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Terapia génica
Antonio Martínez Laborda
Área de Genética
Departamento de Biología Aplicada
Universidad Miguel Hernández de Elche
Campus de Sant Joan d’Alacant
Terapia génica
Terapia génica
Introducción
• Medicina molecular: Dilucidación de las bases genéticas
de las enfermedades, técnicas de
diagnóstico y diseño de terapias
adecuadas.
Patología
molecular
Introducción
- Terapia génica: Utilización de ácidos nucleicos con
fines terapéuticos. Incluye:
- Restaurar la función de un gen
defectuoso.
- Incrementar la función de un gen
endógeno con fines terapéuticos.
- Eliminar la expresión de un gen
endógeno con efecto patológico o
la expresión del gen/es de un
patógeno.
Requiere un profundo conocimiento de las causas
moleculares de la enfermedad:
- Identificación de células o tejido diana.
- Identificación de los genes y proteínas implicados
Introducción
• La terapia génica, según la naturaleza de las células
diana, la podemos clasificar en dos clases:
- Terapia génica de células somáticas.
Las células diana son células no germinales (no
implicadas en la producción de gametos).
Coherente con las técnicas generales de terapia
médica, en las que el tratamiento no alcanza más
allá del individuo afectado.
- Terapia génica de células germinales.
Implica la potencial modificación de la descendencia
del individuo.
En la actualidad, no se contempla dentro de la práctica
médica, además de chocar con cuestiones éticas.
Introducción
• La terapia génica consiste en una serie de estrategias con
finalidad terapéutica, basadas en la transferencia de
material genético a un individuo. Esto se puede conseguir
mediante técnicas in vivo y ex vivo.
in vivo
ex vivo
Células del
paciente X-
Algunas
células son
ahora X+
Estrategias de terapia génica
• Terapia de aumento génico (GAT)
La terapia de aumento génico (GAT) consiste en la
introducción y expresión de la versión silvestre de
un gen para corregir enfermedades debidas al
déficit de un determinado producto
Estrategias de terapia génica
• Terapia de aumento génico (GAT)
- Problemas ocasionados por la pérdida de función del gen.
- Copias adicionales el alelo normal  aumenta la
cantidad de producto funcional hasta un punto en el
que se restablece el fenotipo normal.
- Trastornos recesivos en los que una expresión modesta
del gen introducido puede suponer una diferencia
sustancial.
- Las mutaciones dominantes por haploinsuficiencia no
son buenas candidatas a tratarse con esta estrategia.
Estrategias de terapia génica
• Supresión dirigida de células específicas
- Se ha utilizado en tratamientos de cánceres.
- La eliminación directa consiste en la transferencia a las
células de genes que codifican toxinas (genes suicidas) o
agentes que confieren sesibilidad al tratamiento con
determinados fármacos (prodrogas).
- La eliminación indirecta consiste en la transferencia de
un gen cuyo producto va a dirigir una respuesta inmune
contra las células diana.
Estrategias de terapia génica
• Supresión dirigida de células específicas
Eliminación directa de células
Estrategias de terapia génica
• Supresión dirigida de células específicas
Eliminación indirecta de células
Estrategias de terapia génica
• Supresión dirigida de células específicas
Eliminación directa de células
Mecanismo de acción de Cerepro. Se trata de un vector adenoviral con
el gen de la kinasa de timidina del virus herpes simple. La enzima
convierte el ganciclovir en un producto tóxico para la célula.
Estrategias de terapia génica
• Inhibición dirigida de la función génica
Gen antisentido
m
Inhibición
Si las células enfermas presentan un nuevo producto génico
o la expresión inadecuada de un gen, como en muchos
casos de cáncer o en enfermedades infecciosas, se pueden
diseñar estrategias para bloquear la expresión de un único
gen en el DNA, el RNA o la proteína
Estrategias de terapia génica
• Inhibición dirigida de la función génica
RNA antisentido y Ribozimas
Estrategias de terapia génica
• Inhibición dirigida de la función génica
Interferencia de RNA (shRNA, siRNA, miRNA)
Estrategias de terapia génica
• Inhibición dirigida de la función génica
Fosforotiorato
Apuntes históricos de la Terapia Génica
• 1967. El premio Nobel Marshall Niremberg argumenta las
posibilidades y peligros de la terapia génica.
