Download Bacterial CNS Flow Chip Kit (HS24)

Bacterial CNS Flow Chip
Kit
(HS24)
Detección de bacterias causantes de
meningitis/encefalitis en humanos
mediante PCR múltiple e hibridación
reversa
para hybriSpot 24 (HS24)
MAD-003935M-HS24-24
24 tests
Para Uso Diagnóstico In Vitro
Según Directiva 98/79/CE y Norma ISO 18113-2.
Máster Diagnóstica S.L.
Avda. Conocimiento, 100. P.T. Ciencias de la Salud. 18016. Granada (España).
Tel: +34 958 271 449. [email protected]; www.masterdiagnostica.com
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Contenidos
1
USO PREVISTO .................................................................................................................................................. 3
2
PRINCIPIO DEL MÉTODO ................................................................................................................................... 3
3
COMPONENTES ................................................................................................................................................ 4
4
3.1
Reactivos para PCR múltiple ............................................................................................................................ 4
3.2
Reactivos para la hibridación reversa.............................................................................................................. 4
MATERIAL ADICIONAL REQUERIDO NO SUMINISTRADO .................................................................................. 5
4.1
Reactivos y Materiales..................................................................................................................................... 5
4.2
Equipamiento .................................................................................................................................................. 5
5
CONDICIONES DE ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD ..................................................................................... 5
6
ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES ..................................................................................................................... 5
7
PREPARACIÓN DE LA MUESTRA ........................................................................................................................ 6
7.1 Toma de muestras .................................................................................................................................................. 6
7.2 Extracción de ácidos nucleicos desde el LCR .......................................................................................................... 6
8
PROCEDIMIENTO DE ANÁLISIS .......................................................................................................................... 7
8.1
Reacción de amplificación por PCR múltiple ................................................................................................... 7
8.2
Preparación de los reactivos de hibridación ................................................................................................... 8
8.3
Hibridación reversa por flow-through ............................................................................................................. 8
9
PROCEDIMIENTO DE CONTROL DE CALIDAD ..................................................................................................... 9
10
INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS ..................................................................................................................10
11
CARACTERÍSTICAS DEL FUNCIONAMIENTO ......................................................................................................11
11.1
Repetitividad ................................................................................................................................................. 11
11.2
Reproducibilidad ........................................................................................................................................... 12
11.3
Especificidad analítica ................................................................................................................................... 12
11.4
Sensibilidad analítica ..................................................................................................................................... 13
11.5
Sensibilidad clínica......................................................................................................................................... 13
11.6
Funcionamiento analítico en hybriSpot 24 ................................................................................................... 14
12
LIMITACIONES .................................................................................................................................................15
13
PROBLEMAS Y SOLUCIONES.............................................................................................................................15
14
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................................................................................16
15
SÍMBOLOS DE LA ETIQUETA .............................................................................................................................16
16
GLOSARIO ........................................................................................................................................................17
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1 USO PREVISTO
Bacterial CNS Flow Chip es un kit de diagnóstico in vitro de bacterias y hongos causantes de meningitis y
encefalitis en humanos. Los métodos que se usan actualmente para su diagnóstico son muy laboriosos y
no siempre muestran una especificidad del 100%. El sistema Bacterial CNS Flow Chip permite la detección
simultánea de nueve especies bacterianas (Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae,
Streptococcus agalactiae, Listeria monocytogenes, Haemophilus influenzae, Mycobacterium tuberculosis
complex, Treponema pallidum, Coxiella burnetti, y Borrelia burgdorferi) y un hongo (Cryptococcus
neoformans) mediante la amplificación del ADN bacteriano por PCR múltiple y posterior hibridación
reversa sobre una membrana que contiene sondas de ADN específicas para cada especie.
Organismo
Gen diana
Neisseria meningitidis
Haemophilus influenzae
Streptococcus pneumoniae
Streptococcus agalactiae
Listeria monocytogenes
Cryptococcus neoformans
Treponema pallidum
Mycobacterium tuberculosis complex
Coxiella burnetti
Borrelia burgdorferi
ctrA
gyrB
ply
cfb
hly
18S
PolA
IS6110
trans
osp
Tabla 1: Genes usados en la amplificación de las bacterias y hongos.
