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Artículos de revisión
Las enfermedades raras y la
esperanzadora solución con terapia génica
Dra. Gloria González Aseguinolaza
Directora del Programa de Terapia Génica y Regulación de la Expresión Génica.
Centro de Investigación Médica Aplicada. Universidad de Navarra. Pamplona
¿Qué es la terapia génica?
La terapia génica, como ya podemos intuir por el
nombre, la componen todos aquellos tratamientos
que utilizan como fármaco el material genético1,2.
Este material genético puede ser tanto moléculas
de ADN como de ARN (ácidos nucleicos) con diferentes funciones, como la expresión de proteínas,
la regulación de la expresión de genes o la corrección del material genético. La transferencia del material genético a la célula debe lograr un efecto
biológico, siempre con una finalidad terapéutica
(figura 1).
¿Qué aplicaciones tiene la terapia
génica?
Figura 1. Esquema de la transferencia del material
genético a la célula
La terapia génica se puede aplicar tanto a enfermedades de origen hereditario como a enfermedades adquiridas como el cáncer, enfermedades infecciosas o
enfermedades neurodegenerativas como el Parkinson o el Alzheimer1,2. La aplicación de la terapia génica en
las enfermedades genéticas es la más intuitiva, especialmente para el tratamiento de aquellas causadas por
la afectación de un único gen o monogénicas. Dentro de las enfermedades monogénicas susceptibles de ser
tratadas con terapia génica nos encontramos un gran número de las denominadas enfermedades raras o
minoritarias, las cuales afectan a un número muy pequeño de pacientes a escala mundial y en la mayoría de
los casos carecen de un tratamiento adecuado, además de ser incurables3. La terapia génica podría ser la
solución para muchas de estas enfermedades. El primer ensayo clínico de terapia génica, realizado en los
años noventa del siglo xx, tuvo como objetivo el tratamiento de una enfermedad monogénica rara debida a la
deficiencia de la enzima adenosina deaminasa (ADA), la cual provoca una inmunodeficiencia combinada
grave (SCID). En este ensayo pionero, linfocitos T extraídos del paciente se transformaron con el gen ADA en
su versión correcta y se volvieron a introducir en el paciente, obteniéndose un beneficio transitorio que sin
embargo supuso un paso de gigante para la terapia génica, ya que se había logrado llegar al paciente4.
¿Cómo se realiza?
El paso clave para el correcto funcionamiento de la terapia génica es introducir el material genético en el
interior de la célula diana y en la mayoría de los casos llegar hasta su núcleo, donde se encuentra la maquinaria necesaria para que el fármaco, el ácido nucleico, resulte activo. Para entrar en la célula y en su núcleo
Dirección para correspondencia:
Gloria González Aseguinolaza. Centro de Investigación Médica Aplicada. Universidad de Navarra. Av. Pío
XII, 55. 31008 Pamplona
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es necesario atravesar las respectivas membranas que los envuelven. Ambas están compuestas por lípidos
y proteínas y tienen un carácter altamente hidrofóbico. Los ácidos nucleicos son moléculas cargadas negativamente, lo cual hace difícil su paso a través de la membrana. Si bien es cierto que el ADN o el ARN «desnudos» pueden lograr atravesar estas barreras y ejercer su efecto, su eficacia es muy baja y por ello es necesaria la utilización de vehículos que actúen como transportadores del material genético al interior de la
célula.
Existen dos grandes familias de vehículos, también denominados vectores: los vectores virales
y los no virales. Los vectores virales aprovechan
la capacidad natural de los virus para introducir
su material genético en el interior de la célula y
producir sus propias proteínas. Para generar un
vector viral de terapia génica, normalmente se
eliminan del genoma viral aquellos genes necesarios para su replicación y los responsables de
su patogenicidad y se sustituyen por el material
genético que queremos transportar (figura 2).
Decimos normalmente, porque para algunas
aplicaciones es interesante mantener la capacidad replicativa del virus, como en el caso de los
virus oncolíticos, con capacidad de matar células tumorales. Los vectores no virales tratan de
imitar las características de los virales en ausen- Figura 2. Esquema de generación de un vector viral
cia de los potenciales efectos patogénicos de
estos últimos. En su mayoría están compuestos
por partículas poliméricas o lipídicas que empaquetan el material genético en su interior y lo protegen en su
paso al interior de la célula. A los vectores no virales se les presupone un mejor perfil de seguridad que a los
virales; sin embargo, su eficacia en cuanto a capacidad de transporte del material genético es menor. La
utilización de un tipo de vectores u otro dependerá de la aplicación1,2.
