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Resumen: A-039
UNIVERSIDAD NACIONAL DEL NORDEST E
Comunicaciones Científicas y Tecnológicas 2004
Proyecto Internacional de Secuenciación del Genoma de Arroz:
Su utilidad para el mapeo de alta densidad y el clonado posicional de genes en trigo.
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Olmos, Sofía - Echenique, Viviana
1.Cátedra de Cultivos II, Facultad de Ciencias Agrarias, UNNE 2.CONICET, Departamento de Agronomía, Universidad Nacional del Sur.
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Antecedentes
Los estudios genéticos de Devos y Gale, (1997) entre otros, revelaron que la organización y el orden de los genes
(colinearidad) dentro de los genomas ha permanecido muy conservada a través de la evolución, existiendo estrechas
relaciones entre los genomas de casi todas las gramíneas cultivadas, entre las Solanáceas, entre las Brasicáceas
cultivadas y Arabidopsis, entre los pinos, Rosáceas y varias leguminosas. En función de este conocimiento los
emprendimientos genómicos en vegetales tomaron especies modelo representativas de un genoma vegetal.
Los cereales varían en cuanto a su contenido de ADN, desde aproximadamente 400 Mb en los genomas de arroz y
Panicoideas, hasta 17.000 Mb en el trigo pan (Triticum aestivum L. em Tell). Esta enorme diferencia en contenido de
ADN no se debe a la presencia de mayor cantidad de genes en el trigo sino a la abundancia de secuencias de ADN
repetitivas, que no son genes y que en muchos casos son específicas de cada especie.
Debido a que el genoma del arroz es el más pequeño entre los cereales utilizados en alimentación humana, siendo
solamente cuatro veces más grande que el de Arabidopsis, ha sido considerado como un modelo para estudiar a otras
especies de cereales. La secuenciación de este genoma ha sido llevada a cabo por el International Rice Genome
Sequencing Project (IRGSP). Este organismo está formado por varios centros de investigación privados y públicos de
Japón, USA, China, Taiwán, Corea, Francia, India y Tailandia. Cada uno de los centros de investigación tuvo a cargo la
tarea de secuenciar 1 ó más de los 12 cromosomas del genoma de arroz.
Los resultados obtenidos de cada centro de investigación, luego ser verificados para la búsqueda de posibles errores de
secuencias, son depositados en la base de datos pública del Genbank. Estas secuencias representan actualmente
546,247,895 bp, y cubrirían aproximadamente el 126,7 % del genoma de arroz. El porcentaje final sobrestima la
cobertura real debido a la redundancia de secuencias debida al solapamiento de algunas de ellas.
En lo que respecta al trigo pan (2n= 6x= 42; AABBDD) su genética resulta compleja, ya que es de naturaleza
hexaploide, con tres genomas homeólogos denominados A, B y D, que aportan 7 pares de cromosomas cada uno. Los
genes redundantes son una norma, con sets homoalélicos triplicados en la mayoría de ellos. Dentro de los cereales, el
genoma de trigo pan es el de mayor tamaño (17000 Mb trigo, 2800 Mb maíz, 800 Mb sorgo). Más del 80% del genoma
de trigo lo constituyen secuencias de ADN altamente repetitivo. El restante 20% está compuesto por ADN de bajo
número de copias o copia única, donde se encuentran la mayoría de los genes. Otro trigo cultivado, el trigo fideo o
candeal (T. turgidum) es un tetraploide (2n= 4x= 28) constituído por dos genomas (AABB). La especie diploide más
estudiadas es T. monococcum, uno de los ancestros del trigo pan y que posee dos copias del genoma A.
Objetivos
El presente trabajo describe los procedimientos que posibilitan el aislamiento de genes en trigo mediante el clonado
posicional basado en el mapeo genético de alta densidad y el desarrollo de marcadores facilitado por el mapeo
comparativo entre los genomas de arroz y trigo.
Materiales y Métodos
Conceptos
Se definen a continuación algunos conceptos de las herramientas genéticas necesarias para lograr el objetivo propuesto:
Marcadores moleculares: son secuencias de ADN que resultan variables (polimórficas) entre los individuos de una
población. Los más utilizados son los polimorfismos en la longitud de los fragmentos de restricción (RFLP),
microsatélites, y los ADNc (ESTs, Expressed Sequence Tag Sites).