Estado microbiológico: Producto no estéril.
2 PRINCIPIO DEL MÉTODO
Bacterial CNS Flow Chip se basa en una metodología que consiste en la amplificación simultánea de 9
bacterias y un hongo por PCR múltiple, seguido de hibridación en membranas de nylon con sondas de ADN
específicas mediante la tecnología ADN-Flow. La plataforma de hibridación automática hybriSpot 24,
basada en la tecnología ADN-Flow, permite una unión muy rápida entre el producto de PCR y su sonda
específica en un ambiente tridimensional poroso, en contraste con la hibridación en superficie
convencional. Una vez producida la unión entre los amplicones específicos y sus sondas correspondientes,
la señal se visualiza mediante una reacción inmunoenzimática colorimétrica con Estreptavidina-Fosfatasa y
un cromógeno (NBT-BCIP), que genera precipitados insolubles en la membrana en aquellas posiciones en
las que se ha producido la hibridación. Esta señal es capturada y analizada de forma automática mediante
el software hybriSoft.
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3 COMPONENTES
El kit proporciona todos los reactivos necesarios para la amplificación por PCR múltiple y posterior
hibridación de 24 muestras clínicas.
3.1
Reactivos para PCR múltiple
-
24 tests (MAD-003935M-P-HS24-24):
Nombre
Formato
Referencia
Bacterial CNS PCR Mix
Hot Start DNA Polymerase
Uracil-DNA Glycosylase
1 vial x 1200 µl
1 vial x 15 µl
1 vial x 28 µl
MAD-003935M-MIX-HS24
MAD-POL-3
MAD-UNG-3
Tabla 2: Reactivos suministrados para realizar la PCR múltiple.
Bacterial CNS PCR mix contiene tampón de PCR, MgCl2, dNTPs (U/T), agua libre de ADNsas/RNAsas y
cebadores biotinilados. Los cebadores incluidos son específicos para la amplificación de nueve especies de
bacterias (Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus agalactiae, Listeria
monocytogenes, Haemophilus influenzae, Mycobacterium tuberculosis complex, Treponema pallidum,
Coxiella burnetti, y Borrelia burgdorferi) y el hongo Cryptococcus neoformans. Además incluye cebadores
para la amplificación de un fragmento de ADN genómico humano (beta-globina como control interno) y
cebadores y ADN de control exógeno sintético de amplificación.
3.2
Reactivos para la hibridación reversa
-
24 tests (MAD-003935M-H-HS24-24):
Nombre
Formato
Referencia
Hybridization Solution (Reagent A)
Blocking Solution (Reagent B)
Streptavidin-Alkaline Phosphatase (Reagent C)
Washing Buffer I (Reagent D)
Substrate (Reagent E1)
Chromogen (Reagent E2)
Reagent E
Washing Buffer II (Reagent F)
Bacterial CNS Chip
60 ml
10 ml
10 ml
35 ml
14 ml
14 ml
-18 ml
1X 24 units
MAD-003930MA-HS24-24
MAD-003930MB-HS24-24
MAD-003930MC-HS24-24
MAD-003930MD-HS24-24
MAD-003930ME1-HS24-24
MAD-003930ME2-HS24-24
MAD-003930ME-HS24
MAD-003930MF-HS24-24
MAD-003935M-CH-HS-24
Tabla 3: Reactivos suministrados para realizar la hibridación.
IMPORTANTE: Todos los reactivos son suministrados “listos para uso”, excepto reactivos E-1 y E-2, los cuales deben
ser mezclados en proporción 1: 1 justo antes de su uso en el vial vacío proporcionado para tal fin y etiquetado como
“Reagent E”.
