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ENCUENTROS CON EL EXPERTO SIMULTÁNEOS
Uso de la biología molecular
en endocrinología pediátrica
L. Castaño
Grupo de Investigación en Endocrinología y Diabetes. Departamento de Pediatría. Universidad del País Vasco.
Hospital de Cruces. Barakaldo.
(An Esp Pediatr 2000; 52 (Supl 1): 23-25)
ENFERMEDAD GENÉTICA
Las enfermedades pueden ser de origen genético, ambiental o ambas. El interés de la tecnología molecular tiene una doble orientación diagnóstica y terapeútica (terapia
genética, aún por desarrollar).
En el planteamiento del estudio de una enfermedad genética debemos considerar:
– Conocer si es una enfermedad monogénica (p. ej., diabetes insípida central) o poligénica (p. ej., diabetes tipo 1).
– Saber si el presunto gen o genes son conocidos (p. ej.,
déficit de 5-reductasa) o desconocidos.
– En este último caso, en el mismo cromosoma pueden
conocerse otros genes próximos al ignorado y se utilizarían como marcadores próximos (diagnóstico aproximativo) (p. ej., HLA y diabetes) o el gen es totalmente desconocido y se ignora su situación en el genoma (en ese caso
no se puede hacer estudios) (p. ej., la diabetes neonatal o
la mayoría de los trastornos del crecimiento).
GEN A ESTUDIAR
Para hacer un análisis genético es importante, previamente a iniciar el estudio, definir el gen que se quiere estudiar. Esta labor la debe de realizar el médico clínico, que
después de un análisis cuidadoso de los síntomas, signos
y datos complementarios (imagen, analítica, etc.) debe de
concretar el nivel del trastorno bioquímico y orientar el posible gen alterado (así, p. ej., ante un seudohermafroditismo el médico clínico debe de decidir si se investigarán genes que controlan el desarrollo gonadal, un gen de las vías
metabólicas de los esteroides, etc.). Es un error pensar que
el genetista molecular decidirá el gen a estudiar y es importante recordar que los estudios genéticos de casos clínicos mal orientados hacen perder tiempo y dinero.
MATERIAL NECESARIO
Personas
En los estudios genéticos generalmente es importante estudiar a toda la familia (caso índice, padres, hermanos e
hijos). Es adecuado planificar la extracción de la muestra
al mayor número posible de familiares el mismo día, para
enviarlas juntas al centro de referencia.
En las enfermedades autosómicas recesivas es fundamental demostrar la alteración en los dos alelos en el caso
índice y un alelo alterado en cada uno de los padres. En
las enfermedades autosómicas dominantes es importante
estudiar, además del caso índice (que tendrá un alelo mutado), a sus padres, lo que nos informará de cuál de los
dos progenitores ha transmitido la enfermedad. En caso de
que los dos padres tengan sus dos alelos normales hay que
pensar que la mutación génica es de novo.
El estudio de hermanos o hijos nos indicará si alguno de
ellos ha heredado la mutación y puede desarrollar la enfermedad o si son portadores (un alelo alterado en caso de
herencia autosómica recesiva).
Material
Una vez definido el gen que se quiere estudiar, se debe
decidir si se investigarán alteraciones estructurales (simple
alteración del gen) o las alteraciones funcionales (ver la
consecuencia de la mutación del gen). Para el primero se
estudia el ADN genómico, aquel que tiene los intrones y
los exones (hasta el presente la mayor parte de las mutaciones se han demostrado en los exones o en la zona de
unión intrón/exón o zona de splicing) y se estudian sólo
los exones y zonas de splicing.
Para ver las alteraciones funcionales se pueden estudiar
las propias proteínas (no es de nuestro interés aquí) y el
Correspondencia: Dr. Luis Castaño. Unidad de Investigación. Hospital de cruces.
Teléfono: 94 600 6376. Fax: 94 6006076 E-mail: [email protected].
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ENCUENTROS CON EL EXPERTO SIMULTÁNEO. Castaño L.
ARN transcrito (o ARN mensajero – ARNm) a partir de los
exones del ADN genómico.
Para estudiar el ADN genómico generalmente se hace el
estudio en sangre periférica (se extrae el ADN de las células nucleadas de la sangre). Hay que recordar que todas las
células nucleadas del organismo (excepto los gametos) tienen el mismo ADN genómico.
