que frenará al macroproyectil luego de completar su desplazamiento. En
principio, cualquier material puede ser empleado como micropartícula
transportadora
de ADN, siempre que sea de alta densidad, químicamente inerte y de tamaño y
formato adecuados. Las micropartículas metálicas de oro o tungsteno son las más
utilizadas. Las de tungsteno son de formato irregular, de tamaño de 0,2 a 3 m.
Su
costo es bastante reducido, por lo que son comúnmente elegidas. Sin embargo, son
potencialmente tóxicas para algunos tipos de células y están sujetas a oxidación
rápida, con la consecuente degradación del ADN. Las micropartículas de oro son
biológicamente inertes, de formato redondeado y de tamaño más uniforme de entre
0,6 a 3 m. Su principal desventaja es su alto costo. Las características
mencionadas
deben ser evaluadas en distintos tipos de células blanco de modo de optimizar el
proceso de bombardeo.
La transparencia 66 muestra un esquema de los parámetros que pueden variarse en
el
dispositivo de un cañón génico y de las relaciones existentes entre las
principales
variables y la velocidad de los microproyectiles. En cada bombardeo realizado
con el
cañón PDS1000/He, la velocidad que alcanzan los microproyectiles es condicionada
por: a) la presión de helio elegida; b) la presión negativa alcanzada en la
cámara de
disparo; c) la distancia (A) entre la membrana de ruptura y el macroproyectil;
d) la
distancia (B) de desplazamiento del macroproyectil desde su posición original
hasta el
impacto contra la malla de retención; e) la distancia (C) de desplazamiento de
los
microproyectiles desde la malla de retención hasta el tejido. Variando la
presión y las
distancias (A, B y C), se puede modificar la velocidad de los microproyectiles,
lo que
permite optimizar los protocolos según el objetivo de transformación y tejido
blanco.
Existen modelos alternativos al cañón PDS 1000/He que permiten regular la
presión
del gas a la cual se desea producir el bombardeo. La regulación se efectúa por
medio
de una válvula eléctrica, dentro de un rango de presiones de 200 a 1500 psi. Al
accionar un control eléctrico, la fuerza electromagnética generada por un
solenoide
produce el desplazamiento de una aguja que perfora las membranas de ruptura
permitiendo la salida del helio (en contraste con el cañón PDS1000/He en que la
membrana de ruptura se rompe pasivamente por exceso de presión). El dispositivo
que se muestra en la transparencia 67 fue desarrollado en EMBRAPA-CENARGEN
(Brasil) y ha sido utilizado exitosamente en la transformación de Glycine max,
Phaseolus vulgaris, Gossypium hirsutum, entre otros.
El Genebooster (transparencia 68) es otro tipo de cañón génico, producido por
ELAK
(Budapest) y desarrollado por el Centro de Biotecnología Agrícola del Instituto
de
Ciencias Vegetales de Hungría. Mediante este dispositivo, las partículas son
impulsadas hacia el tejido blanco por liberación de nitrógeno comprimido a alta
presión. En este caso, los controles de presión y vacío se encuentran en una
unidad
separada de la cámara de disparo. El proceso de disparo es controlado por un
sistema
electrónico automático. La energía del disparo es ajustada según el espesor de
la
pared celular del tejido blanco. Los ajustes de los parámetros de cada disparo
pueden
ser archivados por una computadora conectada al dispositivo. Este cañón ha sido
usado con éxito en la transformación de Oryza sativa y también para obtener
expresión transitoria en estudios de promotores específicos para diferentes
tejidos
(hoja, hipocótilo, embrión, escutelo, callo, cotiledón) de varias especies
vegetales.
Entre sus ventajas, pueden mencionarse: a) control automático de los disparos;
b)
registro computarizado de los ajustes de cada disparo; c) control continuo de la
energía de disparo; d) alta penetración a través de paredes celulares; e) alta
frecuencia de transformación en especies recalcitrantes; f) bajo costo (gas
barato,
placas de retención reciclables).
En 1996 hizo su aparición la pistola génica de mano como una alternativa al
cañón
PDS 1000/He. En contraste con los cañones génicos convencionales, en que el
tamaño del tejido blanco está limitado por el tamaño de la cámara y el explanto
es
sujeto a vacío durante el bombardeo, este nuevo diseño no requiere vacío,
permite
trabajar con virtualmente cualquier tipo de células o tejido blanco y provee una
herramienta para transformar organismos in vitro o in vivo. El instrumento que
se
muestra en la transparencia 69 es comercializado por la compañía BioRad. La
pistola
trabaja con microproyectiles de oro recubiertos de ADN o ARN que son
precipitados
en la pared interna de un cartucho de plástico y acelerados por un flujo de
helio a
presión. Es posible preparar 50 cartuchos a la vez conteniendo cantidades
conocidas
de microproyectiles, los cuales pueden conservarse hasta dos meses previos a su
utilización. Los cartuchos se colocan en un soporte (figura C), el cual se
ensambla en
la pistola y se dispara. El sistema es rápido, versátil y permite la cotransformación con
más de un transgén. En la práctica los dos sistemas de helio, el cañón
PDS1000/He y
la pistola Helios, se complementan, dado que en el primero el vacío provee
condiciones ambientales más controladas en su cámara de disparo, mientras que el
último permite trabajar con una amplia variedad de tejidos o células blanco,
incluidos
organismos vivos. La transparencia muestra la pistola génica (figura A), el
porta
cartuchos (figura C), y un dispositivo (figura B) utilizado para preparar hasta
50
cartuchos por vez. El esquema inferior muestra el diseño interno de la pistola
génica.