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4 MATERIAL ADICIONAL REQUERIDO NO SUMINISTRADO
4.1
Reactivos y Materiales
•
•
•
•
•
•
4.2
Reactivos para purificar ADN bacteriano de líquido cefalorraquídeo (LCR)
Guantes desechables
Tubos Eppendorf 0.5 ml
PCR Encoded Plates with Flat Cap Strips and Adhesive Film, Ref: MAD-003900P-HS24
HS24 PCR Tube Strips and Flat Cap Strips, Ref: MAD-003900ST-HS24
Puntas de pipeta con filtro libres de ADNsa/RNasa
Equipamiento
•
•
•
•
•
•
•
Microcentrifuga
Micropipetas automaticas: P1000, P200, P20 y P2
Termociclador
Baño termostatizado o bloque térmico.
Bloque hielo o placa de frío (4º C).
Equipo automatizado para hibridación hybriSpot 24
HybriSoft Software
5 CONDICIONES DE ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD
Reactivos de PCR: Envío entre 2 y 8 °C*. Una vez recibido se debe conservar almacenado a -20 °C, siendo
estable hasta la fecha de caducidad especificada. Descongelar en hielo justo antes de usar. Los reactivos
de PCR deben ser conservados en zonas libres de contaminación por ADN o productos de PCR. Evitar ciclos
múltiples de congelación y descongelación.
Reactivos de hibridación. Envío y conservación a 2-8 °C*. No congelar. Tanto los reactivos como los
Bacterial CNS CHIPs son estables hasta la fecha de caducidad especificada. La solución de revelado se debe
preparar justo antes de usar. El reactivo de hibridación (Reagent A) debe estar a 41°C antes de ser usado y
el resto de reactivos deben usarse a temperatura ambiente.
* Se incluye un indicador de temperatura con el embalaje. En caso de que la cadena de frío se rompa se recomienda contactar
con el fabricante antes de utilizar los reactivos.
6 ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES
• Lea las instrucciones de uso antes de utilizar este producto.
• Recomendaciones de seguridad:
Las precauciones de seguridad se describen en la ficha de seguridad. Este producto está destinado
únicamente para uso profesional en un laboratorio, y no como fármaco, para uso doméstico ni otros
fines. La versión actual de la ficha de seguridad de este producto se puede descargar del sitio web
www.vitro.bio o puede solicitarse a [email protected].
• Consideraciones generales para evitar la contaminación con producto de PCR:
La mayor fuente de contaminación suele ser el propio producto de PCR amplificado, por lo cual es
recomendable llevar a cabo la manipulación de los productos amplificados en una zona diferente a
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donde se realiza la reacción de PCR. Es recomendable trabajar en áreas diferenciadas de pre- y postPCR en donde se realice la manipulación del ADN problema y preparación de tubos de PCR (pre-PCR) y
la manipulación e hibridación de los productos amplificados (post-PCR). Estas áreas deben estar
separadas físicamente y debe emplearse material distinto de laboratorio (batas, pipetas, puntas, etc)
para evitar la contaminación de las muestras con el ADN amplificado, lo que podría conducir a falsos
diagnósticos positivos. El flujo de trabajo debe ir siempre en una única dirección, desde la zona de prePCR hasta la zona de post-PCR y nunca en dirección opuesta. Se debe evitar el flujo de material y
personal desde la zona post-PCR a la zona pre-PCR.
De forma adicional, para evitar contaminaciones con productos de PCR, el kit incluye la enzima
Uracil-ADN Glycosylase que degrada productos de PCR que contengan dUTP.
Se recomienda incluir controles negativos en la amplificación que contengan todos los reactivos de PCR
a excepción de la muestra de ADN.
7 PREPARACIÓN DE LA MUESTRA
7.1 Toma de muestras
Bacterial CNS Flow Chip ha sido validado con material genético purificado de líquido cefalorraquídeo (LCR).
El LCR debe recolectarse en un recipiente estéril y ser transportado a 2-8 °C, según directrices del Centro
para el control de enfermedades y prevención (CDC). Este material debe guardarse a 2-8 °C durante un
máximo de 3 días o a -70 °C para periodos mayores de tiempo, con la finalidad de presevar la viabilidad
viral.
