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Estudio de proteínas musculares por Western blot y técnicas de genética aplicadas a las enfermedades neuromusculares: PCR, RFLP y secuenciación Dra. IRENE VIÉITEZ GONZÁLEZ Servicio de Anatomía Patológica y Neuropatología – Hospital Meixoeiro Complejo Hospitalario Universitario de Vigo (CHUVI) Instituto de Investigación Biomédica de Vigo Cádiz, 21-24 Mayo 2013 - XXVI Congreso Nacional de la SEAP-IAP, XXI Congreso Nacional de la SEC, II Congreso Nacional de la SEPAF Consideraciones generales sobre ácidos nucleicos y proteínas FUNDAMENTO CENTRAL DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR • La información genética, contenida en el ADN, se mantiene y es trasferida a su descendencia por su capacidad de REPLICACIÓN •El ADN transfiere la información al ARN mediante la TRANSCRIPCIÓN en el núcleo. •El ARN mensajero se desplaza al citoplasma con la información del ADN y, mediante la TRADUCCIÓN, sintetiza las proteínas •Las proteínas son las encargadas de desarrollar las diferentes funciones de las células Núcleo Citoplasma Replicación Transcripción ADN Traducción ARN Proteína • Excepciones: - Retrovirus Transcripción inversa (transcriptasa inversa) - Virus de ARN Duplicación del ARN (ARN polimerasa) - Ribozimas: ARN con propiedades autocatalíticas, que son capaces de modificarse y replicarse por si mismos. - Priones: Proteínas que se autoreplican ADN: Ácido didesoxirribonucleico - NUCLEÓTIDOS de desoxirribosa: Adenina (A), Guanina (G), Citosina (C) y Timina (T) - ENLACE FOSFODIÉSTER - Dirección 5’ 3’ - Estructura en DOBLE HÉLICE y ANTIPARALELA - COMPLEMENTARIEDAD: A – T (2 puentes de H2) / G – C (3 puentes de H2) Nucleótido ARN: Ácido ribonucleico - NUCLEÓTIDOS de ribosa: Adenina (A), Guanina (G), Citosina (C) y Uracilo (U) -De cadena sencilla (5’ 3’) : MONOCATENARIO (excepto reovirus) - Complementariedad con el ADN molde (la Adenina se combina con Uracilo) TRANSCRIPCIÓN - Tipos de ARN Distintos papeles en la transmisión de la información ARN Mensajero: sirve de molde para la síntesis de las proteínas y transporta la información desde el DNA (núcleo) hasta el centro de producción de la síntesis proteica (ribosoma) ARN Ribosómico: forma parte de los ribosomas que llevan a cabo la traducción ARN Transferente: sirve para el transporte de los aminoácidos específicos desde las reservas citosólicas hasta los ribosomas y aseguran su correcto alineamiento Otros ARNs se emplean en la elaboración del RNA y en la exportación extracelular de proteínas RNA ribosomal (rRNA) RNA mensajero (mRNA) RNA de transferencia (tRNA) LAS PROTEÍNAS - Combinación de AMINOÁCIDOS (20 diferentes) - Compleja organización estructural: Cadena aminoacídica > Estructura cuaternaria (Complejo proteico) - Funciones muy diversas: Estructurales, Enzimas, Receptores, Hormonas, Anticuerpos… EL CÓDIGO GENÉTICO Relación entre la secuencia de nucleótidos del ADN y la secuencia de aminoácidos de la proteína Organizado