Población de mapeo: es una población de individuos que se encuentra segregando para un gen. Las más empleadas son
las obtenidas por retrocruzas (BC1F1), las semillas F2, las líneas isogénicas recombinantes obtenidas por la
autofecundación de cada semilla F2 (RILs), y los dobles haploides (DHs) obtenidos por el cultivo de anteras o por
cruzamientos interespecíficos con maíz. Las poblaciones más adecuadas para el estudio de genes de herencia
cuantitativa son las RILs y DHs debido a que permiten hacer ensayos a campo con gran cantidad de individuos
homocigotas y magnificar así la varianza genotípica.
Mapa genético: mediante el empleo de los marcadores moleculares y una población de mapeo que difiera
marcadamente en un carácter es posible establecer la proximidad entre un marcador molecular y el gen responsable del
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mismo para la especie vegetal en estudio. Esta proximidad, medida en unidades de mapa (cM), es una consecuencia del
ligamiento genético existente entre el/los gen/es y los marcadores moleculares, y es la base sobre la que se fundamenta
el uso de estas herramientas. En el mapeo genético se emplea a los marcadores moleculares como puntos de referencia
y se basa en la frecuencia de recombinación entre los cromosomas homólogos. Esto se logra estableciendo la asociación
entre los datos genotípicos (la contabilización de los alelos de los progenitores de cada individuo) y los datos
fenotípicos (midiendo el carácter de interés agronómico) mediante programas como por ejemplo el Mapmaker (Lander
et al., 1987).
Mapa físico: permite conocer la posición exacta de cada marcador dentro de los cromosomas. Se basan en distancias
moleculares, resultantes de mapas de fragmentos de restricción pracialmente superpuestos. La distancia entre dos
marcadores puede ser medida determinando el tamaño de los fragmentos de restricción que los contienen, siendo el
fragmentos más pequeño que lleva ambos marcadores una estimación de la distancia entre ellos. Utilizando
combinaciones de sondas y enzimas de restricción puede construirse un mapa físico determinando que fragmentos
poseen marcadores en común. Las distancias físicas entre marcadores se miden en kilobases o megabases. Los
marcadores utilizados para este fin son los RFLP y los ESTs. Otro método emplea un stock citogenético de líneas de
deleción, formado por un conjunto de cromosomas de la especie en estudio que se diferencian por tener combinaciones
de intervalos cromosómicos delecionados (llamados BIN) en distintas posiciones. La comparación de la
presencia/ausencia del marcador en cada stock indicaría la posición física del mismo.
Mapeo in silico: se denomina así a la comparación computacional de secuencias y al establecimiento de similitud entre
el ADN de los marcadores moleculares y los fragmentos de ADN genómicos secuenciados. Este procedimiento se
realiza con programas como el BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov).
El paso final consiste en anclar el mapa genético (formado por un ordenamiento relativo de marcadores basados en su
frecuencia de recombinación) en el mapa físico obtenido a partir de la secuencia del ADN genómico.
Secuenciación y anotación del genoma: para secuenciar el genoma, el ADN genómico aislado se trata con enzimas de
restricción a fin de cortarlo en fragmentos grandes, que luego son insertados y clonados en vectores que aceptan insertos
de gran tamaño como los cromosomas artificiales de bacterias (BACs). El conjunto de BACs que contiene una
colección del genoma de una especie se denomina biblioteca genómica o genoteca. Para el caso de trigo existen
genotecas para los genomas A y B.
Una vez finalizada la secuenciación de un genoma se realiza la anotación, procedimiento por el cual se procede al
análisis de las secuencias de manera de predecir la estructura del o de los genes contenidos en un fragmento genómico
secuenciado mediante el empleo de programas de computación como el FgenesH (http://www.gramene.org) o el
GenScan (Burge y Karlin, 1998), luego de lo cual la secuencia se deposita en la base de datos. Las secuencias
codificantes predichas se comparan con las secuencias de proteínas conocidas a fin de asignarles una función probable.
Clonado posicional: consiste en aislar un gen de interés dentro de los fragmentos de ADN genómicos clonados
facilitado esto por un mapeo genético de alta densidad. Para ubicar un gen cuya secuencia se desconoce se puede partir
de un marcador conocido que esté estrechamente ligado al mismo. Este marcador actúa como punto de partida para el
caminado cromosómico, por el cual los fragmentos finales de del marcador ligado son utilizados como sondas para
seleccionar otros clones de la genoteca. Del segundo grupo de clones (los que solapan con el inicial) se hacen mapas de
restricción y los fragmentos obtenidos son utilizados para hacer una nueva ronda de selección de clones superpuestos.