7.2 Extracción de ácidos nucleicos desde el LCR
EL LCR debe tratarse como un posible agente infeccioso. Las recomendaciones para el manejo de este tipo
de muestras se pueden encontrar en las publicaciones de la CDC. Se deben manejar todos los materiales
contaminados con agentes biológicos y peligrosos de forma aceptable según las recomendaciones del
centro de trabajo.
Bacterial CNS Flow Chip ha sido ensayado con material genético purificado de líquido cefalorraquídeo
humano. Este kit ha sido validado con ADN de partida obtenido a partir del siguiente sistema de
extracción:
• NucliSENS® easyMag® (bioMérieux S.A.)
Nota: El sistema no ha sido validado con otros sistemas de extracción de ADN/ARN viral, por tanto no se
puede garantizar la fiabilidad de los resultados obtenidos si se emplea otro sistema diferente de
purificación.
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8 PROCEDIMIENTO DE ANÁLISIS
8.1
Reacción de amplificación por PCR múltiple
•
•
Con el fin de evitar los ciclos de congelación y descongelación se recomienda alicuotear la Mix de
PCR la primera vez que se usa:
Descongelar Bacterial CNS PCR Mix en hielo.
Mezclar bien invirtiendo varias veces el vial.
Añadir al vial de PCR mix todo el volumen de Hot Start DNA Polymerase y Uracil-DNA
Glycosylase, mezclar bien invirtiendo varias veces el vial y centrifugar unos segundos.
Alicuotear 45 µl de la nueva mezcla en PCR Encoded Plates (Ref: MAD-003900P-HS24) or the
HS24 PCR Tube Strips (Ref: MAD-003900ST-HS24) cover with the Flat Cap Strips y almacenar a
-20°C (estable durante al menos 6 meses).
Descongelar un tubo de PCR por muestra y añadir 5 µl del ADN purificado.
Nota importante: usar exclusivamente las placas o tiras de tubos suministrados por Master
Diagnóstica S.L. con referencias MAD-003900P-HS24 y MAD-003900ST-HS24.
•
Si la mezcla se prepara en el momento de su uso, mezclar de acuerdo a las siguientes
instrucciones:
Componente
Volumen por reacción
Bacterial CNS PCR mix
Hot Start DNA Polymerase
Uracil-DNA Glycosylase
ADN purificado
43.5 µl
0.5 µl
1 µl
5 µl
Tabla 4: Reactivos y volúmenes necesarios para realizar la reacción de PCR.
Nota: es muy importante que todo el proceso se lleve a cabo en hielo con el fin de evitar la
degradación de las enzimas que contiene la Mix PCR múltiple.
•
Colocar los tubos de PCR en el termociclador y programar las condiciones de amplificación que se
detallan a continuación:
1 ciclo
1 ciclo
40 ciclos
1 ciclo
25°C
94°C
94°C
50°C
72°C
72°C
8°C
10 min
3 min
30 s
30 s
30 s
5 min
∞
Tabla 5: Programa PCR Multiple.
Mantener los productos de PCR a 8-10°C cuando la reacción haya sido completada. Las muestras pueden
ser hibridadas inmediatamente o almacenarse en el área post-PCR a 8-10°C durante 1-2 días. Para
almacenar durante un periodo mayor de tiempo se recomienda a -20°C.
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8.2
Preparación de los reactivos de hibridación
Todos los reactivos son suministrados en formato “listo para uso”.
La solución de revelado de la hibridación se suministra como dos reactivos (Reactivos E1 y E2) que deben
mezclarse en proporción 1:1 justo antes de su uso en el vial “Reactivo E”, con un volumen en función del
nº de muestras a procesar (ver tabla 6). Tras cada uso es necesario limpiar el vial con agua destilada para
evitar el acúmulo de precipitados por usos sucesivos.
Las membranas son de un solo uso y se deben manejar con guantes.
8.3
Hibridación reversa por flow-through
Todo el proceso de hibridación se realiza de forma automática en hybriSpot 24 (HS24). La gestión de las
muestras, la captura de las imágenes y el análisis e informe de los resultados se realizan a través del
software hybriSoft.