• 1989. Steven A. Rosenberg llevó a cabo la primera
transferencia génica aprobada en humanos.
• 1991. Anderson y col. realizan el primer ensayo terapéutico
con transferencia génica en pacientes de ADA.
• 1999. Muerte de Jesse Gelsinger en un ensayo clínico
para el tratamiento de una deficiencia parcial en la enzima
ornitina transcarbamilasa. La muerte se produce por la
respuesta inmunológica al vector adenoviral empleado.
• 2000. Curación de la XSCID en los ensayos de terapia
génica. No obstante, varios niños desarrollan leucemia
por la integración de la secuencia introducida cerca de
un protooncogén. Muere uno de ellos.
Apuntes históricos de la Terapia Génica
• 2003. Se aprueba en China el primer medicamento basado
en técnicas de terapia génica (Gendicine). Se trata de un
vector adenoviral en el que se sustituye la secuencia del
gen E1 por la del gen supresor de tumores p53. Diseñado
para el tratamiento de cánceres de cabeza y cuello. No
obstante, se aprobó sin la realización de un ensayo clínico
de fase III estándar.
• 2012. El EMA (European Medicines Agency) aprueba el
uso con restricciones de Glybera en la UE. Glybera se basa
en un vector AAV que lleva un alelo de ganancia de función
del gen para la enzima lipoproteína lipasa.
Apuntes históricos de la Terapia Génica
Vitravene es un oligonucleótido
antisentido que inhibe la replicación
del citomegalovirus (CMV), cuyas
infecciones causan retinitis (deriva
en ceguera en enfermos de SIDA)
Macugen se ha diseñado para tratar
la mácula degenerativa. Se trata de
un aptámero que se une a la proteína
VEGF (vascular endothelium growth
factor), inhibiendo su función. VEGF
tiene efectos angiogénicos y
proinflamatorios que contribuyen
a la patología.
Vectores
• La terapia génica requiere la introducción de ácidos
nucleicos en células diana y, en ocasiones, la expresión
funcional de las secuencias introducidas.
• Los vectores son vehículos que facilitan la transferencia
de ácidos nucleicos al interior de las células.
• Los sistemas de vectores empleados en terapia génica
pueden clasificarse en dos tipos:
- Vectores virales.
- Vectores no virales.
Vectores. Liposomas
• Vesículas esféricas compuestas de bicapa lipídica
sintética que mimetiza la estructura de las membranas
biológicas.
• Clases de liposomas:
- Aniónicos. Carga negativa.
- Catiónicos. Carga positiva.
La carga positiva estabiliza la unión del ADN con carga
negativa.
Vectores muy utilizados en los intentos de terapia in vivo.
Vectores. Liposomas
Vectores retrovirales
Glicoproteína
Reconocimiento
de la célula
hospedadora
Receptor
celular
Virus de RNA
Vectores retrovirales (gammaretrovirus)
LTR
Gag
Pol
LTR
Env
Promotor Proteínas de Retrotranscriptasa Glicoproteína
la cápside
Integrasa
de la envuelta
PBS

Retrovirus MLV
Sitio de
poliA
PPT
Transgén. Hasta 8 kb
Riesgos derivados de la
inserción en el genoma de
la célula receptora
Sólo sirve para células que
se están dividiendo (uso
normal para terapia génica
ex-vivo)
Vectores retrovirales (gammaretrovirus)
La secuencia U3 se duplica durante la transcripción inversa, por
lo que aparece también en el LTR 5’ del provirus. Esta región
contiene elementos esenciales para la transcripción del virus.
Se deleciona para construir los vectores retrovirales SIN (selfinactivating)
Vectores retrovirales (gammaretrovirus)
Los vectores SIN utilizan un promotor fuerte CMV en lugar del
promotor retroviral, lo que da lugar a mejores rendimientos.
Además, presentan la deleción de la región U3.
Una vez insertados, se minimizan los riesgos de movilización
del vector y de activación de protooncogenes.