Así el proceso de caminado se mueve hacia ambos lados a partir del sitio inicial, que culmina cuando se llega el clon de
interés. En Triticum monococcum (genoma A) recientemente se ha logrado el clonado posicional del gen VRN1(Yan et
al., 2003). y del gen VRN2 (Yan et al., 2004) basados en el mapeo comparativo con arroz y cebada, los genes VRN1 y
VRN2 son los principales responsables de los requerimientos de vernalización para la floración en los trigos invernales.
Procedimientos
Desarrollo de mapas genéticos de alta densidad:
Muchos caracteres de interés agronómico (como rendimiento, contenido de nitrógeno en el grano, resistencia a
enfermedades, etc.), son regulados por un sistema complejo de genes localizados en distintos loci de un mismo
cromosoma o en diferentes cromosomas y son altamente influenciados por factores ambientales.
La identificación de las regiones cromosómicas asociadas a la variación fenotípica de este tipo de caracteres, y la
magnitud en que cada una de dichas regiones afecta al fenotipo, puede establecerse utilizando poblaciones de mapeo
para las cuales se disponga de mapas genéticos con marcadores moleculares que se encuentren cubriendo gran parte del
genoma. Estas poblaciones de mapeo son luego ensayadas agronómicamente en condiciones de campo a fin de
cuantificar la magnitud de la variación fenotípica debida a un genotipo. Las regiones cromosómicas que explican parte
de la variación observada en un carácter son llamadas QTLs (Quantitative Trait Loci) o Loci de Herencia Cuantitativa.
Una de las principales dificultades para el estudio del genoma del trigo es su gran tamaño y la baja variabilidad genética
debida a su sistema de reproducción (autogamia). Esto requiere analizar miles de individuos en una población de mapeo
y cientos de marcadores moleculares a fin de obtener mapas genéticos de alta densidad.
Un mapeo genético de alta densidad requiere, en primera instancia, del conocimiento previo de la localización
cromosómica del gen de interés, en base a la información aportada por los mapas genéticos y del posterior desarrollo de
una población de mapeo homocigota recombinante en la región circundante al gen o QTL constituída por un número
elevado de individuos. Para ello se emplean las RILs y DHs provenientes de progenitores que difieren en el carácter
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agronómico en estudio y se requieren marcadores moleculares polimórficos, que permitan obtener resoluciones
cercanas a 0,1 cM. Para esto, se pueden emplear los RFLP provenientes de mapas genéticos de los otros genomas
homeólogos de trigo o de las regiones homólogas de otras especies de gramíneas aprovechando los estudios de mapeo
comparativo.
Asimismo, una gran herramienta es el empleo de los ESTs (ADNc). La complejidad del genoma del trigo ha hecho
aconsejable abordar los estudios genómicos a través del transcriptoma. Para ello, se han establecido consorcios
internacionales. Las bases de datos de EST han crecido exponencialmente en la última década, de manera que en el
National Center for Biotechnology Information dbEST database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/dbEST) en Marzo de
2004 había 20 millones de ESTs. Esto incluye cerca de 1 millon de ESTs de trigo hexaploide y sus parientes más
cercanos de la tribu Triticeae, que son Hordeum vulgare L., especies diploides y tetraploides de Triticum, Secale
cereale L. y Aegilops speltoides Tausch.
Mapeo comparativo:
Los estudios pioneros de Van Deynze et al., 1995; Devos y Gale, (1997), mostraron que extensas regiones del genoma
de arroz contiene grupos de marcadores moleculares cuya composición y orden se encuentran altamente conservados en
muchos cereales por lo que el genoma de estos pueden describirse básicamente como conjuntos de “bloques de
ligamiento de genes de arroz”. A este fenómeno, visto también en otros grupos de plantas, se denomina colinearidad o
sintenía.
El mapeo comparativo, esto es el mapeo genético empleando marcadores cruzados entre especies diferentes, de los
genomas de trigo y arroz permitió conocer cuales son los cromosomas de arroz homólogos a los de trigo. Por ejemplo,
el cromosoma 6B de trigo candeal es homólogo al cromosoma 2 de arroz. De esta manera, la información proveniente
del Proyecto Internacional de Secuenciación del Genoma de Arroz facilita el desarrollo de nuevos marcadores
moleculares para trigo. El establecimiento de las regiones de homología entre ambos genomas permite determinar la
Macrocolinearidad en primer instancia. Los estudios de macrocolinearidad pueden realizarse utilizando los datos
depositados en el TIGR (The Institute for Genomic Research, http://www.tigr.org), donde se disponen para cada uno de
los 12 cromosomas de arroz, los mapas in silico de anclaje entre las secuencias de los BACs de arroz del proyecto
internacional y los marcadores genéticos de arroz provenientes de diversos trabajos publicados. A su vez, para delimitar
el intervalo físico de arroz correspondiente a la región de trigo de interés, se buscan dentro del mapa de anclaje in silico
del cromosoma respectivo de arroz los marcadores genéticos de arroz que se hubieran mapeado en la región homóloga
de trigo. Dichas comparaciones pueden ser realizadas mediante la herramienta CMap Comparative Map Viewer del
sitio www.gramene.org.