La pistola génica constituye una valiosa herramienta para transferir ADN o ARN
en
organismos vivos sin utilizar cámara de vacío. Debido a que la pistola puede ser
dispuesta muy cerca del tejido a ser bombardeado, la trayectoria de las
partículas es
reducida y la desaceleración por fricción es muy baja. Estos cambios reducen el
trauma en tejidos frágiles y facilitan las manipulaciones. Sin embargo, los
parámetros
de bombardeo deben ser ajustados de acuerdo con el tipo de tejido blanco.
Algunos
reportes mencionan que una desventaja del sistema es la poca reproducibilidad
entre
experimentos. Sin embargo, este problema es frecuente en todos los sistemas de
bombardeo de partículas. Algunos autores recomiendan tomar recaudos especiales
para controlar mejor este problema, tales como trabajar con material vegetal
crecido
en las mismas condiciones o utilizar explantos de misma edad fisiológica.
La expresión transitoria temprana de genes reporteros es extremadamente útil en
el
monitoreo de la eficiencia de transferencia génica y en el ajuste de los
parámetros de
bombardeo. Asimismo, la expresión transitoria es sumamente utilizada para
estudios
de regulación y función génica, especificidad de promotores, etc. Las figuras de
la
parte superior de la transparencia 71 muestran la expresión transitoria del gen
uid A en
embriones inmaduros de centeno. Las diferencias en la expresión del gen se
relacionan con el uso de diferentes cantidades de microproyectiles para el
bombardeo:
(figura A) 200 g; (figura B) 100 g; (figura C) 30 g. Las figuras de la parte
inferior
muestran la diferencia de expresión transitoria del gen uid A observada en hojas
de
Arabidopsis thaliana bombardeadas con una pistola génica Helios (presión de
disparo,
75 psi) usando 125 g de micropartículas de oro y 1 g de ADN por disparo; con o
sin
malla difusora de micropartículas (A y B respectivamente).
El Geneboy es una pistola de mano ELAK (Budapest) y desarrollado por el Centro
de
Biotecnología Agrícola del Instituto de Ciencias Vegetales de Hungría. Mediante
este
dispositivo las micropartículas son impulsadas hacia el tejido blanco por
liberación de
CO2 a presión. Pueden utilizarse contenedores manuales de gas de diferente
capacidad para múltiples disparos. Esta pistola se ha utilizado con éxito en la
producción de plantas transgénicas de maíz. Este sistema permitió la
transferencia de
ADN in vivo en tejidos meristemáticos de especies leñosas como durazno, manzana,
etc. Entre sus ventajas más importantes, caben mencionar: a) bajo costo; b) no
requiere uso de cámara de vacío; c) alta eficiencia de penetración a través de
paredes
celulares; d) alta frecuencia de transformación en especies recalcitrantes; e)
fácil
manejo en condiciones de campo.
Otro sistema biobalístico alternativo se basa en la tecnología ACCELL™,
desarrollada
por la compañía Agracetus para permitir el máximo de flexibilidad de ajuste,
blanco y
penetración celular. Esta tecnología involucra el uso de una descarga eléctrica
a alto
voltaje para evaporar una gota de H2O. Los microproyectiles recubiertos de ADN
son
dispuestos sobre un disco de metal (macroproyectil) y posicionados en una cámara
de
vacío (transparencia 72). Una expansión explosiva generada por la descarga
eléctrica
(aproximadamente 14 kV desde un capacitor de 2 F) en una gota de agua acelera
el
complejo macroproyectil-microproyectiles hacia las células blanco. La
penetración del
tejido blanco puede ser finamente regulada variando la intensidad de la descarga
eléctrica. Mediante este procedimiento, las partículas pueden ser dirigidas a
una capa
específica del tejido. Esta capacidad es un atributo importante del sistema, aún
cuando
explantos idénticos de diferentes genotipos de la misma especie pueden requerir
diferentes condiciones de aceleración para una óptima penetración de las
partículas.
La aceleración provocada por la descarga eléctrica reduce el impacto provocado
en
las células blanco, en comparación con los sistemas basados en propulsión por
gases.
Sin embargo, a pesar de haber sido usado con éxito en la transformación de
numerosas especies y de las ventajas operativas del sistema, este sistema no ha
sido
adoptado en forma generalizada para la transformación de plantas.
Un dispositivo de bajo costo, que puede usarse como alternativa a los
instrumentos
más sofisticados, es el cañón de chorro de partículas (PIG; Particle Inflow
Gun). El
mismo puede ser fácilmente construido en el laboratorio con medios relativamente
económicos. Este cañón hace uso de una válvula eléctrica para generar un chorro
de
helio a baja presión, el cual acelera las micropartículas dentro de una cámara
de vacío
(28-30 pulgadas de Hg) y las proyecta hacia las células blanco. La
micropartículas
recubiertas de ADN son dispuestas en una jeringa con filtro que se acopla a un
adaptador conectado a la válvula solenoide. Este instrumento ha sido
exitosamente
usado para transformar Glycine max, Zea mays, Manihot esculenta y Musa spp.
Existe
una versión del PIG en el cual se ha eliminado la cámara de vacío y que se ha
usado
para transformar Oryza sativa. A pesar del bajo costo del sistema, su uso no ha
sido
tan difundido como el de los cañones mencionados anteriormente.
