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CONCEPTOS Y TECNICAS DE BIOTECNOLOGÍA I
CONCEPTOS 2010-Nancy I. López
Biotecnología
Definición: Uso de organismos vivientes (o materiales de organismos vivientes)
para realizar un proceso definido con aplicación industrial
Objetivos tecnológicos industriales o ambientales
Microbiología aplicada: microorganismos tienen un muy diverso potencial
biosintético y degradativo
Nueva Biotecnología: uso de tecnología de DNA para construir nuevas
cepas.
Microbiología aplicada sin la básica es limitada
El mayor impulso de la microbiología básica es la solución de problemas
aplicados
CONCEPTOS 2010-Nancy I. López
CONCEPTOS 2010-Nancy I. López
Colores de la Biotecnología
Roja: Aplicada a medicina e industria farmacéutica
Verde: Aplicada a agricultura
Azul: Biotecnología marina
Blanca: Aplicada a procesos industriales y al ambiente
CONCEPTOS 2010-Nancy I. López
Historia
•
Hombre hizo uso de los microorganismos sin
saber que existían. Prueba-error. Se remonta a
épocas prehistóricas.
•
Cerveza, vinagre, vino y pan. Ceveza desde 6000 a.C.
Producción de cerveza en antiguo Egipto data del 1700 a.C.
Vinagre anterior. Vino 2000 a.C. en China y Egipto.
Pan 4000 a.C.
•
Agente causal de la fermentación: sentó bases de la microbiología aplicada.
1857-1876 Pasteur. Fermentación proceso biológico
•
Fines de siglo XIX procesos abiertos
•
Buchner enzimas (1907 premio Nobel). Fermentación podía tener lugar in vitro sin
la presencia de organismos. (Enzima del gr. En zyme significa en levadura)
•
Penicilina 1945. Desafío de producción a gran escala
•
1979 Ingeniería genética. Microorganismos recombinantes
CONCEPTOS 2010-Nancy I. López
1ra Guerra Mundial desarrollo de producción de acetona
Segunda mitad del siglo XX
Grandes cambios relacionados principalmente con el
descubrimiento de los antibióticos.
Productos microbianos impacto en la economía de los países (PBI)
FERMENTACIONES: TERMINOLOGÍA
L. Pasteur la denominó "la vie sans l'air" o "la vida sin aire".
Fermentación en biotecnología
CONCEPTOS 2010-Nancy I. López
Microbiología industrial
Fermentaciones a gran escala: hasta 500.000 litros
CONCEPTOS 2010-Nancy I. López
FERMENTACIÓN
Productos de la microbiología
Industrial
Bioconversión
Sustrato
Células
Producto
(bioconversión
de esteroides)
Levadura
Cianobacteria Spirulina platensis
Bacterias oxidadoras de metano
Rhizobium y Bradyrhizobium
Bacterias lácticas
Enzimas
(Glucosa
Isomerasa)
Antibióticos
(Penicilina)
Productos de las Células
Aditivos
Alimenticios
(aminoácidos)
Alcohol
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Productos
Químicos
(ácido cítrico)
Tomado de Bioquímica y Microbiología Industrial 2º de Bioquímica Universidad de Zaragoza
Otros productos Bacterianos
Vitaminas
Esteroles
Aminoácidos
Ácidos orgánicos
Agentes saborizantes o aromatizantes
Enzimas
Productos fermentados/bebidas
Antibióticos
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DNA recombinante
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Aislamiento de microorganismos
Procedimientos de screening
Mejoramiento de cepas
Producción a pequeña escala
Producción a gran escala. Fermentadores
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Metabolismo
Fermentación
CONCEPTOS 2010-Nancy I. López
Generación de energía
Eucariotas: Respiración aeróbica, fermentaciones alcohólicas y lácticas y
fotosíntesis oxigénica
Procariotas
• Fermentación: Embden-Meyerhof, Entner-Doudoroff y heteroláctica
• Respiración aeróbica y anaeróbica: NO3-; SO4- ; Fumarato
• Litotrofía : Compuestos inorgánicos como fuente de energía ej: H2; SH2
• Fotoheterotrofía: compuestos orgánicos como fuentes de C en la
fotosíntesis.