Para hacer un estudio de ARNm hay que disponer del tejido donde se expresa o se produce la proteína. En este
caso se extrae el ARNm del tejido, éste se trasforma en
ADN complementario o ADNc por un método de retrotranscripción o transcripción inversa (en el laboratorio) y
se estudia por los métodos habituales. El estudio de ARN
tiene la desventaja de tener que disponer del tejido donde
se produce la proteína (p. ej., páncreas para estudiar ARN
de insulina), pero tiene la ventaja de que podemos estudiar al mismo tiempo función y estructura. La mayoría de
los casos en que se estudian genes estructurales por su facilidad se analiza sangre periférica.
Condiciones de extracción y envío de la muestra
Siempre se debe de solicitar las condiciones de extracción (cantidad, sistema de envío, etc.) al laboratorio de referencia. No obstante, unas condiciones generales pueden
resumirse así:
A. Sangre total (para extraer el ADN genómico):
1. Cantidad: varía en función del tipo de estudio desde
1-20 ml. En niños pequeños puede hacerse la mayoría de
los estudios con cantidades mínimas (microlitros).
2. Sangre total con anticoagulante (heparina o EDTA).
Es más fácil trabajar en el laboratorio con sangre extraída
con EDTA.
3. Después de ser extraída, la sangre se puede enviar a
temperatura ambiente en servicios de 24 horas al laboratorio de referencia (siempre que no haga mucho calor ambiental).
4. Si no se envía en el día, se puede congelar la sangre
total y después se enviaría congelada cuando se quiera. Algunos laboratorios prefieren que se separen los leucocitos
al sacar al paciente la sangre y congelarlos.
No es aconsejable que un tejido esté congelado a temperaturas superiores (p. ej., a − 20 °C) ya que el ARN se puede degradar.
– Cuando se quiere estudiar ARN de una muestra es muy
importante que la muestra nunca llegue a descongelarse
(ni durante su almacenamiento, ni durante el envío al centro de referencia).
PLANTEAMIENTO DEL ESTUDIO GENÉTICO
Una vez decidido el gen que se quiere estudiar, es ya
función del genetista molecular definir el tipo de método
de estudio. Se decidirá el método de análisis en función de
la estructura del gen. Así, es diferente que tenga 1 o 2 exones o que tenga 20-30 exones; también es importante el tamaño de los exones o la composición de nucleótidos
(p. ej., genes ricos en GC-guanina-citosina, son más difíciles de estudiar).
En términos generales existen varios métodos de estudio:
– Secuenciación: es el método directo y definitivo. Tiene el inconveniente que si hay muchos exones, o éstos son
muy grandes o hay muchas personas para estudiar, es muy
largo, laborioso y caro.
– Métodos indirectos o de cribado: existen diferentes métodos que simplemente nos localizan en qué exón está la
mutación y nos ayudan a seleccionar la zona alterada. Posteriormente se secuencia solamente ese exón supuestamente alterado. Estas técnicas se basan en que un fragmento de ADN tiene un patrón diferente de electroforesis
en función de su secuencia de nucleótidos (cuando hay
una mutación hay un cambio en esta secuencia). Según el
tipo de técnica diferenciamos entre:
• SSCP: Single Stranded Conformational Polymorphism
• DGGE: Denaturing Gradient Gel Electrophoresis
• RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism
• PCR-RFLP: Polymerase Chain Reaction-RFLP
• Otros: RNase cleavage, EMC (Enzymatic Mismatch Cleavage), OLA (Oligonucleotide Ligation Assay), etc.
TIPOS DE ALTERACIONES
Polimorfismos y mutaciones
B. Tejido (para extraer ARN):
– El tejido extraído se debe de trocear (pequeños fragmentos, p. ej., como un garbanzo) y se congela inmediatamente después de su extracción.
– Siempre se enviará la muestra congelada en servicio
de 24 horas (el mejor sistema para enviarlo congelado es
la nieve carbónica que mantiene el tejido a una temperatura de − 80 °C).
– Durante el tiempo que pasa el tejido almacenado (desde que se extrae hasta que se estudia) debe permanecer a
temperatura lo más baja posible. Lo mejor es a − 170 °C (en
nitrógeno líquido) o al menos en congeladores de − 80 °C.
