Download evaluación de la toxicidad de extractos de esporas del hongo

EVALUACIÓN DE LA TOXICIDAD DE EXTRACTOS DE ESPORAS DEL HONGO
THECAPHORA FREZII, EN CULTIVOS DE CÉLULAS EUCARIOTAS
Mary V.S., Otaiza S.N., Arias S.L., Rubinstein H.R. y Theumer M.G.*
Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología CIBICI-CONICET, Dpto de Bioquímica Clínica de
Facultad de Ciencias Químicas, Universidad Nacional de Córdoba. *[email protected].
Introducción
Durante la campaña agrícola 1994/95 se detectaron por primera vez en Argentina, frutos de maní con carbón,
provenientes de la región centro-norte del área manisera de Córdoba. Esta patología es producida por el hongo
Thecaphora frezii, el cual actualmente se ha diseminado y la afección se registra en toda el área manisera de
Córdoba, con incidencias y prevalencias variables entre campañas y distintas regiones; aunque la severidad del
problema en general es mayor en la región norte de la provincia.
Además de las grandes pérdidas económicas que causa el carbón por T. frezii en toda la cadena de
comercialización del maní, partiendo desde el productor, es necesario tener en cuenta que la ingesta de maní o
de sus productos derivados contaminados con las esporas de dicho hongo, llamadas teliosporas, podrían
causar efectos tóxicos en el público consumidor, aunque en la actualidad disponemos de información
toxicológica muy escasa que avale o descarte de plano esta aseveración. En estudios previos realizados por
nuestro grupo de investigación se observó que el consumo subcrónico de maní infectado con T. frezii no afectó
el perfil nutricional (peso y ganancia de peso), hematológico, bioquímico (función hepática y renal) ni histológico
(análisis histopatológico de hígado, bazo, pulmón y riñón) de ratas Wistar. Sin embargo, debido a que la
susceptibilidad o resistencia de distintas especies a la toxicidad de las teliosporas puede ser diferente, el
objetivo del presente trabajo fue evaluar la citotoxicidad de extractos de teliosporas en células humanas
cultivadas in vitro.
Materiales y Métodos
Se prepararon tres extractos de teliosporas con hexano (E-Hex), acetato de etilo (E-AcEt), y metanol (E-MeOH),
a los fines de separar los compuestos liposolubles, de polaridad intermedia, y los compuestos más polares,
respectivamente. Para esto se utilizaron teliosporas purificadas a partir de maní contaminado, cosechado en la
campaña 2013-2014. Los extractos fueron evaporados a sequedad bajo corriente de nitrógeno, redisueltos en
dimetilsulfóxido (DMSO), esterilizados por filtración y conservados a 4 °C hasta su utilización.
El estudio se realizó en líneas celulares humanas de origen hepático (HepG2) y de epitelio de colon (Caco-2),
muy utilizadas en toxicología debido a que permiten evaluar los efectos citotóxicos sobre los blancos de acción
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principales de toxinas que ingresan por vía oral. Las células fueron sembradas en placas de 96 pocillos (10
células/pocillo) y cultivadas en medio de cultivo DMEM (enriquecido con 10 % de suero fetal bovino, 2 mM de
glutamina y 50 μg/mL de gentamicina), al que se le adicionó distintas concentraciones (0,1; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 y 1
%) de E-Hex, E-AcEt, E-MeOH o DMSO, durante 48 h a 37 °C y 5 % de CO2.
La viabilidad celular se determinó por la habilidad de las células para convertir bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT) en cristales de formazán por medio de la enzima mitocondrial succinatodeshidrogenasa. Brevemente, el medio de cultivo se reemplazó por una solución de MTT (0,5 mg/mL) en
DMEM enriquecido, que luego de una hora fue removida y el formazán fue solubilizado con DMSO. La
intensidad del color (evaluada por espectrofotometría a 595 nm) es proporcional al formazán sintetizado y al
número de células viables.
Resultados y discusión
La viabilidad de las células Caco-2 y HepG2 no fue significativamente afectada por ninguna de las
concentraciones de los extractos (E-MeOH, E-AcEt y E-Hex) de teliosporas estudiadas. Estos resultados
estuvieron de acuerdo con estudios previos realizados en ratas Wistar alimentadas durante 180 días con maní
contaminado con teliosporas, en los cuales no se observaron cambios en la histología ni en la función hepática
de las ratas.
Debido a que es conocido el efecto tóxico inducido por DMSO en bacterias y células de origen animal o
humano, el rango de concentraciones utilizadas de este disolvente universal fue testeado en los dos tipos de
células estudiados para poder realizar una correcta interpretación de los resultados. El porcentaje de células
viables en ambas líneas celulares fue significativamente reducido por DMSO en el rango 0,4 - 1 %,
manteniéndose la viabilidad alrededor del 80 %. Este porcentaje es aceptable ya que para poder evaluar
citotóxicidad es necesario tener al menos 70 - 80 % de células viables.
Conclusiones
Los extractos metanólicos, con acetato de etilo y con hexano, de teliosporas no producen efectos citotóxicos en
el rango 0,1 -1 %, en las líneas celulares humanas Caco-2 y HepG2.
En función de estos resultados, el rango de concentraciones de los extractos de teliosporas evaluado es
adecuado para realizar estudios toxicológicos.
Viabilidad celular (%)
Efectos de los extractos metanólico (E-MeOH), de acetato de etilo (E-AcEt), de hexano (E-Hex), y del
vehículo (DMSO) sobre la viabilidad de las líneas celulares Caco-2 y HepG2.
El gráfico muestra el promedio de tres experimentos independientes ± el error estándar.
b
c
Letras indican diferencias entre los tratamientos y el control correspondiente ( p ˂ 0,01; p ˂ 0,001).
Financiación: El presente trabajo fue financiado por Fundación Maní Argentino, PICT 2013-0750 y SECyTUNC. Mary V.S. y Otaiza S.N. son becarios CONICET. Arias S.L. es becaria SECyT-UNC. Theumer M.G. es
investigador de CONICET.