• Fotosíntesis oxigénica y anoxigénica
• Metanogénesis metabolismo de arqueones, H2 a CH4
• Fotofosforilación no fotosintética . Formación de ATP por incidencia de
la luz en un pigmento (bacteriorodopsina) de membrana.
• Fijación de CO2 por reversión del ciclo TCA y por el camino de
acetilCoA
CONCEPTOS 2010-Nancy I. López
Rutas para obtener energía
Glucólisis
Fermentación
Comp.org.
Comp.org.
FERMENTACIÓN
Compuesto orgánico
O2
N03SO42-
Ciclo de Krebs
(TCA o del
ácido cítrico)
ATP
CO2
ATP
Cadena respiratoria
Respiración aerobia,
aerobia facultativa y
anaerobia
Ext.
RESPIRACIÓN
Int.
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Embden Meyerhof
Fosforilación a nivel de sustrato
CONCEPTOS 2010-Nancy I. López
Embden-Meyerhof=Glucólisis
CONCEPTOS 2010-Nancy I. López
Embden Meyerhoff en diferentes especies
. Fermentación
Homolactica.. Ácido
Lactico.Lactobacillus,
Lactococcus y la
mayoría de los
estreptococos.
Productos derivados
de leche.
. Acido propiónico: poco común. Formación
de propionato es compleja e indirecta e
involucra 5 o 6 reactions. El ácido propionico
se usa para la manufactura de queso suizo, que
se distingue por su sabor a propionato y acetato
y los agujeros provocados por el CO2.
Fermentación con
producción de ácido butírico:
es realizada por clostridia. Por
fermentación de azúcares se
produce ácido butírico y
además acético, CO2 e H2 .
Pequeñas cantidades de
isopropanol y etanol.
. Butanol-acetone fermentación.
Descubiertos como productos principales
de la fermentación por Clostridium
acetobutylicum durante la I Guerra
CONCEPTOS 2010-Nancy I. Lópezmundial.
Enterobacterias
Productos
fuertemente ácidos
↓ pH < 5
Productos neutros o
levemente ácidos
pH > 6
CONCEPTOS 2010-Nancy I. López
Fermentación
Heteroláctica
Fosfocetolasa
E.M.
Lactobacillus
Leuconostoc
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Entner-Doudoroff
Zymomonas
(fermentativo)
Pseudomonas
KDPG aldolasa
.
CONCEPTOS 2010-Nancy I. López
Table 1. Oxidative pathways of glycolysis employed by various bacteria.
Bacteria
EmbdenMeyerhof
Heteroláctica Vía de
la fosfocetolasa
Entner
Doudoroff
Acetobacter
aceti
-
+
-
Agrobacterium
tumefaciens
-
-
+
Azotobacter
vinelandii
-
-
+
Bacillus subtilis
major
minor
-
Escherichia coli
+
-
-
Lactobacillus
acidophilus
+
-
-
Leuconostoc
mesenteroides
-
+
-
Pseudomonas
aeruginosa
-
-
+
Vibrio cholerae
minor
-
major
Zymomonas
mobilis
-
-
+
CONCEPTOS 2010-Nancy I. López
http://textbookofbacteriology.net
Productos de fermentación
Pathway
Key enzyme
Ethanol
Lactic Acid
CO2
ATP
Embden-Meyerhof
Saccharomyces
fructose 1,6-diP aldolase
2
0
2
2
Embden-Meyerhof
Lactobacillus
fructose 1,6-diP aldolase
0
2
0
2
Heterolactic
Streptococcus
phosphoketolase
1
1
1
1
Entner-Doudoroff
Zymomonas
KDPG aldolase
2
0
2
1
CONCEPTOS 2010-Nancy I. López
Glucólisis y Ciclo de Krebs
CONCEPTOS 2010-Nancy I. López
BIOTECNOLOGIA MICROBIANA
Tres categorías de productos microbianos de
importancia industrial
• Metabolitos primarios
• Metabolitos secundarios
• Enzimas
CONCEPTOS 2010-Nancy I. López
Crecimiento bacteriano
CONCEPTOS 2010-Nancy I. López
Metabolitos primarios
Producidos durante el crecimiento normal del microorganismo, parte
del metabolismo. Pueden ser intermediarios o productos finales de
vías metabólicas esenciales para el crecimiento.