Vectores retrovirales (lentivirus)
A diferencia de los
gammaretrovirus
pueden infectar a
células que no se
dividen
Vectores adenovirales
P
36 kb de ADN bicatenario lineal
E1
ITR
E2
L1 L2 L3 L4
E2
E3
L5
E4
ITR
Adenovirus
Responsables de enfermedades respiratorias, conjuntivitis y
gastroenteritis. Dan lugar a una fuerte respuesta inmunológica.
P
ITR
E1
Prom
cDNA E2
L1 L2 L3 L4
E2
E3
L5
E4
ITR
5,1 Kb
Los vectores adenovirales de primera generación sustituían el gen E1
para acomodar hasta 5,1 kb, o sustituían los genes E1 y E3 para
acomodar hasta 8,3 kb. Fuerte respuesta del sistema inmunitario.
Se producen linfocitos T citotóxicos que eliminan a las células
Infectadas.
Vectores adenovirales
Los vectores adenovirales de segunda generación se diseñaron con la
intención de producir una respuesta inmunológica menos aguda.
Eliminan los genes E1, E3, E2 y E4, lo que permite incorporar hasta
14 kb de inserto. No obstante, siguen produciendo respuesta
citotóxica.
Los vectores adenovirales de tercera generación sustituyen todas las
secuencias del adenovirus, excepto las imprescindibles para la
replicación del DNA viral (ITR) y para el empaquetamiento en la
cápside () por un inserto de hasta 37 kb. Siguen produciendo
respuestas inmunológicas debido a la cápside viral.
Estos vectores permiten la transformación tanto de células en división
como de células que no se dividen. Se pueden emplear in vivo y ex vivo.
El DNA terapéutico no se inserta en el genoma de las células
hospedadoras, quedando como episoma.
Debido a la respuesta del sistema inmunológico contra el vector y las
células infectadas, la expresión del transgén suele ser transitoria.
Vectores AAV (virus asociados a adenovirus)
ITR
Rep
Cap
ITR
AAV
El genoma está formado por 4,7 kb de DNA lineal. Para su replicación
precisa la colaboración de otro virus (adenovirus o herpesvirus). Las
secuencias ITR son necesarias para la replicación, el empaquetamiento
y la integración en un sitio específico del cromosoma 19. Los genes Rep
y Cap determinan proteínas implicadas en la replicación y de la cápside.
ITR
Promot
cDNA
ITR
Vector AAV
Los vectores AAV sustituyen las secuencias Rep y Cap por el cDNA del
gen terapéutico con un promotor y secuencias de poliadenilación.
Mantienen las ITR. Se mantienen en la célula como episomas (al carecer
de función Rep no se integra en el cromosoma 19). La expresión puede
ser persistente . Pueden empaquetar hasta 4,5 kb de inserto.
Vectores AAV (virus asociados a adenovirus)
Hay al menos12 serotipos diferentes (AAV1-AAV12). El más utilizado es
el AAV2. Sin embargo, cápsides de diferentes serotipos muestran distintos
reconocimientos celulares. Por ello, se emplean vectores pseudotipos,
que tienen secuencias ITR de AAV2 y la cápside de otro serotipo.
Vectores empleados en los ensayos clínicos
Las estrategias más empleadas de transferencia génica en los ensayos
clínicos han sido los adenovirus, los retrovirus y el DNA desnudo.
Ensayos clínicos de terapia génica
Los ensayos clínicos se realizaban inicialmente para el tratamiento de
enfermedades monogénicas raras, pero actualmente la mayoría de los
ensayos están encaminados al tratamiento de diferentes tipos de
cánceres.
El primer éxito de la terapia génica: XSCID
Los afectados de la inmunodeficiencia severa combinada ligada al X
(XSCID o SCID-X1) son niños burbuja que carecen de la función de la
subunidad gamma del receptor de interleucina 2 (IL2-RG o c). Por ello,
carecen de linfocitos T, B, NK (natural killer) y otras células de defensa.
Terapia génica empleada: introducción ex-vivo del cDNA que codifica
la subunidad gamma con un vector retroviral (MFG(B2)‐γC) en células
madre/progenitoras hematopoyéticas (HSPC) de la médula ósea de los
pacientes y reintroducción de las células transfectadas sin
quimioablación previa de las células de la médula ósea.