Una vez acotados los BACs homólogos a la región colinear con trigo, se emplean los programas predictores de genes
como el FgenesH (del sitio http://www.gramene.org) a fin de predecir las regiones codificantes en cada clon de BAC.
Las regiones codificantes predichas (correspondientes a genes probables) se emplean para buscar homologías con los
ESTs de trigo mapeados en aquellos BINs (intervalo de deleción, generalmente hay 3-4 BINs por brazo) del mapa físico
de trigo que se espera contengan la región del mapa genético delimitando al gen, locus, loci o QTL en estudio.
Los ESTs de trigo homólogos se purifican o bien se diseñan primers específicos a partir de sus secuencias a fin de
amplificarlos mediante PCR y se emplean como sondas de hibridación en los Southern. Estas sondas son luego
mapeadas en la población si previamente resultaron polimórficas entre los progenitores.
Con los nuevos marcadores mapeados se construye un nuevo mapa genético de mayor densidad gracias a la
microcolinearidad que hubiera entre el genoma de trigo y arroz para la región del gen de trigo estudiado.
De esta forma, gracias a la macrocolinearidad y microcolinearidad y a la utilización de los clones de BACs de arroz, y
mediante los procedimientos descriptos, es posible desarrollar nuevos marcadores moleculares que facilitan la
construcción de mapas genéticos de alta densidad en trigo. Si se encontrara en las secuencias de arroz microcolineares a
la de trigo al gen de trigo estudiado, sería entonces una cuestión de muy buena suerte.
Aquellos marcadores genéticos que delimitan al gen de interés en trigo y que se encuentren separados a una distancia de
aproximadamente 0,1 cM pueden ser usados como sondas de hibridación para hacer el screening de la biblioteca
genómica de los gemomas A y B dando inicio al clonado posicional del gen.
Conclusiones
Debido al tamaño de sus genomas y a la complejidad de los mismos los trabajos de clonado posicional se han encarado
en trigo diploide y no en trigo hexaploide o tetraploide. Sin embargo, el establecimiento de la microcolinearidad entre
arroz y trigo y la utilización de la información provista por el Proyecto Internacional de Secuenciación del Genoma de
Arroz permitió realizar grandes avances en el mapeo de alta densidad y tendiente al clonado posicional del gen Gpc6B1 responsable de altos contenidos de proteína en el trigo tetraploide. Este gen se halla localizado en el brazo corto del
cromosoma 6B (Fig. 1, 2) (Olmos et al., 2003; Distelfeld et al., 2004). Estos avances fueron posibles gracias a: 1) el
desarrollo de una gran población de mapeo homocigota, 2) el desarrollo de gran cantidad de marcadores moleculares, y
3) la aplicación de un correcto diseño experimental para evaluar el fenotipo (proteína en grano) altamente influenciado
por el ambiente.
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Fig. 1. (Izquierda) Colinearidad entre el mapa genético del brazo
corto del cromosoma 2 de arroz (izq: Rice 2S) y el mapa genético
del brazo corto del cromosoma 6B de trigo (medio: Wheat 6BS)
(Distelfeld et al., 2004). Derecha, Análisis de QTL del contenido
de proteína en el grano de trigo tetraploide (Olmos et al., 2003).
Fig. 2. (Abajo) Microcolinearidad entre la región del gen Gpc6B1 en el brazo corto del cromosoma 6 de trigo y el brazo corto
del cromosoma 2 de arroz ((Distelfeld et al., 2004). Las líneas
sobre el cromosoma de arroz representan la posición de los BACs
de arroz en el mapa físico de arroz. Las líneas fuera de los
rectángulos indican la comparación del mapa genético de trigo y
arroz fuera de la región adyacente al gen Gpc-6B1. La
determinación del contenido de proteína de las RILs
recombinantes en las proximidades del gen Gpc-6B1permitió el
mapeo del mismo entre los marcadores Xucw79 y Xucw71 (región
gris oscura).
Bibliografía
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