Ej: aa, nucleótidos, azúcares,
productos de fermentación, exoenzimas.
Normalmente se producen en gran
abundancia en la fase logarítmica.
Acetobacter o
Gluconobacter
Ethyl alcohol
Acetic acid
CONCEPTOS 2010-Nancy I. López
Metabolitos secundarios
Son producidos luego del
crecimiento normal del
microorganismo, se acumulan
cuando las condiciones son
desfavorables para el crecimiento.
Compuestos no esenciales para el
crecimiento y su rol en muchos
casos es desconocido. En general,
compuestos de bajo peso
molecular y se acumulan durante
la fase estacionaria.
Ej: antibióticos
CONCEPTOS 2010-Nancy I. López
Metabolitos Primarios y
Secundarios
Sustrato de
crecimiento
Células
Metabolito
Primario
Las células y el metabolito se producen
más o menos simultáneamente
Sustrato de
crecimiento
Células
Metabolito
Primario
Metabolito
Secundario
Después de producidas las células y el
metabolito primario, las células
convierten el metabolito primario en uno
secundario
CONCEPTOS 2010-Nancy I. López
Sustrato de
crecimiento
Células
Metabolito
Primario
Metabolito
Secundario
Después de producidas las células el
sustrato se convierte en un metabolito
secundario durante un posterior
crecimiento
Características del metabolismo
primario y secundario
• Metabolismo 1° similar en distintos
microorganismos.
• Metabolitos 2° moléculas orgánicas complejas que
requieren muchos pasos (reacciones enzimáticas)
para su síntesis.
• Moléculas precursoras de metabolitos 2° vienen de
las vías biosintéticas primarias.
• Enzimas de vías del metabolismo 2° reguladas
separadamente de las del metabolismo 1°.
CONCEPTOS 2010-Nancy I. López
Características de los metabolitos
secundarios
• No son esenciales para el crecimiento o la reproducción
• Formación depende de las condiciones y del medio de
cultivo. Represión frecuente.
• Específicos de un grupo de organismos
• Frecuentemente se producen como un grupo de estructuras
relacionadas
• Es posible incrementar su producción enormemente
(sobreproducción) a diferencia de los primarios
• Producidos durante fase estacionaria
• Son los más importantes desde el punto de vista industrial
CONCEPTOS 2010-Nancy I. López
Metabolito 1°
Metabolito 2°
CONCEPTOS 2010-Nancy I. López
BIOTECNOLOGIA MICROBIANA
Tres categorías de productos microbianos de
importancia industrial
• Metabolitos primarios
• Metabolitos secundarios
• Enzimas
Enzimas y extremófilos
CONCEPTOS 2010-Nancy I. López
Enzimas
. Biocatalizadores. Convierten
sustratos en productos sin sufrir
cambio alguno.
. Casi todas las reacciones en
mundo viviente son catalizadas y
controladas por enzimas.
. Especificidad. Cada reacción qca.
catalizada por su propia enzima
. Aumentan velocidad de reacción.
Actúan a T moderada, pH y p
. Capaces de discriminar entre
sustratos similares
. NO SUFREN CAMBIO Y NO
SE CONSUMEN EN EL
PROCESO
. BIODEGRADABLES Y NO
TÓXICAS
. Catalizan reacciones
estereoespecíficas.