Sautter et al. desarrollaron un diseño alternativo de cañón génico que combina
características del método de microinyección con la biobalística. Fue ideado
para el
bombardeo de meristemas apicales y permite apuntar el disparo en áreas de 100 a
200 m de diámetro. El tejido blanco es montado sobre una capa de agarosa en una
gota de alginato. No utiliza macroproyectiles y el ADN no es precipitado con los
microproyectiles sino mezclado con los mismos y transferido en conjunto con los
mismos en una pequeña gota de líquido desde un tubo capilar conectado a un tubo
Pitot. Para romper la gota, se usa un flujo de CO2 o de N2 a alta presión que
forma un
aerosol y fuerza a las partículas a través de una pequeña apertura (aspersión de
gotas
microscópicas). A partir de allí, las partículas son aceleradas a través de un
capilar a
una cámara con vacío parcial en que se encuentra el tejido blanco. La longitud
de este
último capilar determina la velocidad de las partículas y su diámetro determina
el área
de impacto en determinadas condiciones de vacío, presión y distancia de trabajo.
Los
parámetros de disparo pueden adaptarse dentro de un amplio rango. Un dispositivo
de
enfoque permite dirigir las partículas a un meristema individual. Como se
muestra en el
esquema de la derecha, el área del blanco es determinada con una mira. En el
mismo,
se observa el meristema apical de una plántula de cereal luego del bombardeo y
la
distribución de las partículas bajo la mira utilizada para apuntar el cañón. El
área
apuntada tiene un diámetro de 150 m. La segunda capa celular, que dará origen a
las
células germinativas, se señala con el dibujo de los núcleos. Este sistema ha
sido
utilizado en diferentes plantas como Triticum aestivum, Sorghum bicolor y otras
gramíneas, aunque los resultados obtenidos no satisficieron las expectativas
para lo
cual fue diseñado.
La transparencia 73 muestra ejemplos de especies de monocotiledóneas
transformadas por biobalística, junto con el tipo de tejido blanco, genes
reporteros y
genes marcadores de selección usados.
uid A: gen de la enzima -glucuronidasa de Escherichia coli.
cat: gen de la enzima cloranfenicol acetiltransferasa de Escherichia coli
luc: gen de la enzima luciferasa de Photinus pyralis
bar: gen de la enzima fosfinotricina acetiltransferasa de Streptomyces
hygroscopicus
csr-1/als: gen de una forma alterada de la enzima sintasa del ácido
acetohidroxil, también
conocida como acetolactasa sintasa, de mutantes de Arabidopsis thaliana.
hpt: gen de la enzima higromicina fosfotransferasa de Escherichia coli.
npt II: gen de la enzima neomicina fosfotransferasa II de Escherichia coli.
A diferencia de la transformación vía Agrobacterium, los procedimientos de
transformación por biobalística no requieren el uso de vectores especiales. Como
fuente de ADN para el bombardeo, es posible utilizar los plásmidos comúnmente
usados en las manipulaciones de ingeniería genética conteniendo las
construcciones
genéticas de interés. En algunos casos, se ha obtenido mayor eficiencia de
transformación cuando los plásmidos son linealizados. El promotor más
ampliamente
utilizado para inducir la expresión de genes en plantas es el promotor
constitutivo 35S
del virus del Mosaico de Coliflor (CaMV; Cauliflower mosaic virus).
Generalmente, este
promotor brinda altos niveles de expresión en dicotiledóneas. Sin embargo, no
ocurre
lo mismo en monocotiledóneas, en las que se utilizan en forma alternativa
promotores
como el del gen ubi1 (ubiquitina) de maíz y el del gen act1 (actina) de arroz.
La tabla
de la transparencia 74 muestra ejemplos de promotores utilizados en la
transformación
de cereales y de sus actividades relativas.
Emu: Promotor modificado de alcohol deshidrogenasa de maíz
Act1-Act1 intrón1: Promotor e intrón de actina de arroz
Ubi1-Ubi1 intrón: Promotor e intrón de ubiquitina de maíz
35S: Promotor de 35S de CaMV
35S-Adh1 intron 1: Promotor de 35S de CaMV e intrón de alcohol deshidrogenasa de
maíz
La transparencia 75 muestra ejemplos de especies de dicotiledóneas transformadas
por biobalística junto con los tejidos blanco, genes reporteros y genes
marcadores de
selección que demostraron ser eficientes.
uid A: gen de la enzima -glucuronidasa de Escherichia coli
gfp: gen de la proteína de fluorescencia verde de Aequorea victoria
bar: gen de la enzima fosfinotricina acetiltransferasa de Streptomyces
hygroscopicus
hpt: gen de la enzima higromicina fosfotransferasa de Escherichia coli
npt II: gen de la enzima neomicina fosfotransferasa II de Escherichia coli.
csr-1: gen de una forma alterada de la enzima sintasa del ácido acetohidroxil,
también conocida
como acetolactasa sintasa, de mutantes de Arabidopsis thaliana.
Al elegir un tejido blanco para la transformación por biobalística, nuevamente
debe
tenerse en cuenta la capacidad de la especie de interés para regenerar in vitro.