¿Cuáles son los vectores más utilizados en la terapia génica de enfermedades
raras?
El tratamiento de una deficiencia genética requiere, por un lado, una alta eficiencia de transferencia del
material génico a la célula y, por otro, que la expresión del gen terapéutico se mantenga, idealmente, durante toda la vida del paciente. En la actualidad los vehículos de transferencia génica que mejor cumplen ambas
características se encuentran dentro del grupo de los vectores virales. Más concretamente, los vectores virales capaces de modificar de forma estable las células están basados en retrovirus, adenovirus y virus adenoasociados.
El genoma de los retrovirus está compuesto por una molécula de ARN de cadena sencilla de unas 10 kb;
estos vectores portan una transcriptasa reversa, encargada de producir, utilizando como molde el ARN viral,
una molécula de ADN que se integra en el genoma de la célula. De esta forma los retrovirus modifican de
forma estable el genoma celular; es decir, que permanecen toda la vida de la célula y además pasan de la
célula madre a la célula hija. Los retrovirus contienen en su genoma tres genes y las secuencias necesarias
para su empaquetamiento en la cápside viral, para activar la transcripción y para integrarse. Para la construcción de un genoma recombinante se eliminan los tres genes virales y en su lugar se introduce el material
genético portador del gen terapéutico y las secuencias reguladoras necesarias para su expresión. Los retrovirus poseen una capacidad de clonaje de alrededor de 10 kb. Los retrovirus más utilizados actualmente, por
mostrar un mejor perfil de seguridad y tener capacidad de transferir el material genético tanto a células en
división como quiescentes (no en división), son los lentivirus, derivados del VIH. Los vectores virales basados
en retrovirus no son muy eficaces tras ser administrados de forma sistémica pero sí para la modificación de
células en división en una placa de cultivo. Por esta razón, los vectores retrovirales se emplean principalmente para la modificación ex vivo. Es decir, se extraen las células del paciente, se modifican con el vector retroviral en una placa de cultivo, se seleccionan las células correctamente modificadas, se amplifican y se reintroducen en el paciente. Esta terapia génica se denomina terapia génica ex vivo, en contraposición a la terapia génica in vivo, en la cual se administra el vector viral directamente al individuo (figura 3). El principal
inconveniente de los primeros retrovirus utilizados en terapia génica se deriva de la potencial activación de
genes oncogénicos debida a su integración en el cromosoma. Sin embargo, los últimos avances técnicos en
este campo han permitido obtener vectores más seguros, que a pesar de integrarse presentan un menor
riesgo de mutagénesis insercional5.
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Los adenovirus son virus más complejos, portadores de un genoma de ADN de doble cadena
de 35 kpb. Los primeros virus recombinantes
basados en adenovirus que se han venido utilizando carecen de genes implicados principalmente en su replicación pero mantienen una
gran parte del genoma, lo cual hace que produzcan una reacción inflamatoria e inmune significativa y sean eliminados del organismo en
un tiempo relativamente corto. Estos vectores se
han mostrado eficaces para el desarrollo de vacunas o tratamientos antitumorales, pero no
para el tratamiento de enfermedades monogénicas. Sin embargo, recientemente se han desarrollado vectores adenovirales en los cuales se
han eliminado todos los genes virales manteniendo únicamente las secuencias necesarias
para su empaquetamiento. Estos nuevos adenovirus, denominados adenovirus de alta capa- Figura 3. Terapia génica in vivo frente a terapia génica ex vivo
cidad, pueden modificar de forma muy eficiente algunos tipos celulares como los hepatocitos
y permiten la expresión estable de la proteína recombinante durante largo tiempo, además de presentar una
muy alta capacidad de clonaje, pudiendo portar más de un casete de expresión. Sin embargo, existen dificultades en cuanto a su producción a gran escala y en grado clínico6.