. Pueden funcionar in vitro
CONCEPTOS 2010-Nancy I. López
EFECTO DEL AMBIENTE SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
. Concentración de sustrato
. pH
.T
óptimo
pH
Temperatura
CONCEPTOS 2010-Nancy I. López
Distribución de enzimas por áreas
AREAS
ESPECÍFICAS
Alimentos
PORCENTAJE Aplicaciones
41
Clarificación de vino y jugos,
cervezas, pan y galletas,
edulcorantes,lacteos, suplemento de
alimentos de animales
Detergentes
Textiles
34
11
Limpieza de ropa, lentes de contacto
Cueros
Pasta/papel
Otras aplicaciones
3
1
6
Ablandamiento
Desengomado de telas, teminación
jeans
Blanqueamiento de pulpa de celulosa
Reactivos para análisis,
manipulación genética,
bioconversiones, trastornos
digestivos, inflamaciones,disolventes
de coágulos
CONCEPTOS 2010-Nancy I. López
Animales, plantas y
microorganismos como fuentes de
enzimas
Animales
Descubrimiento de enzimas digestivas
siglo XIX.
Desarrollo de métodos para obtención de
enzimas de matanza de animales.
Pepsina del estómago de cerdos y
del cuajo del estómago de ganado
bovino
Cócteles de enzimas con tripsina,
quimiotripsina, lipasas y amilasas del
páncreas de cerdo.
CONCEPTOS 2010-Nancy I. López
Animales, plantas y
microorganismos como fuentes de
enzimas
Vegetales
Fuentes potenciales de enzimas a escala industrial.
Granos, remojar y germinar, malta que contiene
amilasas y proteasas usadas en la producción de
cerveza y la destilación de bebidas alcohólicas.
Siglo XIX, métodos simples para obtención de
grandes cantidades de proteasas de la savia de
plantas tropicales.
CONCEPTOS 2010-Nancy I. López
Vegetales
Papaina y quimiopapaina del árbol de la
papaya. Similar a la pepsina
Ablandadores de carne, digestión y
limpieza de lentes de contacto.
Ficina de higueras. Enzima proteolítica
Bromelaina del tallo de la planta de la
piña. Enzima proteolítica
CONCEPTOS 2010-Nancy I. López
Animales, plantas y microorganismos
como fuentes de enzimas
Suministro y concentración de las enzimas
varía con las estaciones del año.
Requerimiento de grandes cantidades de
plantas como material. Procesamiento de
grandes cantidades es un trabajo muy
duro.
Desventajas similares para la obtención a
partir de animales
CONCEPTOS 2010-Nancy I. López
Animales, plantas y microorganismos como
fuentes de enzimas
X
X
Microorganismos
Fácil manejo
Alto rendimiento
Estabilidad
CONCEPTOS 2010-Nancy I. López
LA MAYORIA DE LAS ENZIMAS DE IMPORTANCIA INDUSTRIAL
PODRIAN PRODUCIRSE A PARTIR DE MICROORGANISMOS
Microorganismos como fuentes de enzimas
Producción de grandes cantidades con bajo
costo
No afectada por las estaciones del año.
Proceso de extracción más simple y menos
contaminante.
Uso de mutantes y procesos de selección que
aumentan la producción. “Enzimas hechas a medida”
a través de ingeniería genética y diseño de
proteínas
1950 gran desarrollo de procesos sumergidos
CONCEPTOS 2010-Nancy I. López
Microorganismos como fuentes de
enzimas
Enzimas hidrolíticas simples como:
proteasas, amilasas, pectinasas
Degradan polímeros naturales
Enzimas extracelulares
Poco específicas
Fácil extracción. Bajo costo
CONCEPTOS 2010-Nancy I. López
Selección de organismos productores de enzimas
Empírica
Muestras de las más diversas fuentes
Cultivos de enriquecimiento-aislamiento de microorganismo
Por propiedad intelectual no siempre están caracterizados
taxonómicamente. Patentes para proteger los microorganismos.
Ubicación taxonómica dada a conocer.
Secuencia del 16S rRNA de productores de enzimas.
Secuencia de enzimas (DNA y aa) es lo que se patenta.