Nota: Configurar el instrumento siguiendo las instrucciones del manual de usuario (proporcionadas con el instrumento).
Antes de comenzar el proceso de hibridación:
1. Desnaturalizar los productos de PCR calentando a 95 °C durante 10 min en un termociclador y
enfriar rápidamente en hielo durante al menos 2 min.
2. Preparar el Reactivo E (Reagent E) en el momento de usar, mezclando en proporción 1:1 los
componentes 1 y 2 suministrados en el kit. En la siguiente tabla se indican los volúmenes
requeridos de reactivo E1 y E2 en función del número de tests:
vol (µl)/1 tests vol (µl)/4 tests vol (µl)/8 tests vol (µl)/12 tests vol (µl)/16 tests vol (µl)/20 tests vol (µl)/24 tests
E1
E2
1200
1800
2300
3000
3800
4200
5000
1200
1800
2300
3000
3800
4200
5000
Tabla 6: Volúmenes de reactivos E1-E2 que se deben mezclar en el vial E en función del nº de test a procesar.
3. Disponer las muestras amplificadas, Bacterial CNS Chips y reactivos en el lugar designado del HS24
y seleccionar el correspondiente protocolo del instrumento para que se inicie de forma
automática el proceso.
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9 PROCEDIMIENTO DE CONTROL DE CALIDAD
Bacterial CNS Flow Chip kit contiene varios controles internos para asegurar la calidad de los resultados.
SONDA
CONTROL
B
Control hibridación
CI
Control de amplificación exógeno
BG
Control de amplificación endógeno
Tabla 7: Sondas control incluidas en Bacterial CNS Chip.
Control de hibridación: Tras el revelado de las membranas debe aparecer una señal intensa en las cinco
posiciones de control de hibridación (B) que sirve como control de calidad. Esta señal indica que los
reactivos de hibridación y revelado han funcionado correctamente. Si no aparece señal indicará que ha
habido un fallo durante el proceso de hibridación o que algún reactivo no se ha usado correctamente.
Además, esta señal permite que el software pueda orientar correctamente el panel de sondas para su
posterior análisis.
Control de amplificación exógeno (CI): Sonda para la detección del ADN sintético incluido en la mezcla de
PCR. Este ADN se co-amplificará junto con el material genético de la muestra. Las dos posiciones positivas
en el Control de amplificación exógeno (CI) indicarán que la reacción de PCR ha funcionado
correctamente.
Control de amplificación endógeno (BG): Sonda para la detección del gen de la beta-globina humana
contenido en la muestra problema, que es co-amplificado durante la PCR. Todas las muestras donde el
ADN problema se haya amplificado correctamente tendrán una señal positiva en el Control de
amplificación endógeno (BG). Esta señal es indicativa de la calidad/cantidad del ADN empleado en la
amplificación. Una señal positiva indica que la amplificación ha funcionado correctamente y que la calidad
y cantidad del ADN de partida han sido óptimas. La ausencia de señal para este control nos indica fallos
durante la amplificación, baja calidad/ cantidad del ADN utilizado en la amplificación o ausencia de ADN
humano en la muestra. Este último caso es posible cuando el líquido cefalorraquídeo no contenga células
humanas y en el análisis automático con el software hybriSoft aparece un aviso de “ausencia de ADN
humano”. Si no se observa señal para este control de amplificación endógeno, el usuario debería verificar
que el proceso de extracción del ADN de la muestra de partida se ha realizado correctamente, añadiendo
un ADN humano exógeno a la muestra de líquido cefalorraquídeo antes de la extracción (p. ej. 200-500 ng
de ADN genómico humano, en función del volumen final de elución del método).
Cuando una muestra es positiva para alguno de los virus incluidos en el kit, con resultado negativo para los
controles de amplificación exógeno y endógeno, en el informe de análisis automático de los resultados
con el software hybriSoft aparece un aviso de “ausencia de ADN genómico humano/presencia de
inhibidores de PCR” para que el usuario realice las verificaciones oportunas antes de validar el resultado.
El usuario es responsable de determinar los procedimientos de control de calidad apropiados para su
laboratorio y cumplir con la reglamentación aplicable.