Hoy en día los vectores virales con mayor proyección en el tratamiento de las enfermedades raras monogénicas son los virus adenoasociados (AAV). Estos virus, pertenecientes a la familia de los parvovirus, contienen
un genoma de ADN de cadena sencilla con únicamente dos genes, Rep y Cap, que pueden eliminarse para
ser sustituidos por la construcción recombinante terapéutica. Únicamente son necesarias las secuencias
implicadas en el empaquetamiento del genoma, dos secuencias de 150 bases presentes en los extremos del
genoma. Los AAV son virus no patogénicos y defectivos; en replicación, de forma natural requieren la coinfección por otros virus como los adenovirus para completar su ciclo. Son además virus que prácticamente
no producen reacciones inflamatorias ni respuestas inmunes, lo cual permite una expresión sostenida y
prolongada del transgén. Otra ventaja de estos virus es la existencia de al menos 12 serotipos distintos, los
cuales presentan pequeñas variaciones en las proteínas que componen la cápside y que condicionan su
entrada en diferentes tipos celulares. De esta forma podemos utilizar un serotipo distinto dependiendo del
tejido o tipo celular que queramos modificar. Los AAV son los vectores más utilizados actualmente para el
tratamiento de enfermedades monogénicas y han mostrado un excelente perfil de seguridad. La principal
limitación de estos vectores es su baja capacidad de clonaje, 4,5-5 kb, que en muchos casos se ha resuelto
sintetizando versiones reducidas del gen1,2.
¿Cuáles son las diferentes estrategias que se aplican al tratamiento genético
de las enfermedades raras? Actualidad y futuro
La estrategia terapéutica para las enfermedades raras con un mayor potencial, particularmente en aquellas
debidas a la deficiencia de un único gen, es la basada en la complementación génica, es decir, la introducción en la célula del gen deficitario (o su sustitución en caso de ser defectuoso) responsable de la enfermedad (figura 4). Son muy numerosos los estudios realizados en distintos modelos animales donde se demuestra la eficacia de esta terapia. La complementación génica se puede realizar ex vivo, modificando las células
del paciente con lentivirus y volviéndolas a reintroducir en el enfermo, o in vivo, mediante la administración
de virus recombinantes como los virus adenoasociados. Como ya adelantábamos anteriormente, el primer
ensayo de terapia génica se realizó en pacientes con inmunodeficiencia severa debida a la ausencia de la
proteína ADA, utilizando linfocitos del paciente modificados con un retrovirus y logrando un efecto transitorio.
Este efecto transitorio fue debido a la corta vida media de las células elegidas4. La solución a este problema
se encontró en la utilización de células madre de la médula ósea como células diana de la modificación
genética. Estas células se multiplican indefinidamente y dan lugar a los diferentes tipos celulares de la sangre,
por lo que una vez que el genoma del retrovirus se integra en ellas toda su progenie portará el gen terapéutico. Esta estrategia cuenta ya con importantes éxitos, como la curación de los niños con inmunodeficiencias
severas de distinto origen, o los niños con adrenoleucodistrofia7,8.
En cuanto a la administración sistémica de vectores virales, los avances más importantes se han logrado
utilizando virus adenoasociados. Son impactantes los resultados alcanzados en el tratamiento de cegueras
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Figura 4. Diferentes
estrategias para el
tratamiento genético
de las enfermedades raras
congénitas, donde varios pacientes han experimentado una clara mejoría en la visión9; o el tratamiento de la
hemofilia B, donde pacientes con una patología muy severa han pasado a presentar un grado de la enfermedad muy moderado10. Son muchos los ensayos clínicos en marcha para el tratamiento de diferentes enfermedades raras con AAV, como la enfermedad de Sanfilippo, la porfiria aguda intermitente, la enfermedad de
Canavan y un largo etcétera.
En algunas enfermedades hereditarias el problema reside en la alteración de uno de los fragmentos o exones
codificantes de la proteína, presentando mutaciones que introducen codones de parada tempranos e impiden
la síntesis de la proteína funcional. En estas enfermedades, una alternativa terapéutica es el uso de oligonucleótidos antisentido, que permiten evitar la inclusión del exón mutante en el ARN mensajero, con lo que se
genera una proteína más corta pero funcional. Esta estrategia, denominada exon skipping (figura 4), se está
empleando en el tratamiento de la distrofia muscular de Duchenne11.
Muchas enfermedades raras se asocian a la acumulación o producción excesiva de metabolitos tóxicos.