Producción de Enzimas: Productores naturales
Otro hospedador: enzimas recombinantes
CONCEPTOS 2010-Nancy I. López
Gram positivos
Bacillus alta capacidad secretora
Exoenzimas
Streptomyces
glucosa isomerasa citoplasmática
Gram negativos
Pseudomonas lipasas
CONCEPTOS 2010-Nancy I. López
Enzimas
Clásicamente utilizadas son las hidrolíticas:
• Proteasas
• Amilasas
• Lipasas
• Poco requerimiento de cofactores las hace adecuadas
para múltiples aplicaciones
• Exoenzimas: Son separadas directamente del caldo de
cultivo (durante fermentación) y formuladas en alta
concentración
• Solubles en agua
CONCEPTOS 2010-Nancy I. López
Enzimas intracelulares
Glucosa oxidasa conservación de carne
Asparraginasa terapia del cáncer
Penicilina acilasa
conversión de antibióticos
Glucosa isomerasa jarabe de fructosa
CONCEPTOS 2010-Nancy I. López
Proteasas-Aplicaciones de las Enzimas
Bacterianas
Enzima
Fuente
Aplicación industrial
Industria
Proteasa
Bacterias
Eliminación de manchas
Limpieza en seco
Bacterias
Ablandador de la carne
Alimenticia
Bacterias
Limpieza de las heridas
Medicina
Bacterias
Eliminación de revestimientos
Textil
Hongos
Pan
Panadera
Bacterias
Detergente doméstico
Lavandería
CONCEPTOS 2010-Nancy I. López
Proteasas-Aplicaciones de las Enzimas Bacterianas
Hidrolizan uniones peptídicas
Subtilisinas. Serina proteasas Bacillus subtilis 1959
Bacillus licheniformis
1969 reacciones alérgicas por jabones en polvo.
Solucionadas posteriormente por encapsulamiento de
enzimas
Búsqueda de enzimas que trabajen a pH alcalinos
Bacillus amyloliquefaciens
CONCEPTOS 2010-Nancy I. López
Proteasas
Suavizan el cuero
Son altamente efectivas en la producción
de cuero. Después de remover el pelo y
antes de curtir, debe ser suavizado por
un proceso que involucra bacterias que
producen proteasas (“bateado”).
Hornear pan
El gluten se degrada por proteasas obtenidas
de hongos para hacer la masa más fácil de
manejar y aumenta su capacidad para retener
burbujas de aire. Se une parcialmente al agua y
tiene consistencia de gel. Las proteasas
degradan las proteínas pegajosas (gluten) en la
masa.
CONCEPTOS 2010-Nancy I. López
Amilasas
Degradación del polisacárido almidón.
Almidón (amilosa y amilopectina)
Compuesto de almacenamiento de
energía en plantas (maíz, arroz, papa,
trigo).
Fuente de nutrición muy importante
en animales y humanos (70-80%).
Últimos 20 años las amilasas han
reemplazado la hidrólisis ácida.
Amilosa (α 1,4)
a-amilasa de Bacillus: endoamilasas
Bacillus amyloliquefasciens
Amilopectina
CONCEPTOS 2010-Nancy I. López
(Ramificado α 1,6 cada 24-30
glucosa)
Amilasa- Aplicaciones de las Enzimas Bacterianas
Enzima
Fuente
Aplicación industrial
Industria
Amilasa
Hongos
Pan
Panadera
Bacterias
Revestimientos amiláceos
Papelera
Hongos y
Bacterias
Fabricación de jarabe y
glucosa
Alimentaria
Bacterias
Almidonado en frío de la ropa
Almidón
Hongos
Ayuda digestiva
Farmacéutica
Bacterias
Eliminación de revestimientos
Textil
Bacterias
Eliminación de manchas;
detergentes
Lavandería
Proceso: Calentamiento previo de gránulos de almidón
Enzimas que toleran ese paso
Bacillus licheniformis
B. stearothermophilus
Buscar combinación de mejores propiedades de cada enzima
CONCEPTOS 2010-Nancy I. López
Amilasas
Hornear pan
Aceleran la degradación del almidón, y así
aumenta el contenido de azúcar en la masa,
acelerando el proceso de fermentación.
El volumen del pan preparado con enzimas
aumenta.
Producción de Cerveza
Se añaden enzimas, amilasas, glucanasas y
proteasas, de hongos y bacterias. Transforman el
almidón a azúcares que sufren fermentación
alcohólica por levaduras.