en tripletes o CODONES: cada tres nucleótidos corresponden a un aminoácido. Los codones TAA, TAG y TGA indican la parada de la síntesis proteica. DEGENERADO: existe más de un triplete que codifica por el mismo aminoácido. ESPECÍFICO: ningún codón codifica más de un aminoácido CONTÍNUO: el cuadro de lectura de los tripletes se realiza sin espacios en sentido 5’-3’ desde el codón de inicio hasta el de parada. UNIVERSAL: el mismo triplete en diferentes especies codifica para el mismo aminoácido. ¿ Qué es un Gen? Unidad física y funcional básica de información contenida en el ADN Exón: Región del gen que se mantiene en el ARN mensajero tras su maduración (Splicing). Parte codificante del gen Intrón: Región del gen que no se mantiene en el ARN mensajero tras el proceso de Splicing. Parte no codificante del gen. GEN Maduración del ARNm ¿ Qué es un Alelo? En organismos diploides es cada una de las dos copias del gen presente en su genoma ALELO DOMINANTE: Alelo que enmascara la expresión fenotípica del otro alelo del mismo locus. ALELO RECESIVO: Alelo que para expresarse debe estar en ambos locus. HOMOCIGOTO: Los dos alelos iguales para un locus. HETEROCIGOTO: Los dos alelos distintos para un locus. MUTACIÓN: Tipos de mutaciones Cambio en la información genética que puede ser transmitido a la descendencia MUTACIONES PUNTUALES: Se produce el cambio de un único nucleótido “Missense”: Variación de un nucleótido que conlleva el cambio de un aminoácido por otro distinto. Secuencia normal Secuencia mutada 5’ ACTGCATTTAGC 3’ T A F S 5’ ACTGCATCTAGC 3’ T A S S “Nonsense”: Variación de un nucleótido que conlleva el cambio de un aminoácido por un codón de parada (TAG, TAA o TGA). Secuencia normal 5’ AGCTGCAGCAAT 3’ S C S N Secuencia mutada 5’ AGCTGAAGCAAT 3’ S X MUTACIONES FRAMESHIFT (Cambio en la pauta de lectura): Se produce un cambio total en el sentido del mensaje genético a partir del sitio de la mutación. Se sintetiza una proteína inactiva, a menudo truncada. Se debe a: DELECIONES, INSERCIONES, INDELS, DUPLICACIONES MUTACIONES IN-FRAME: Si el cambio afecta a un triplete o varios, la proteína solo pierde los aminoácidos implicados. MUTACIONES DE SPLICING (de corte y empalme) : Mutaciones que alteran el proceso de maduración de los ARNm generando transcriptos alterados que codifican por proteínas truncadas. Patrones de Herencia Genética Herencia Autosómica Dominante Herencia Ligada a X dominante Herencia Autosómica Recesiva Herencia ligada a X recesiva ANÁLISIS GENÉTICOS: Extracción de ácidos nucleicos PCR y PCR-RFLP Secuenciación Extracción ADN: Método de extracción por Fenol-Cloroformo Biopsia músculo Sangre en EDTA Otros tejidos Lisis de la muestra Protección del ADN y eliminación de material proteico y lipídico Precipitación o concentración Eliminación de inhibidores de las reacciones sucesivas Resuspensión Cuantificación • Tampón de Lisis de Rojos • Tampón de lisis de Blancos • Proteinasa K • SDS • Lavados con Fenol • Lavados con Cloroformo •Isopropanol •NaCl, EtOH •Lavados con EtOH 70% •Secado • H2O o TE • Espectrofotometría PCR: Reacción en cadena de la polimerasa • Consiste en la replicación de un fragmento de ADN de forma sucesiva Crecimiento exponencial • Tras la amplificación resulta mucho más fácil identificar y manipular el fragmento de ADN a análisis PCR: Reacción en cadena de la polimerasa • ADN molde (20ng-1μg) • Cebadores específicos (Primers) • Nucleótidos (dNTPs 0.8 mM) • DNA-Polimerasa • MgCl2 (1.5-4 mM) • Tampón • ddH2O • PCR-MULTIPLEX: Amplificación con varios sets de primers de un ADN molde Productos de distintos tamaños. - Detección rápida de deleciones en un gen (Distrofina, 1988) Análisis de una PCR: Electroforesis de Agarosa • Técnica para separar fragmentos de ADN mediante la aplicación de un campo eléctrico • El ADN tiene carga negativa por lo que se dirigirá al polo positivo • Separación de los fragmentos de ADN en función del peso molecular • Visualización por unión ADN – Bromuro de Etidio • También permite cuantificar y/o aislar el producto de PCR PCR SIMPLE PCR MULTIPLEX 1 2 3 RFLP: Restriction fragment length polymorphism • Estudio de una mutación conocida • Identificación de mutaciones en el fragmento amplificado utilizando enzimas de restricción (ER) y analizando los productos en gel de agarosa • Las ER cortan la cadena de ADN en sitios específicos dando un patrón de bandas característico • La presencia de una mutación modifica este patrón de bandas Fragmento amplificado: 576bp 5’GCGACCTCTTCAACCTCTCGGCGCCCCTGGCCCGGCCGGT GGGCACCAGCCTCTTTCTGCAGACCGCCCTTCGCGGCTGGGC GGTGCAGCTGCTGGACTTGACCTTCGCCGCGGCGCGCCAGCC CCCGCTGGCCACGGCCCACGCGCGCTGGAAGGCTGAGCGCGA GGGACGCGCTCGGCGGGCGGCGCTGCTCCGCGCGCTGGGCAT CCGCCTAGTGAGCTGGGAAGGCGGGCGGCTGGAGTGGTTCGG CTGCAACAAGGAGACCACGCGCTGCTTCGGAACCGTGGTGGG CGACACGCCCGCCTACCTCTACGAGGAGCGCTGGACGCCCCC CTGCTGCCTGCGCGCGCTGCGCGAACCGCCCGCTATGTGGTG GGCGTGCTGGAGGCTGCGGGCGTGCGCTACTGGCTCGAGGGC GGCTCACTGCTGGGGGCCGCCCGCCACGGGGACATCATCCCA TGGGACTACGACGTGGACCTGGGCATCTACTTGGAGGACGTG GGCAACTGCGAGCAGCTGCGGGGGGCAGAGGCCGGCTCGGTG GTGGATGAGCGCGGCTTCGTATGGGAGAAGGC 3’ Sustitución de C > A Bfa I 212bp M N HT HM 576 bp 364bp 364 bp 212 bp SECUENCIACIÓN DEL ADN La secuenciación permite realizar un análisis en profundidad del ADN y desvelar la información básica presente en el fragmento a estudio La secuenciación automática: • Método de Sanger DIDEXOSINUCLEÓTIDOS • Pasos de la reacción de Secuencia: I. Purificación del producto PCR Exosap ® II. Amplificación con un solo primer, ADN polimerasa, dNTPs + ddNTPs (Big Dye®) III. Desnaturalización de los fragmentos IV. Separación por electroforesis capilar V. Lectura de la secuencia REACCIÓN DE SECUENCIA 96° 96° 50° 60° 4° 1’ 10’’ 5’’ 4’ ∞ 25 ciclos SECUENCIACIÓN DEL DNA SECUENCIACIÓN DEL DNA CÓDIGO DE COLOR: ADENINA TIMINA ALELO 1 C GUANINA ALELO 2 C CITOSINA Normal Homocigoto ALELO 1 T ALELO 1 C ALELO 2 T ALELO 2 T Heterocigoto ANÁLISIS DE PROTEÍNAS: Western Blot WESTERN BLOT Técnica analítica