Asimismo, la ausencia de una proteína con actividad enzimática se asocia a la acumulación de sus sustratos,
que en algunos casos pueden ser muy tóxicos. Éste es el caso, por ejemplo, de la porfiria aguda intermitente, donde la deficiencia de la tercera enzima implicada en la ruta de síntesis del hemo, la porfobilinógeno
deaminasa (PBGD), hace que se acumulen los metabolitos neurotóxicos ácido aminolevulínico y porfobilinógeno; o la hiperoxaluria, en la cual la ausencia de la enzima L-alanina glioxilato aminotransferasa (AGT),
implicada en el metabolismo del glioxilato, provoca la acumulación de oxalato, que causa un importante daño
renal. En ambas enfermedades, y en otras con características similares, una nueva estrategia que se está
testando es la administración de moléculas de ARN de interferencia (que pueden eliminar de forma específica un determinado ARN mensajero) dirigidas a reducir la expresión de enzimas implicadas en la producción
del sustrato de las enzimas deficitarias. Por ejemplo, en el caso de la porfiria aguda intermitente, la estrategia
es reducir la expresión de la primera enzima de la ruta de síntesis del hemo, de manera que la concentración
de los metabolitos tóxicos disminuya12.
Por último, la estrategia que actualmente se contempla como un verdadero desafío es la corrección o edición
génica, que se basa en introducir, en el genoma de la célula, el gen correcto o bien corregir la mutación que
provoca la enfermedad. Este método utiliza nucleasas «a medida» capaces de editar el ADN en secuencias
muy específicas. Existen tres tipos distintos: las nucleasas «dedos de zinc» (Zn-finger nucleases), las TALEN
y las basadas en el complejo bacteriano CRISPR-Cas913. Estos complejos tienen la capacidad de unirse a un
lugar específico del ADN celular. Tras la unión, la nucleasa realiza cortes precisos en las dos cadenas del
ADN, que activan la maquinaria de reparación de la célula; y en presencia de un ADN con secuencias que
permiten la recombinación homóloga, en lugar de simplemente reparar el corte, la nucleasa integra, en el
lugar de la sección, la secuencia de ADN correcta. Esta estrategia nos permite alterar el ADN genómico de
la célula integrando la secuencia terapéutica (figura 4).
¿Cuáles son las barreras a las que se enfrenta su desarrollo?
Los mayores problemas con los que se enfrenta la terapia génica son los efectos secundarios adversos observados en algunos de los ensayos clínicos. Éste es el caso de la muerte de un paciente con deficiencia de
la enzima ornitintranscarbamilasa tras la administración de un adenovirus14, el desarrollo de algunos casos
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de leucemia en niños con inmunodeficiencias severas tras ser tratados con células madre modificadas con
un retrovirus15, o el desarrollo de una hepatitis moderada en pacientes con hemofilia tratados con AAV16. Sin
embargo, estos datos han ayudado a la búsqueda de estrategias para evitar posibles complicaciones, como
el desarrollo de vectores más seguros y la limitación de la respuesta inflamatoria o inmune5.
Por otro lado, el cuello de botella para la realización de ensayos clínicos de terapia génica se encuentra principalmente en la producción de los vectores virales a gran escala y en grado clínico. Como ya comentábamos,
son numerosos los ensayos en animales que han mostrado sin lugar a dudas la eficacia terapéutica de la terapia génica. Sin embargo, pasar de un ratón a un humano supone multiplicar por 1.000 la cantidad de vector
necesaria para el tratamiento. Este punto continúa siendo un verdadero desafío en el tratamiento de patologías
en las cuales el órgano afectado es relativamente grande o es necesario corregir muchas células del individuo.
El trabajo de diferentes grupos de expertos en esta dirección irá ofreciendo soluciones a estos problemas.
Futuro de la terapia génica en el tratamiento de las enfermedades raras
La mayoría de las enfermedades raras carecen hoy por hoy de una alternativa terapéutica satisfactoria. Muchas de estas enfermedades afectan a niños que bien no sobreviven a la enfermedad o lo hacen con graves
secuelas. Los importantes avances logrados en los últimos tiempos en cuanto a desarrollo tecnológico de los
vectores y el conocimiento de los mecanismos moleculares implicados en el desarrollo de la enfermedad
invitan al optimismo y nos permiten aventurar que en los próximos años la terapia génica podría convertirse
en el tratamiento de cabecera para estas enfermedades. De hecho, el primer tratamiento de terapia génica
ya ha llegado al mercado en el mundo occidental. El fármaco es un virus adenoasociado para el tratamiento
de una enfermedad rara, la deficiencia en lipoproteína lipasa, que será inicialmente administrado en pacientes con pancreatitis recurrentes17. Esperemos que este sólo sea el primero de una larga lista de nuevos tratamientos para enfermedades raras basados en la transferencia génica.
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