Principalmente de hongos pero pueden participar bacterias
CONCEPTOS 2010-Nancy I. López
Amilasas
Desengomado
Desengomado.
Las amilasas eliminan la goma protectora basada en
almidón, para hacer la tela elástica.
Antes se hacía con amilasas obtenidas de malta o
de páncreas de animales, pero hoy en día se
obtienen de bacterias.
Enzimas resistentes a altas temperaturas
para acelerar el proceso.
CONCEPTOS 2010-Nancy I. López
Lipasas-Aplicaciones de las Enzimas Bacterianas
Criterios de selección:
• Amplio rango sobre una variedad de grasas y lípidos
• Estabilidad a pH alcalino
• Solubilidad en detergente
• Compatibilidad con las proteasas presentes (no fácilmente degradable)
• Facilidad de producción
Pseudomonas spp.
Pseudomonas alcaligenes 1995
Maquinaria de secreción
CONCEPTOS 2010-Nancy I. López
Celulasas-Aplicaciones de las Enzimas Bacterianas
Capaces de hidrolizar la unión 1,4 ß-D-glucosídica en celulosa
Endoglucanasas
Exoglucanasas
ß-Glucosidasas
Bacillus subtilis
Thermomonospora fusca
Hemicelulosa
Celulosa
Lignina
CONCEPTOS 2010-Nancy I. López
Lignocelulosa sustrato de
interés en biotecnología
Detergentes biológicos
La aplicación más importante de las enzimas
hidrolíticas
Manchas:
- Proteínas difíciles de remover, no se disuelven
fácilmente en agua. A altas temperaturas, se une
fuertemente a las fibras textiles.
-Polvo, hollín, pigmentos y materia orgánica. Las
grasas y las proteínas actúan como pegamento.
Detergentes sueltan la grasa de la tela, las proteínas
permanecen en el material.
Actividad óptima 50-60º C. No necesita hervir.
Proteasas, lipasas, celulasas y amilasas en la
eliminación enzimática de manchas.
CONCEPTOS 2010-Nancy I. López
Detergentes biológicos
Enzimas pancreáticas poco estables y
muy caras.
Producción a gran escala de detergentes
biológicos 1960.
Descubrimiento de la subtilisina de
Bacillus licheniformis.
Activa bajo condiciones alcalinas. Proteasas
actividad óptima durante el proceso de lavado.
Poca especificidad. Omnívoros. Degradan
proteínas en aminoácidos y péptidos de cadena
corta. Las proteínas son desprendidas de las fibras
textiles y eliminadas.
CONCEPTOS 2010-Nancy I. López
Detergentes biológicos
CONCEPTOS 2010-Nancy I. López
Enzimas Microbianas y sus aplicaciones
Enzima
Fuente
Aplicación industrial
Industria
Invertasa
Hongos
Relleno de caramelos
Confitería
Glucosa Oxidasa
Hongos
Eliminación de glucosa y
oxígeno, papeles para pruebas
de la diabetes
Alimentaria
Farmacéutica
Glucosa Isomerasa
Bacterias
Jarabe de cereales rico en
glucosa
Bebidas
refrescantes
Pectinasa
Hongos
Prensado, clarificación del vino
Zumos de frutas
Renina
Hongos
Coagulación de la leche
Quesera
Lactasa
Hongos
Degradar la lactosa a glucosa y
galactosa
Lechería, alimentos
DNA polimerasa
Bacterias;
Archaea
Replicación del DNA por PCR
Investigación
biológica y forense.
CONCEPTOS 2010-Nancy I. López
Pectinasas
Producción de zumo de frutas
Al prensar fruta y vegetales para la
obtención de jugo, las pectinas de alto peso
molecular reducen la producción.
Pectinasas procedentes de cultivos
sumergidos de Aspergillus y Rhizopus.
Se pica la fruta y se añaden pectinasas
para degradar las pectinas de cadena
larga. Se reduce la viscosidad del zumo,
facilitando la filtración y se obtiene
más cantidad. Alimentación de bebés
maceran las fruta y los vegetales para
hacerlos más suaves y fáciles de comer.