para detectar proteínas específicas en extractos celulares o de tejido Obtención y preparación de la muestra Obtención y preparación de la muestra Etapas: Separación por electroforesis Trasferencia de proteínas Immunoblot Revelado Análisis de Resultados • Toma de la muestra (músculo – 20µg) • Lisis (Solución PIK + Inhibidores) • Homogenización • Sonicación • Separación de las fracciones de interés (Centrifugación) • Desnaturalización para SDS-Page (Adicción del tampón de Leemli y ebullición) WESTERN BLOT: Separación por electroforesis • Separación de las proteínas aplicando un campo eléctrico • Gel de Poliacrilamida Rápido y Versátil (Acrilamida/Bisacrilamida) • Gel Desnaturalizante (SDS- Page): Pérdida de la estructura 3D • Tampón de Electroforesis Mantener pH constante • Discontinua Gel Concentrador: < %Acrilm+Bisacrilm pH 6.8 (+ácido) Gel Separador: > %Acrilm+Bisacrilm pH 8.8 Las proteínas se separan solamente en función de su PESO MOLECULAR WESTERN BLOT: Transferencia de proteínas • Gel Poliacrilamida Membrana de Nitrocelulosa o PVDF • Accesibilidad de las proteínas a su detección con Anticuerpos • Electrotransferencia: - Sandwich: Filtro – Gel – Membrana – Filtro - Tampón de Transferencia - Corriente eléctrica: Cátodo (+) Ánodo (-) Gel Poliacrilamida Membrana Nitrocelulosa WESTERN BLOT: Inmunoblot Leche en polvo o BSA en tampón TTBS Bloqueo Anticuerpo primario Anticuerpo secundario Monoclonoal o Policlonal Dilución 1:200-1:2000 Tiempo de incubación Reconoce la inmunoglobulina de la especie en el que se ha producido el primario. Son conjugados con un sistema de revelación (HRP o AP) Detección Reacción de un sustrato (ej. luminol) catalizada por la Horseraddish peroxidase con emisión de luz. WESTERN BLOT: Análisis de Resultados •Se compara la altura de la banda obtenida con un marcador de pesos moleculares para confirmar que hemos detectado el producto de interés. •Cuando es necesario valorar la cantidad de proteína para comparar la expresión en diferentes tejidos o pacientes es necesario realizar una comparación con una proteína endógena cuya expresión no varia en las diferentes muestras (GAPDH, IgG, Actina). Aplicación al estudio de Enfermedades Neuromusculares ENFERMEDADES NEUROMUSCULARES DIAGNÓSTICO MOLECULAR Biopsia muscular + Historia clínica Datos paraclínicos Laboratorio Miopatología Banco de Tejidos Disección – Orientación M/E Inmunogold Sangre Congelación Cortes criostato Extracción de DNA Histoquímica Inmunohistoquímica Microscopía Confocal DIAGNÓSTICO Wb Bioquímica Banco de DNA PCR multiplex PCR-RFLP Secuenciación Otras Consejo genético DISTROFINOPATÍAS Fenotipos: Distrofina: Nexo de unión entre citoesqueleto y matriz extracelular Distrofia muscular de Duchenne Distrofia muscular de Becker 1987: Gen DMD localizado en Xp21 => 79 exones Herencia ligada a X recesiva: Mujeres portadoras y hombres afectos Estudio de exones de zona caliente del gen PCR MULTIPLEX PCR I PCR II 1 1 2 PCR multiplex detecta más del 95% de las