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Existen algunas diferencias en determinados genes que
no implican patología o pérdida de función. Estas variaciones genéticas se denominan polimorfismos (p. ej., el sistema sanguíneo ABO, con tres variantes A, B y O y la región
HLA). Estos polimorfismos o cambios son consecuencia de
mutaciones (cambios en la estructura o secuencia de ADN
de los genes) que han ocurrido durante la evolución, y que
no han sido eliminadas por la selección natural porque no
constituyen ninguna desventaja para su portador. Si el cambio de nucleótidos produjera una patología o incapacidad
al individuo portador estamos ante el concepto genético de
mutación (a excepción de algunas mutaciones supuesta-
Uso de la biología molecular en endocrinología pediátrica
mente silenciosas). También podemos definir los cambios
(polimorfismo versus mutación) en la frecuencia en que se
encuentran en la población (polimorfismo sólo si su frecuencia es superior al 1 %).
Diferenciamos en mutación somática, cuando la mutación se produce en alguna de las células somáticas (todas
las células del organismo excepto los gametos), que sólo
afecta a las células derivadas de la célula mutada, afectará
sólo a dicho órgano o sistema y no se transmite a la descendencia o mutación en línea germinal (gametos) que estará presente en todas las células; se transmite y formará
parte del genoma de la descendencia.
Tipos de mutaciones y sus consecuencias
Desde el punto de vista físico, las alteraciones que puede sufrir un gen pueden ser: deleciones, inserciones, sustituciones, etc. Pueden afectar a grandes regiones cromosómicas y ser visibles por técnicas de citogenética (hablando
entonces de trisomías, traslocaciones, pérdida de fragmentos cromosómicos...), o bien pueden tratarse de alteraciones que afectan a unos cuantos nucleótidos, o ser simplemente una alteración de un solo nucleótido o base
(mutación puntual).
Existen diferentes tipos de mutaciones puntuales en función de la alteración que producen:
– Missense mutation o mutación de sentido erróneo: una
sustitución puntual de un nucleótido por otro en la región
codificante de un gen (incluida en los exones) puede suponer que el aminoácido codificado por el codón o triplete sea sustituido por otro. La consecuencia funcional variará en función del aminoácido sustituido.
– Nonsense mutation o mutaciones sin sentido: la sustitución de una base por otra puede dar lugar a la aparición
de un codón de terminación y consecuentemente a una
proteína truncada.
– Silent mutation o mutación silenciosa: el cambio de
nucleótido no supone cambio de aminoácido (recordemos
que distintos tripletes pueden codificar para el mismo aminoácido; p. ej., CAT y CAG codifican ambos el aminoácido
glutamina).
– Frameshift mutation o alteración de la pauta de lectura: cuando se producen inserciones o deleciones puntuales y se alteran los tripletes. Todos los aminoácidos a partir de la mutación son diferentes.
– Splicing mutation o mutación en la zona de unión intrón-exon: el ARNm incluye algún intrón que no se ha podido separar.
ALTERACIÓN FUNCIONAL
Es importante recordar que una vez detectada e identificada la alteración en la secuencia de nucleótidos, es necesario definir en qué medida dicho cambio puede influir en
la funcionalidad biológica del gen alterado. Las alteraciones que causan mutaciones nonsense o frameshift eliminan
completamente la actividad proteica, ya que truncan su síntesis prematuramente o producen un péptido diferente. No
obstante, los efectos de mutaciones que causan la sustitución de un único aminoácido (missense), o alteraciones de
regiones intrónicas o no traducidas, no son siempre los
mismos. En algunos casos, pueden suponer la pérdida total de actividad, pero en otros pueden no tener efectos tan
dramáticos, e incluso ser simplemente formas polimórficas
normales de la población (no asociadas a patología). En
estos casos son necesarios estudios funcionales, bien in
vivo o in vitro, o estudios familiares y poblacionales que
confirmen la asociación del cambio genómico con el fenotipo patológico. En este sentido, la detección de mutaciones no descritas previamente exigen la demostración, al
menos in vitro (bien en sistemas de expresión o en animales de laboratorio) de que el cambio de secuencia se
traduce en un cambio funcional.
En resumen, cada vez son más las enfermedades asociadas a trastornos de la información genética. Su conocimiento y una correcta interpretación de los datos redundará sin duda en una asistencia clínica más adecuada.
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