CONCEPTOS 2010-Nancy I. López
Isomerasas-Aplicaciones de las Enzimas Bacterianas
Mayor parte de glucosa obtenida de amilasas convertido en
Jarabe de fructosa
Glucosa isomerasa
Streptomyces rubiginosis
Actinoplanes missourensis
Ampullariella spp.
Enzima no se secreta. Intracelular. Mayor costo de producción
Actinoplanes missourensis
Mutanes con mayor actividad
CONCEPTOS 2010-Nancy I. López
Transformaciones enzimáticas del almidón
Amilasas y glucoamilasas en industria
alimentaria.
Jarabe de cereales rico en fructosa
Reacción de clarificación: α-amilasa
(almidón acortado) Bacillus
Sacarificación: glucoamilasa (genera
glucosa) Saccharomyces cerevisiae
Isomerización: glucosa isomerasa (glucosa
en fructosa)
CONCEPTOS 2010-Nancy I. López
Enzimas utilizadas en el procesamiento de alimentos
Industria
Enzimas
Cervecera
α-amilasa,ß-amilasa, proteasa,
papaina, amiloglucosidasa, xilanasa
Lechera
Quimosinas animales/microbianas,
lactasa, lipasa, lisozima
Panadera
α-amilasa, proteasa, xilanasa,
fosfolipasa A y D, lipoxigenasa
Procesamiento de frutas y verduras
Pectinesterasa, poligalacturanasa,
pectin-liasa, hemicelulasas
Almidón y azúcar
α-amilasa,ß-amilasa, glucoamilasa,
xilanasa, pululanasa, isomerasa,
oligoamilasas
CONCEPTOS 2010-Nancy I. López
Productos Químicos
Penicilin amidasa/Penicilin acilasa: usada para producir
intermediarios para la obtención de penicilinas semisintéticas.
E. coli
Kluyvera citrophila
Alcaligenes faecalis
Pseudomonas
CONCEPTOS 2010-Nancy I. López
MERCADO
Cantidad de enzimas requerida: bastante pequeña
Procesos automáticos
Enzimas inmovilizadas
Miniaturización del sistema: microchip
Aunque enzima sea esencial cantidad necesaria en mercado
pequeña
Ej: Aditivos en masa 1-2Kg/1000 Kg de sustrato.
Formulaciones líquidas. No purificadas
Diagnóstico µg-mg. Alto grado de pureza.
Dominado por Holanda y Dinamarca.
CONCEPTOS 2010-Nancy I. López
PRODUCCIÓN DE ENZIMAS
Alto rendimiento
Estabilidad
Independencia de inductores o cofactores
Buena recuperación
Suprimir características
no deseadas
Olor
Color
Metabolitos no deseados
CONCEPTOS 2010-Nancy I. López
Biorreactores para producción
de enzimas
10-50 m3
30-150 h
Pasos de extracción y purificación
.Importantes en el costo del proceso
.Enzimas microbianas utilizadas en
medicina y alimentación especificaciones
estrictas en cuanto a toxicidad
Bajo potencial alergénico
Libre de microorganismos
. Certificado de material seguro
. Responsabilidad sobre el fabricante
CONCEPTOS 2010-Nancy I. López
Enzimas
Solución
Inmovilizadas
Enzimas en solución
Se emplean grandes volúmenes (ton), deben ser de bajo costo
Su purificación debe ser sencilla o no interferir con el producto
Ventajas:
-pueden seleccionarse de alta o baja especificidad
-generan pocos o ningún producto secundario
-actividad óptima en condiciones de reacción
Desventajas:
-costo generalmente alto
-sustratos poco solubles son difíciles de procesar
-baja estabilidad
-problemas de inhibición
CONCEPTOS 2010-Nancy I. López
Enzimas inmovilizadas
Ventajas:
- se puede reutilizar la enzima
- no requiere proceso de recuperación y separación de la enzima
del producto.
- puede proveer un ambiente más adecuado para la actividad
catalítica de la enzima.