Terapia génica para la XSCID
Empaquetamiento
del vector con el
gen terapéutico en
la cápside retroviral
en una línea celular
de ratón.
Terapia génica para la XSCID
PMBC: células mononucleadas
de sangre periférica
CD3: linfocitos B
CD19: linfocitos T
CD14: monocitos
CD15: granulocitos
CD56: células NK
CD34: células de la médula ósea
PCR semicuantitativa para detectar la
expresión del transgén en diferentes
tipos celulares de los dos pacientes.
Terapia génica para la XSCID
Abundancia de los diferentes tipos de linfocitos en los dos
pacientes. Conteos de linfocitos T (CD3, CD8 y CD4), linfocitos
B (CD19) y células NK (CD16, CD56).
Ambos pacientes dejaron el aislamiento protector entre los
días 90 y 95 después de la terapia. En el momento de la
publicación, llevaban alrededor de un año viviendo en casa.
Terapia génica para la XSCID
De los 2 pacientes iniciales llevan el ensayo a un total de 10 pacientes.
Terapia génica para la XSCID
A) Los pacientes P4 y P5 mostraron una proliferación de linfocitos T
muy rápida después de la terapia génica. B) Estos niños desarrollaron
proliferación clonal incontrolada de linfocitos T a los 30 y 34 meses
después de la terapia génica.
Terapia génica para la XSCID
Activación aberrante del protooncogén LMO2 que codifica un regulador
central de la hematopoyesis.
Las células que tienen esta activación proliferan más rápidamente y
causan leucemia.
Terapia génica para la XSCID
Seguimiento, tras al menos 9 años después de iniciarse la terapia, de
los pacientes tratados en los artículos anteriores.
De los pacientes tratados 8 mostraron corrección inicial de la
enfermedad. Uno de ellos dio resultado negativo y recibió trasplante
de médula ósea (P3). Cuatro de los pacientes desarrollaron leucemia
(P4, P5, P7 y P10) de los cuales uno falleció (P4).
Siete pacientes, incluyendo los tres que sobrevivieron a la leucemia,
han reconstituido su sistema inmune. Tres de éstos requirieron terapia
de reemplazo de inmunoglobulina (P6, P7 y P10).
Terapia génica para la ADA-SCID
La inmunodeficiencia severa combinada por deficiencia de la enzima
desaminasa de adenosina produce un fallo en el desarrollo y función
de los linfocitos, así como otras anomalías físicas.
Se ha utilizado terapia de reemplazo con PEG conjugado a ADA.
La terapia génica se realiza sobre dos pacientes sin posibilidad de
trasplante de médula ósea ni terapia de reemplazo.
La terapia consiste en la introducción de un transgén ADA mediante
un vector retroviral en células madre hematopoyéticas (HSC) y
reintroducción en el paciente tras acondicionamiento no mieloablativo.
Terapia génica para la ADA-SCID
Vector empleado en el
ensayo.
Terapia génica para la ADA-SCID
Neutrófilos
y
Plaquetas
Linfocitos
Linfocitos T,
Linfocitos NK
y
Linfocitos B
Reconstitución de la hematopoyesis y
de linfocitos tras la terapia génica.
Terapia génica para la ADA-SCID
Linfocitos T
Granulocitos
HST
Linfocitos NK
Linfocitos T
HST
Linfocitos B
Paciente 1
Linfocitos B
Linfocitos NK
Granulocitos
Determinación de células con el vector mediante RT-PCR.
Paciente 2
Terapia génica para la ADA-SCID
Glóbulos rojos
Linfocitos
Actividad ADA
Terapia génica para la ADA-SCID
Amplían el estudio anterior a diez niños. Todos ellos están vivos tras
un seguimiento desde 1,8 a 8 años, según los individuos.
Nueve pacientes reconstituyeron un sistema inmune activo y protección
activa contra infecciones, uno de éstos (paciente 2) tuvo que recibir
tratamiento de reemplazo enzimático con PEG-ADA a 4,5 años del inicio
de la terapia génica.
El paciente 8 presentó episodios recurrentes de anemia hemolítica y
trombocitopenia autoinmunes. Tuvo que ser tratado y no se pudo evaluar.