Entre
los explantos vegetales utilizados con mayor éxito, se encuentran las
suspensiones
celulares, meristemas, embriones en desarrollo, embriones maduros, embriones
somáticos, primordios foliares, cotiledones y callos. En la transparencia 76 se
muestran algunos explantos comúnmente usados en protocolos de biobalística. Una
de las estrategias ampliamente utilizadas para favorecer la recuperación de los
tejidos
luego del bombardeo es la aplicación de baños en antioxidantes para prevenir la
oxidación de los explantos. Para facilitar el ingreso de los microproyectiles en
el núcleo
celular, los explantos suelen ser cultivados en medios conteniendo sustancias
osmóticas (como manitol) que provocan plasmólisis reversible de las células.
Así, la
menor turgencia de las células, hace que las mismas resulten menos dañadas por
el
impacto de los microproyectiles. Por otro lado, el pasaje de los explantos a
medio
fresco previo al bombardeo aumenta la tasa mitótica, favoreciendo así la
integración
del ADN foráneo al genoma vegetal.
El bombardeo de micropartículas ofrece una alternativa altamente eficiente e
independiente del genotipo para la transformación de Oryza sativa. A la fecha,
han
sido transformadas más de 40 variedades de arroz por esta técnica. Los explantos
más utilizados son embriones inmaduros y callos derivados de semillas. El
antibiótico
preferentemente usado como selector es higromicina. El procedimiento se basa en
el
bombardeo de embriones inmaduros a partir de los cuales se obtienen callos en
medio
selectivo. Estos callos puede dar lugar a la regeneración de plantas
transgénicas en
medios conteniendo los reguladores de crecimiento adecuados.
La transparencia 77 muestra resultados de transformación de Oryza sativa
utilizando
el sistema de bombardeo con micropartículas. En este caso, los explantos
bombardeados son callos embriogénicos de 6 variedades de élite que expresaron
actividad GUS positiva 24 hs después del bombardeo. Se les transfirió
simultáneamente el gen bar y el gen hpt. Se obtuvieron plantas completas a
partir de
callos cultivados en selección con higromicina y glufosinato de amonio. En las
figuras,
se observan los callos embriogénicos transformados, la expresión transitoria del
gen
uid A en los mismos, y la regeneración de brotes a partir de los callos en
selección con
glufosinato de amonio.
La transformación por biobalística puede implementarse eficientemente no sólo en
el
caso del arroz, sino también en otras especies de monocotiledóneas como Festuca
arundinacea. La transparencia 78 ilustra el procedimiento de transformación de
esta
especie basado en la inducción de callos embriogénicos y en el establecimiento
posterior de suspensiones celulares embriogénicas. Estas suspensiones celulares
son
utilizadas como tejido blanco para la transformación por biobalística. Luego del
bombardeo, éstas son puestas en selección con higromicina. En la transparencia
se
diferencian las suspensiones celulares transgénicas (resistentes a la selección
y de
color amarillento) de las suspensiones susceptibles a higromicina, de color
marrón.
La biobalística es una de las técnicas más ampliamente utilizadas en la
transformación
genética de Glycine max (soja). Desde hace más de 10 años, se han documentado
numerosos eventos de transformación por bombardeo de micropartículas que
incluyen
el uso de distintos dispositivos de aceleración como los cañones PDS 1000/He,
PIG, o
Accell, mencionados anteriormente. Las variedades transgénicas comerciales
tolerantes al herbicida glifosato han sido obtenidas por biobalística. Los
tejidos o
suspensiones embriogénicas de soja, así como también los meristemas apicales son
los explantos más utilizados en esta especie. En cuanto a los agentes de
selección, el
antibiótico higromicina y el herbicida imazapyr han sido reportados como los más
eficientes. La transparencia 79 muestra diferentes etapas en el proceso de
transformación de soja. Los cultivos embriogénicos, derivados de cotiledones
inmaduros, fueron bombardeados con un cañón génico PDS 1000/He y puestos en
medio de selección con higromicina. Aquellos explantos que sobrevivieron a la
selección, continuaron siendo cultivados a través de diferentes estadios
embrionarios
hasta su conversión en plantas completas. En la foto B puede observarse la
expresión
transitoria del gen uidA en un ensayo histoquímico.
La biobalística también ha sido un instrumento eficiente para la transformación
de
Manihot esculenta Crantz (mandioca) a partir de cotiledones. En la transparencia
80 se
observan cotiledones bombardeados (figura A) con un cañón génico de chorro de
partículas (PIG), que expresan transitoriamente el gen uidA. A partir de los
cotiledones
se obtuvieron brotes en selección con higromicina (figuras B y C), los cuales
regeneraron plantas completas (figuras D y E). Se constató la expresión estable
del
gen uidA en hojas (figura F).
Las figuras de la transparencia 81 muestran la expresión transitoria del gen que
codifica la Proteína de Fluorescencia Verde (GFP) en embriones somáticos de
Glycine
max (figuras A y B) y Triticum aestivum (figuras C, D y E) y la expresión
estable del
mismo gen en hojas de Petunia hybrida (figura F). Todos los explantos fueron
bombardeados con un cañón génico de chorro de partículas (PIG).
Junto con los métodos basados en Agrobacterium tumefaciens, el bombardeo de
micropartículas es una de las técnicas más usadas para la transformación
genética de
plantas. Asimismo, el bombardeo con micropartículas se ha usado con éxito para
transformar animales, microorganismos y organelas como cloroplastos y
mitocondrias.