- Gralmente. mayor pureza del producto
-Menores problemas de disposición de efluentes
Desventajas:
- puede haber drenado de la enzima a la solución
- limitaciones significativas por restricciones a la transferencia
de masa
- la actividad y la estabilidad de la enzima se puede reducir
- no se pueden controlar las condiciones en el microambiente que
rodea a la enzima
CONCEPTOS 2010-Nancy I. López
Enzimas inmovilizadas
Facilita reacción enzimática en producción a gran escala
Estabiliza las enzimas evitando desnaturalización
Celulosas modificadas
Pueden recuperarse y reutilizarse
Carbón activado
1.Unión: a soporte
Arcillas minerales
Óxidos de aluminio
Bolitas de vidrio
Adsorción-enlace iónico-enlace covalente.
2. Polimerización. Con agente polimerizante.
Ej. Glutaraldehido. Mantener actividad de la
enzima.
3. Inclusión enzimática: en membrana
semipermeable. Microcápsulas, geles,
polímeros fibrosos como acetato de celulosa.
CONCEPTOS 2010-Nancy I. López
Enzimas inmovilizadas
CONCEPTOS 2010-Nancy I. López
L- aminoácidos
Acidos orgánicos
Jarabe de fructosa
CONCEPTOS 2010-Nancy I. López
Extremófilos y biotecnología
¿Porqué estudiar extremófilos?
• Fisiología adaptada al medio en el que viven. En
biotecnología: rastreo de moléculas con propiedades
inusuales.
CONCEPTOS 2010-Nancy I. López
Extremófilos
A)Temperatura
- Psicrófilos
- Mesófilos
- Termófilo
- Hipertermófilos
B) Acidez y alcalinidad
– Acidófilos
– Alcalófilos
C) Disponibilidad de agua
- Sal: Halófilos y Halófilos
extremos
- Azúcar: Osmófilos
- Secos: Xerófilos
CONCEPTOS 2010-Nancy I. López
CONCEPTOS 2010-Nancy I. López
Relación de la temperatura y
velocidad de crecimiento
CONCEPTOS 2010-Nancy I. López
Almidón
oligosacáridos
CONCEPTOS 2010-Nancy I. López
Microorganismos termófilos e
hipertermófilos
CONCEPTOS 2010-Nancy I. López
Microorganismos de hielo del
Antártida
Microfotografía de contraste d fases de
microorganismos fototróficos de la
muestra anterior.
(Diatomeas o algas verdes)
Núcleo de agua de mar
permanentemente congelada.
La coloración densa es debida a
microorganismos
Crecimiento de una cianobacteria termófila
en un arroyo caliente en el parque
nacional de Yellowstone
CONCEPTOS 2010-Nancy I. López
Alga de la nieve
Enzimas termófilas
Catalizan reacciones a temperaturas elevadas
Por ser más estables, vida media de preparaciones más prolongada
DNA polimerasa de Thermus aquaticus (Bacteria – Clase Deinococcus)
.Taq polimerasa PCR Amplificación de secuencias específicas de DNA
. Vent de Thermococcus litoralis (Archaea)
. Pfu DNA polimerasa enzima encontrada en Pyrococcus furiosus
(Archaea).
Stratagene 1991. Termoestabilidad superior comparada con otras
polimerasas
Alta fidelidad. Algo más lenta
Stratagene Pfu Ultra alta fidelidad. Menor tasa de error de cualquier
enzima de PCR (only 1 error per 2.5 million bases)
Usar combinadas
. KOD DNA polymerase from the thermophile Thermococcus
kodakaraensis (Archaea). Alta fidelidad: actividad exonucleasa 3´-5´.
Fragmentos de hasta 6 kb
CONCEPTOS 2010-Nancy I. López
CONCEPTOS 2010-Nancy I. López
Microorganismos
Acidófilos y
Alcalófilos
CONCEPTOS 2010-Nancy I. López
Microorganismos
y Actividad del Agua
• Halófilos: crecen en altas concentraciones
de sal
– Discretos: 1-6% NaCl
– Moderados: 6-15% NaCl
– Extremos: 15-30% NaCl
• Osmófilos: crecen en altas concentraciones
de azúcar
• Xerófilos: crecen en ambientes muy secos
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