deleciones en DMD 2 WESTERN BLOT Exón 45 Exón 48 Expresión de la Distrofina 1 2 3 4 5 6 7 427 kDa Exón 47 Exón 44 DMD DMB DMB 8 DISTROFIAS DE CINTURAS LGMD1C: Caveolinopatía Caveolina 3 (21kDa): Proteína integral de membrana para la formación de caveolas en el músculo Gen CAV3 (3p25) => 2 exones Herencia AD: Heterocigoto Afecto SECUENCIACIÓN A45T (exón 2) R26Q (exón 1) Control Heterocigoto Control Heterocigoto LGMD2C: Gamma-sarcoglicanopatía Gen SGCG (13q12) => 8 exones Gamma-sarcoglicano: 35kDa Etnia Gitana: Elevada prevalencia mutación C283Y (mutación fundacional) Población Mediterránea: Elevada prevalencia mutación del521T PCR-RFLP SECUENCIACIÓN C283Y → Rsa I del521T (exón 6) Control Homocigoto Heterocigoto GLUCOGENOSIS V: Enfermedad de McArdle • • • • • Glucogenosis más frecuente Miofosforilasa: Degradación del glucógeno PYGM (11q13) 20 exones Herencia AR Gran heterogeneidad alélica MUTACIONES MÁS FRECUENTES “ nonsense” R50X ( exón 1) Arginina > Stop (CGATGA) Mutación más frecuente “missense” W798R (exón 20) Triptófano > Arginina (TGGCGG) Mutación privada de España (2ª mutación más frecuente) MUTACIÓN Nº Total Missense/nonsense 69 Splicing 9 Pequeñas Inserciones 1 Pequeñas Deleciones 15 Grandes Deleciones 2 Duplicaciones 2 Indels 3 “ missense” G205S ( exón 5) Glicina > Serina (GGCAGC) 2ª mutación más frecuente en la población general R50X, W798R y G205S 78% alelos mutantes en pacientes españoles GLUCOGENOSIS V: Enfermedad de McArdle PCR-RFLP: Análisis de las mutaciones R50X, W798R y G205S Nonsense R50X Missense W798R Missense G205S Exón 1 Exón 20 Exón 5 CGA > TGA Arg > Stop TGG > CGG Trp > Arg GGC > AGC Gly > Ser 1: Marcador peso molecular 2: Producto PCR sin digerir 3: Caso Normal 4: Caso Homozigoto 5: Caso Heterozigoto SECUENCIACIÓN Inserción en el Exón 8 Inserción T entre nucleótidos 892-893 Alteración pauta de lectura Codón de parada prematuro 35 aminoácidos después Tyr Phe Val Secuencia normal: 5’ GAGTATTTCGTGGT… 3’ Secuencia mutada: 5’ GAGTTATTTCGTGG… 3’ Leu Phe Arg GLUCOGENOSIS II: Enfermedad de Pompe Maltasa ácida (105kDa): Degradación glucógeno lisosomal Gen GAA (17q25) 20 exones Herencia autosómica recesiva Diagnóstico Prenatal: CONCLUSIONES • CONFIRMACIÓN Y EXACTITUD EN EL DIAGNÓSTICO • MÉTODO DIAGNÓSTICO NO INVASIVO •DETECCIÓN PRECOZ DE LA ENFERMEDAD •DETECCIÓN DE HETEROCIGOTOS Y FAMILIARES AFECTOS •CONSEJO GENÉTICO: - Prevención de futuros casos - Diagnóstico prenatal o preimplantacional •CONOCIMIENTO DEL DEFECTO MOLECULAR: - PRONÓSTICO (correlación genotipo – fenotipo) - POSIBLES TERAPIAS GÉNICAS Muchas Gracias por su atención Grupo de Neurociencias NC-CHUVI Instituto de Investigación Biomédica de Vigo (IBIV) Coordinadora: Carmen Navarro Investigadores: • Saida Ortolano • Susana Teijeira • Irene Viéitez • Beatriz San Millán • Carlos Spuch Personal de apoyo: • Olga Souto • Soraya Barrera • TaniaVázquez-Santos DIAGRAMA GENERAL DE ESTUDIO GENÉTICO Muestra biológica Extracción DNA DNA PCR (Polymerase chain