El método es sumamente útil para analizar la función y regulación génica,
encarar
problemas que requieren expresión transitoria o integrativa, transferir ARN
viral y
estudiar vías metabólicas. Tradicionalmente se ha adherido el ADN a
microproyectiles
de oro o tungsteno para ser transferido, pero también se ha hecho lo mismo con
bacterias, levaduras o fagos. Asimismo, se ha utilizado el sistema de bombardeo
como
estrategia complementaria en la transformación mediada por Agrobacterium para
provocar orificios en los tejidos blanco y facilitar así la entrada de la
bacteria. Sin
embargo, las técnicas de bombardeo presentan limitaciones tal como se discutirá
más
adelante. Algunas especies oponen una resistencia natural a la penetración de
las
partículas, dada por cutículas endurecidas, paredes celulares lignificadas o
superficies
vellosas. La principal limitación del método continúa siendo la baja relación
entre el
total de células sometidas al bombardeo y el número de células que logran
incorporar
de manera permanente el transgen.
Transferencia de ADN mediada por electroporación y/o métodos químicos
Transparencias 83-93
Otro sistema de transferencia directa de ADN se basa en la permeabilización de
las
membranas plasmáticas de los protoplastos para favorecer el ingreso del material
genético. Las paredes celulares representan barreras físicas significativas para
la
transferencia de ADN, mientras que los protoplastos, por tratarse de células
desprovistas de paredes celulares, constituyen un tipo de explanto blanco más
apropiado. La obtención de protoplastos requiere la incubación de tejido vegetal
en un
medio suplementado con enzimas fúngicas pectocelulolíticas para digerir las
paredes
celulares, siendo necesario en algunos casos el agregado de hemicelulasas. Las
celulasas y hemicelulasas degradan la pared celular, en tanto que las pectinasas
digieren la matriz de pectina que mantiene adheridas a las células. El uso de
enzimas
disponibles comercialmente posibilitó el aislamiento de protoplastos de
prácticamente
cualquier tejido vegetal, siempre que el mismo no esté lignificado.
Luego de la digestión, los protoplastos deben ser aislados y lavados. Por otro
lado,
con el objetivo de optimizar la transferencia de ADN a protoplastos, se utilizan
distintas
técnicas que incrementan la permeabilidad de las membranas plasmáticas. Es común
el uso de policationes tales como polietilenglicol (PEG), polivinil alcohol
(PVA) y DEAdextrano que actúan como fusógenos e incrementan la endocitosis del
ADN debido a
que sus cargas positivas interaccionan con las cargas negativas del ADN y de la
membrana plasmática. Además del uso de fusógenos, los tratamientos con Ca2+ y
calor pueden incrementar la precipitación del ADN. La obtención de la primera
planta
transgénica viable derivada de protoplastos de Nicotiana sp. se reportó en 1984.
La
transformación de protoplastos en soluciones que contienen PEG provee
frecuencias
relativamente bajas de plantas transgénicas. Sin embargo, debido al gran número
de
células disponibles en estos sistemas, si se dispone de buenos métodos de
selección
y de protocolos de regeneración eficientes, es siempre posible obtener plantas
transgénicas. Una contribución a la transformación mediada por PEG fue la fusión
con
liposomas. En este caso, el ADN es previamente incorporado a liposomas, a partir
de
las cuales es transferido a las células. Los liposomas están constituidos por
lípidos de
carga neutra similares a los que componen la membrana plasmática y pueden ser
producidos en diversos tamaños. El ADN es empaquetado in vitro y luego
transferido a
los protoplastos. Para hacer más eficiente la fusión se utilizan tratamientos
con PEG u
otros policationes. Aunque el sistema es muy laborioso y la eficiencia de
transformación es baja, se ha reportado la obtención de plantas transgénicas de
tabaco y trigo por esta técnica. La transparencia 84 muestra un esquema
representativo del aislamiento y purificación de protoplastos de hojas de
Nicotiana
tabacum. Las hojas cosechadas son puestas en contacto con la solución enzimática
durante 16 h, al cabo de las cuales se procede a separar los protoplastos del
tejido no
digerido.
Un método alternativo para permeabilizar las membranas celulares y facilitar el
ingreso
del ADN es la electroporación, la que consiste en exponer a las células
vegetales a
intensos campos eléctricos para provocar la apertura de poros y promover la
captura
del ADN. Los protoplastos se obtienen siguiendo los pasos mencionados en la
transparencia anterior, se incuban luego en una solución buffer conteniendo el
ADN
(plásmido con el gen de interés y el gen de selección) y son expuestos a pulsos
eléctricos de alto voltaje y de duración variable. El campo eléctrico causa la
formación
de poros reversibles en la membrana plasmática, permitiendo así el pasaje de ADN
a
la célula. Se han determinado las condiciones óptimas para la transformación de
células de distintas especies, incluyendo la intensidad del campo eléctrico, la
densidad
de protoplastos y la composición del buffer de cultivo. La electroporación sola
no
produce altas tasas de transformación, pero la eficiencia puede incrementarse
acoplándola al uso de policationes como el polietilenglicol (PEG). La
transformación
por electroporación ha sido documentada en una amplia variedad de especies y
tipos
de tejidos, pero la disponibilidad de protocolos de regeneración de plantas
enteras a
partir de protoplastos resulta una limitante en la mayor parte de los casos. La
transparencia 85 muestra los pasos a seguir para la transformación de
protoplastos de
tabaco por electroporación. Se muestran también distintas tipos de cubetas y
electroporadores comerciales.