Terapia
génica
para la
ADA-SCID
Persistencia de las
células transducidas,
de la actividad ADA
y los metabolitos de
la purina en la
sangre periférica
Terapia génica para la MLD
La leucodistrofia metacromática es una enfermedad neurodegenerativa
mortal por la carencia de función del gen ARSA, que codifica la enzima
lisosomal arilsulfatasa B, implicada en el metabolismo de los
esfingolípidos. No existe tratamiento farmacológico para la enfermedad.
Tratamientos posibles de la enfermedad son el trasplante de células
madre de la hematopoyesis (HSC) y la terapia génica de HSC del
paciente. La progenie de estas células migra a los tejidos afectados.
Terapia génica para la MLD
Presencia del vector en células de la médula ósea y de sangre periférica.
Terapia génica para la MLD
Actividad de la enzima en granulocitos (CD15), monocitos (CD14) y
en el líquido cefalorraquídeo (CNF).
Terapia génica para la MLD
Medida de la
función motora
Velocidad
de
conducción
nerviosa
La terapia génica
proporciona un
evidente beneficio
terapéutico a los
pacientes.
Desmielinización severa
asociada a atrofia cerebral
Terapia génica para la MLD
Porcentaje de lecturas
de secuencia para cada
inserción independiente.
No hay ningún clon que
esté sobrerrepresentado
(no hay leucemia).
Terapia génica para la MLD
Dra. Biffi
Los afectados por este síndrome a los 30 meses van en silla de ruedas,
son incapaces de aguantar la cabeza y no pueden hablar.
Los niños tratados en este ensayo pueden ponerse en pie, y andar y
correr sin ayuda. Presentan un coeficiente intelectual, lenguaje y
habilidades cognitivas normales.
Terapia génica para enfermedades de la retina
Utilización de un vector AAV para mediar la transferencia génica.
Estos vectores son muy empleados en la terapia génica de
enfermedades retinianas.
Terapia génica para enfermedades de la retina
Inyección del vector en el área de la retina.
Terapia génica para la LCA2
La amaurosis congénita de Leber de tipo 2 (LCA2) causa ceguera por
mutaciones en el gen RPE65, que codifica una enzima crítica del ciclo
de los retinoides, no produciéndose 11-cis-retinal, el cromóforo de los
conos y los bastones. Finalmente, hay degeneración de la retina y
ceguera sobre los 30-40 años.
Tratamiento mediante inyección subretinal de un vector AAV que
expresa el gen RPE65 (AAV2-hRPE65v2) en el peor de los ojos a dosis
baja (1,5x1010 genomas del vector), media (4,8x1010 genomas del
vector) y elevada (1,5x1011 genomas del vector).
Terapia génica para la LCA2
Datos de los 12 pacientes incluidos en el tratamiento
Terapia génica para la LCA2
Se produce incremento de la agudeza visual en los tres pacientes que
han recibido dosis baja (NP01, NP02 y NP03), tres que han recibido
dosis media (NP04, CH10 y CH11) y uno al que se le ha administrado
la dosis elevada (NP15). Hay disminución en un paciente (CH06). No
hay variaciones significativas en el resto.
Terapia génica para la LCA2
9
24
10
8
35
20
44
Diferencias en sensibilidad entre el ojo inyectado y el ojo no inyectado.
La mejora en la sensibilidad es particularmente notable en los pacientes
más jóvenes.
Terapia
Génica
para la
LCA2
A) Mejora de los
reflejos de la
pupila en
respuesta
a la luz.
B) Correlación de
la mejora en la
sensibilidad a
la luz y la edad
del paciente.
Terapia génica para la LCA2
Terapia génica para la LCA2
Tres pacientes del estudio anterior (NP01, CH11 y CH12) participan en
un ensayo para establecer posibles mejoras tras una inyección con la
dosis máxima (1,5x1011 genomas del vector) en el ojo no intervenido en
el primer ensayo.
Terapia génica para la LCA2
Características de los pacientes y detalles de la intervención.
Terapia génica para la LCA2
Sensibilidad a la luz blanca (blanco y negro), Pupilometría. Amplitud de
al rojo y a la luz azul (visión cromática).
la constricción de la
pupila tras iluminación.