reaction) Análisis por Secuenciación Producto de PCR Análisis por RFLP (Restriction fragment length polymorphism) Reacción Secuencia Digestión (ER) RESULTADO DISTROFIAS DE CINTURAS ENFERMEDAD LOCUS (OMIM) PROTEÍNA MW (kDa) LOCALIZACIÓN LGMD1A 5q31 Miotilina 57 LGMD1B 1q21 Laminina A/C 74/65 LGMD1C 3p25 Caveolina 3 17 Transmembrana LGMD1D 7q Desmina 53 Citoplasma LGMD1E 6q23 DNAJB6 37 Citoplasma/Disco Z LGMD1F 7q32.1 TPNO-3 104 Membrana Nuclear LGMD1G 4q21 (Starling et al. Europ J Hum Genet 2004; 12: 1033-1040) Sarcómero Membrana Nuclear DISTROFIAS DE CINTURAS ENFERMEDAD LOCUS (OMIM) PROTEÍNA MW (kDa) LOCALIZACIÓN LGMD2A 15q15 Calpaina 3 94 Citoplasma LGMD2B 2p13 Disferlina 230 Membrana LGMD2C 13q12 - sarcoglicano 35 Transmembrana LGMD2D 17q11-q12 -sarcoglicano 50 Transmembrana LGMD2E 4q12 -sarcoglicano 43 Transmembrana LGMD2F 5q33-34 -sarcoglicano 35 Transmembrana LGMD2G 17q11-q12 Teletonina 19 Sarcomérica LGMD2H 9q31 TRIM32 72 Citoplasma LGMD2I 19q13 FKRP 60 Aparato de Golgi LGMD2J 2q 24-31 Titina 4200 Sarcomérica LGMD2K 9q34 POMT1 (Balci et al. Neuromusc Disord 2005; 15: 271-275) LGMD2B: Disferlinopatía Fenotipos: Disferlina (230kDa): Mantiene la integridad del sarcolema Gen DYSF (2p13) => 55 exones LGMD2B Miopatía distal de Miyoshi DMAT Cierta correlación Genotipo – Fenotipo: WESTERN BLOT 230 kDa 1 2 3 4 GLUCOGENOSIS V: Enfermedad de McArdle I83F Y85X R94Q R94W N102Dfs L153R L153P G157V G159R R161C G174D P230R V239del S246P A364V A365E W366X T379M E383K A384D E386Afs W388Sfs L397P L292P Y298Lfsx35 c.1000 -1G>T c.681 -2A>G M1V M1L L5RfsX20 L5Vfs V16Ffs E26Afs L36R H37QfsX33 R50X Y53X A55GfsX21 Q73Hfs c.855 +1G>C G486D T488N T488I R490W R490Q R490Afs R491C W492X V494Sfs c.1239 +1G>A 11 mutaciones E541X K543T K543X R570W R570Q Y574X K575E R576X Q577R L587P R650EfsX8 R650X E655K E796Vfs W798R Y733X K754Nfs Q755X R771Q c.1970-2177del c.1768 +1G>A c.1092 +1G>A T808P S809FfsX6 D815A W826S c.2380 -1G>A c.1769 -1G>A L116P E125X L132WfsX163 N134Kfs G136D R139W 12 mutaciones R194W G205S G205D R270X E337R E349K L354P W362X R428C G449R S450L A452Rfs G455R V456M P454_L464 D511Tfs D534Vfs Hotspots in exons 1, 14 y 17 (32% mutations) 23 nuevas mutaciones R590H F599Lfs R602W R602Q K609K A660D D662A Q666E A670V N685Y G686R G686R A687P T692Kfs A704V G705Rfs F710del R715W 14 mutaciones C784X Q785X SECUENCIACIÓN PYGM Deleción 5 nucleótidos Alteración pauta de lectura Codón de parada prematuro (PTC) 21 aminoácidos después Deleción T14 Alteración pauta de lectura Codón de parada prematuro (PTC) 20 aminoácidos después GLUCOGENOSIS IIb: Enfermedad de Danon • • • • LAMP2 Xq24 Herencia dominante ligada a X 9 exones Splicing alternativo exón 9: - Isoforma LAMP2a - Isoforma LAMP2b Músculo estriado y cerebro MUTACIÓN Nº Total Sustituciones nucleotídicas (Missense/Nonsense) 10 Pequeñas Inserciones 3 Pequeñas Deleciones 9 Grandes Deleciones 5 Splicing 10 Small Indel 1 Q359PfsX13 (c.1074InsC) Secuencia Normal Viéitez I et al. Human Genetics 2008. Secuencia Mutada