La transparencia 86 muestra distintas fases del cultivo de protoplastos
electroporados
con un gen que confiere resistencia a kanamicina y de la regeneración de plantas
de
Nicotiana tabacum a partir de los mismos. A: protoplastos luego de la
electroporación;
B: protoplastos cultivados en división; C: protoplastos formando callos en medio
con
kanamicina (izquierda) y sin kanamicina (derecha); D: plantas en medio de
enraizamiento con kanamicina (planta resistente a la izquierda y planta no
resistente a
la derecha); E: plantas floreciendo; F: germinación en medio selectivo. Las
plantas
transgénicas continúan desarrollándose mientras que las no transgénicas se
tornan
cloróticas.
La transparencia 87 muestra un esquema de la transformación de protoplastos de
Oryza sativa por electroporación. En este protocolo, la formación de callos de
los
cuales se obtienen los protoplastos se induce a partir de semillas. Luego de la
electroporación, los protoplastos son cultivados en medio líquido junto a
células
nodrizas de tabaco, las que han sido elegidas por su alta tasa mitótica. Los
factores
mitogénicos secretados por las mismas inducen la división de los protoplastos.
Como
se muestra en el panel inferior, los protoplastos pueden cultivarse mezclados
con las
células nodrizas o separados de las mismas por membranas de tipo Millicell
(filtro de
nylon, papel de filtro Millipore u hoja de celofán). Uno de los agentes
selectores que
mejor actúan en arroz es el antibiótico higromicina. En este caso, se realizó
una doble
selección con higromicina de los callos obtenidos a partir de protoplastos
electroporados antes de inducir la regeneración de plantas completas.
Es también posible co-transformar protoplastos por electroporación. En la
transparencia 88 se muestra una etapa del protocolo de transformación de
protoplastos de arroz con dos plásmidos diferentes. Uno de los plásmidos porta
el gen
hmr de resistencia a higromicina y el otro, el gen de interés no seleccionable
más el
gen reportero uidA. Luego de la electroporación, los protoplastos son cultivados
en
medio suplementado con higromicina. Los protoplastos que resisten la selección
son
cultivados en un medio con reguladores de crecimiento para estimular la
regeneración
de la pared celular y la división celular. Las células se dividen formando
colonias y tras
sucesivos subcultivos en diferentes medios regeneran plantas completas por
organogénesis o embriogénesis. Un porcentaje considerable de los protoplastos
electroporados incorpora simultáneamente el gen de resistencia a higromicina, el
gen
de interés y el reportero y, en consecuencia, las plantas derivadas de éstos
poseen los
dos genes. Para diferenciar estas plantas de aquellas derivadas de protoplastos
que
sólo incorporaron el gen de selección, es necesario determinar la presencia de
los
genes de interés en un análisis posterior. Generalmente, esto se realiza
utilizando la
técnica de PCR e iniciadores específicos.
La transparencia 89 muestra fotografías del aislamiento, cultivo y
electroporación de
protoplastos de Citrus sinensis (naranjo dulce) obtenidos a partir de callos
embriogénicos y del proceso posterior de regeneración de plantas completas. Los
explantos expresan de forma transitoria y estable el gen de la Proteína de
Fluorescencia Verde (gen gfp), el que ha sido utilizado como gen reportero.
La tabla de la transparencia 90 muestra ejemplos de especies vegetales
transformadas por métodos químicos (fusión mediante policationes, tratamiento
con
liposomas) y/o por métodos de electroporación de protoplastos. Se informan los
genes
de selección y los agentes selectores usados. Aunque la transformación de
protoplastos resulta un método relativamente simple y efectivo, no se utiliza
con
mucha frecuencia, especialmente por la escasa disponibilidad de protocolos
optimizados para regenerar plantas a partir de protoplastos.
Si bien la electroporación se utiliza como técnica de transformación de
bacterias y
protoplastos, también ha sido empleada para transferir ADN a células o tejidos
intactos, es decir que presentan paredes celulares. Los explantos vegetales
utilizados
en este caso pueden ser microesporas, polen, fragmentos de hoja, embriones,
callos,
semillas o yemas. En algunos casos, los explantos son pre-tratados con
soluciones
enzimáticas (degradación parcial de las paredes celulares) o heridos en forma
mecánica para facilitar la entrada del ADN. Se han reportado resultados
positivos de la
transformación de células o tejidos intactos por electroporación de Oryza
sativa,
Nicotiana tabacum, Triticum aestivum, Zea mays, Citrus sp, etc. La transparencia
91
muestra un dispositivo (figura A) usado para transformar embriones de Triticum
aestivum. La electroporación se realiza en una cámara especial en la que los
embriones son montados en gotas de alginato sobre discos de agarosa (figuras B,
C, y
D). Durante la electroporación los embriones quedan en contacto con el buffer de
electroporación enfrentados con el cátodo de la cámara de electroporación
(figura D).
La transparencia 92 muestra diferentes tejidos de Coffea arabiga (cafeto)
electroporados sin pretratamiento enzimático (figuras A y B) y con
pretratamiento
enzimático (figuras C-F) en los que se observa expresión transitoria del gen
uidA. Los
embriones somáticos en estado de torpedo resultaron ser los explantos más
apropiados para la transformación por electroporación. Este hecho se manifiesta
en el
incremento de la frecuencia de expresión transitoria del gen uidA y en un
aumento de
la capacidad regenerativa de los embriones. El autor de este trabajo concluye
que el
pretratamiento con enzimas facilita el ingreso del ADN.
La transparencia 93 muestra los resultados de la transformación de pro-embriones
de
Nicotiana tabacum mediante electroporación sin previa permeabilización de las
membranas. Los pro-embriones expresan transitoriamente los genes reporteros uid
A
y gfp.
Transformación con whiskers de carburo de silicio
Transparencias 94-95
En 1990 se reportó una nueva técnica de transferencia de ADN que utiliza fibras
muy
finas, conocidas como whiskers, para generar orificios en las paredes celulares.
Las
fibras más utilizadas en este método son cristales de carburo de silicio de 0,30,6 m
de diámetro y 10-100 m de longitud. Las fibras de silicio se agregan a una
suspensión conteniendo el tejido vegetal (por ejemplo suspensiones celulares,
embriones o callos) y ADN plasmídico, y luego se mezclan con un agitador tipo
Vortex.
Como resultado de la agitación, los whiskers penetran la pared celular y la
membrana
plasmática, permitiendo el ingreso del ADN. La eficiencia de la técnica depende
del
tamaño de la fibra, los parámetros de mezcla (agitación), la forma de los
recipientes
utilizados, el material vegetal y las características de las células vegetales,
especialmente el espesor de la pared celular. Las principales ventajas de este
método
residen en su bajo costo y en la rapidez y sencillez con que pueden realizarse
los
ensayos. Sus principales desventajas son la baja eficiencia de transformación,
la
disminución de la capacidad regenerativa de los tejidos dañados por el proceso y
la
necesidad de trabajar con extrema precaución debido a la toxicidad del carburo
de
silicio para la salud humana. Aunque el proceso ha sido utilizado con callos
friables,
este tipo de callo está limitado a unos pocos genotipos de maíz y avena. Muchos
cereales producen callos embriogénicos muy compactos y duros que no son
fácilmente transformables por este método. Sin embargo, se han introducido
mejoras a
la técnica que permitieron la transformación transitoria y estable de Oryza
sativa,
Triticum sp., Hordeum vulgare, Zea mays, Nicotiana tabacum, Lolium multiflorum,
Lolium perenne, Festuca arundinacea y Agrostis stolonifera, sin necesidad de
iniciar
suspensiones celulares. La transparencia 95 muestra la transformación de
suspensiones celulares de maíz con whiskers de carburo de silicio. Las
suspensiones
celulares fueron puestas en una solución conteniendo los whiskers y el ADN
plasmídico portando los genes uidA y bar. La mezcla fue agitada con la ayuda de
un
dispositivo de tipo Vortex (figura A). La incorporación del ADN fue corroborada
por la
expresión transitoria del gen uidA (figura B). Las células transformadas
formaron callos
en selección con fosfinotricina (figura C) y regeneraron plantas transgénicas
(figuras D,
E y F). El tratamiento con herbicida reveló que las plantas han heredado el gen
bar en
forma mendeliana (figura F). Este trabajo fue el primero en que se reportó la
producción de plantas transgénicas mediante whiskers de carburo de silicio.
Transferencia de ADN por microinyección
Transparencias 96-99
La microinyección es un método de transferencia directa, mediante el cual se
inyecta
ADN en las células utilizando pipetas microcapilares de vidrio bajo control
microscópico. Esta técnica se utilizó por primera vez en células animales
durante los
años 40, cuando se hizo posible la generación y manipulación de microagujas, y
su
uso se extendió posteriormente a las células vegetales. La técnica requiere de
un
micromanipulador y se realiza bajo microscopio. Durante la transferencia de ADN,
cada célula es inmovilizada con una pipeta succionadora. Las células
microinyectadas
se dejan recuperar en una gota de medio suspendida en una cámara húmeda y,
posteriormente, son cultivadas in vitro para regenerar plantas. La
microinyección fue
ideada principalmente para la transformación de grandes células animales, como
las
huevas de los peces. Sin embargo, se han desarrollado protocolos para
microinyectar
ADN en protoplastos, cultivos embriogénicos, células en suspensión y estructuras
multicelulares vegetales. La microinyección de protoplastos requiere inmovilizar
a los
mismos en gotas de alginato, polilisina o agarosa. La microinyección presenta
varias
ventajas: a) requiere pequeñas cantidades de ADN; b) puede aplicarse
virtualmente a
cualquier tipo de célula; c) permite la inyección conjunta de ADN con otras
moléculas
biológicamente activas; d) permite regular el número de moléculas a transferir;
e)
puede monitorearse a las células blanco durante y después de la transferencia de
ADN; f) permite la introducción no sólo de ADN sino también de cromosomas dentro
de las células. Por todas estas características, constituye un método muy
aplicable al
estudio de funciones celulares y de la fisiología de plástidos. Sin embargo, su
aplicación a la transformación de plantas ha sido muy limitada hasta el presente
debido a las dificultades para penetrar la pared celular mediante micropipetas e
inyectar el núcleo celular (generalmente la vacuola celular ocupa un volumen
preponderante). La presión de turgencia de las células vegetales suele
dificultar
también el procedimiento de inyección. Utilizando este método, se han obtenido
plantas transgénicas de Nicotiana tabacum, Petunia sp., Brassica napus y Hordeum
vulgare.
La microinyección de fluorocromos, anticuerpos, proteínas y material genético es
ampliamente utilizada por los biólogos a pesar de sus desventajas relacionadas
con la
inserción de microcapilares. En células pequeñas, el sellado de la membrana
plasmática alrededor de la herida provocada por la punta de la pipeta (alrededor
de 0,7
m de diámetro) es a menudo incompleto. Además, en la mayoría de las células
vegetales y en algunos casos de animales la alta presión celular exacerba los
problemas de sellado, después de la penetración de la pipeta la presión celular
se
distiende porque los líquidos celulares son forzados a entrar al capilar.
Desafortunadamente en células vegetales muy turgentes como elementos de plantas
superiores, la pérdida de presión celular es acompañada por un drástico cambio
en la
ultraestructura celular. Sin embargo, la pérdida de ultraestructura no ocurre
cuando las
células son tratadas con capilares de 0,1 m. En comparación con los capilares
convencionales, esta minúscula punta de pipeta reduce el daño celular y la
pérdida de
turgencia. Aparentemente, las fuerzas físicas en esta punta extremadamente fina
amortiguan la turgencia celular previniendo cambios bruscos de solutos. Sin
embargo,
la inyección de material a través de capilares de alrededor de 0,1 m de
diámetro
requiere de alta presión para superar la resistencia al penetrar la célula. En
tal sentido,
las formas convencionales de ejercer presión resultan insuficientes debido a que
no
producen la presión adecuada o no permiten un control preciso sobre la extrusión
de la
muestra.
En la transparencia 98 se muestra el diagrama de una femtojeringa (figura C) que
permite introducir muestras del orden de femtolitros en células y organelas con
un
mínimo daño. El método de microinyección que utiliza esta microjeringa se basa
en la
expansión inducida por calor de un metal líquido (galistán: galio, indio y
estaño) dentro
de la pipeta para forzar la muestra desde la punta microcapilar y es adecuado
para la
transferencia de fluorocromos y construcciones de ADN en cianobacterias y
organelas
subcelulares. En la figura D se observa el sostén y calentador con la bomba y la
resistencia que genera la energía necesaria para expandir el metal. También se
observan dos fotos (figura A y B) donde se compara una punta de pipeta
convencional
con la punta de la femtojeringa. Finalmente, y a modo de ejemplo de su uso y
resultados, se presentan fotos con imágenes de microscopía confocal de Lucifer
yellow inyectada en una cianobacteria, en cloroplastos de Vicia faba y en el
núcleo de
células de Xenopus distal.
¿Biobalística versus Agrobacterium tumefaciens?
Transparencia 100
La transformación genética de plantas se remonta a principios de los años 80,
década
en que se demostró la capacidad del Agrobacterium para transferir ADN a células
vegetales. Durante las décadas siguientes, se realizaron avances significativos
en
mejorar los sistemas basados en Agrobacterium, así como en desarrollar nuevos
métodos que permitieron la transferencia directa de ADN. Entre estos últimos, se
incluyen métodos como el bombardeo de micropartículas (biobalística), la
permeabilización de membranas celulares por corrientes eléctricas
(electroporación)
y/o por tratamientos químicos con policationes (PEG, PVP) o fusógenos lipídicos,
la
abrasión con fibras de carburo de silicio y la microinyección. Si bien varios de
los
sistemas de transferencia directa han resultado en aplicaciones exitosas, el
bombardeo de micropartículas es actualmente el más ampliamente utilizado. Por
otra
parte, aunque existen muchos reportes sobre el uso de virus como vectores,
Agrobacterium resulta el vector biológico más usado para la transformación
vegetal. La
biobalística fue desarrollada como una alternativa para resolver la ausencia de
interacción entre muchas especies vegetales y las distintas cepas de
Agrobacterium.
Sin embargo, desde la década del 90, el uso de cepas supervirulentas de la
bacteria
ha permitido la obtención de plantas transgénicas en especies que hasta ese
momento
no eran susceptibles a Agrobacterium y que, por el contrario, habían podido ser
transformadas por biobalística. Por su parte, el uso de los cañones génicos está
limitado por la capacidad regenerativa de las células bombardeadas y por la
integración estable del ADN. Además, la biobalística ha evidenciado una alta
frecuencia de integración de secuencias re-arregladas y/o truncadas, como
también la
inserción de múltiples copias del transgén, lo que redunda en una alta
probabilidad de
ocurrencia de silenciamiento génico. Por el contrario, el Agrobacterium produce
generalmente integraciones que involucran a una o a pocas copias del transgén.
Este
aspecto ha determinado que, siempre que sea posible, la mayoría de los
investigadores prefieran la técnica basada en Agrobacterium. Sin embargo, deben
considerarse también las crecientes evidencias que muestran que la inserción del
ADN
por la bacteria no es tan definida como se creía anteriormente. En este sentido,
se ha
hallado que secuencias de ADN ubicadas fuera de los bordes de la región T de
Agrobacterium pueden integrarse también en el genoma de la planta receptora.
Además, la persistencia de Agrobacterium en los tejidos de las plantas
regeneradas es
otro problema que aún resta resolver y que tiene implicancias sobre aspectos de
bioseguridad. Por estas razones, aunque existe una tendencia a elegir el método
de
Agrobacterium para transformar plantas, tanto éste como la biobalística seguirán
constituyendo sistemas complementarios durante muchos años.
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ADN (Ácido Desoxirribonucleico) • Algas rojas • Membrana plasmática • Plantas
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