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10 INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS
En el siguiente esquema se muestra la distribución de las sondas en el Bacterial CNS Chip:
“B”: control de hibridación
“CI”: Control de amplificación exógeno
“BG”: Control de amplificación endógeno (fragmento ß-Globina humana)
“X”: Sondas específicas para cada bacteria/hongo
Todas las sondas están duplicadas para garantizar la fiabilidad en el análisis automático de los resultados. El control
de hibridación (B) está repetido en 5 posiciones y permite que el software pueda orientar correctamente el panel de
sondas para su posterior análisis.
A continuación se muestra la distribución de las diferentes sondas incluidas en el Bacterial CNS Chip así
como los posibles resultados esperados.
1
2
3
4
5
6
7
8
A
B
B
B
B
MTB
C
CI
D
BG
E
NEISS AGAL TPA
PNEU HINF
COX
F
LIS
B
CRYP BOR
NEISS AGAL TPA
CI
G
LIS
H
MTB
I
B
CRYP BOR
BG
PNEU HINF
COX
Tabla 8a: Posición de las sondas incluidas en Bacterial CNS Chip.
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Sonda/Posición (columna-fila)
Resultados esperados
Organismo
B
CI
BG
Positivo Neisseria meningitidis
2C-6E
1A-1B-2I-5E-8A
1C-5F
-- / 1D-5G
Positivo Streptococcus pneumoniae
2E-6G
1A-1B-2I-5E-8A
1C-5F
-- / 1D-5G
Positivo Listeria monocytogenes
2G-6C
1A-1B-2I-5E-8A
1C-5F
-- / 1D-5G
Positivo Mycobacterium tuberculosis complex
2H-8B
1A-1B-2I-5E-8A
1C-5F
-- / 1D-5G
Positivo Streptococcus agalactiae
3C-7E
1A-1B-2I-5E-8A
1C-5F
-- / 1D-5G
Positivo Haemophilus influenzae
3E-7G
1A-1B-2I-5E-8A
1C-5F
-- / 1D-5G
Positivo Cryptococcus neoformans
3G-7C
1A-1B-2I-5E-8A
1C-5F
-- / 1D-5G
Positivo Treponema pallidum
4C-8E
1A-1B-2I-5E-8A
1C-5F
-- / 1D-5G
Positivo Coxiella burnetti
4E-8G
1A-1B-2I-5E-8A
1C-5F
-- / 1D-5G
Positivo Borrelia burgdorferi
4G-8C
1A-1B-2I-5E-8A
1C-5F
-- / 1D-5G
Negativo
--
1A-1B-2I-5E-8A
1C-5F
-- / 1D-5G
Muestra no válida (PCR inhibida)
--
1A-1B-2I-5E-8A
--
--
Muestra negativa (ausencia de ADN genómico humano)
--
1A-1B-2I-5E-8A
1C-5F
--
Error de hibridación
--
--
--
--
Tabla 8b: Posicionamiento de las sondas incluidas en Bacterial CNS Chip e interpretación de resultados.
11 CARACTERÍSTICAS DEL FUNCIONAMIENTO
11.1 Repetitividad
Se analizó la repetitividad del kit ensayando el método un mínimo de seis veces para cada bacteria/hongo
incluidos en el panel a dos concentraciones distintas. El ensayo fue realizado por un mismo operador, en
una sola localización, en el mismo día y usando el mismo lote de reactivos. La hibridación se realizó en la
plataforma hybriSpot y los resultados se analizaron con el software hybriSoft.
Organismo
Concentración (copias/reacción)
Positivos/testados
% positivos
Neisseria meningitidis
100
10
100
10
100
10
100
10
100
50
100
10
100
10
100
50
100
50
100
50
6/6
6/6
6/6
6/6
6/6
6/6
6/6
6/6
6/6
6/6
6/6
6/6
6/6
6/6
6/6
6/6
6/6
3/6
6/6
4/6
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
50%
100%
67%
Streptococcus pneumoniae
Listeria monocytogenes
Mycobacterium tuberculosis complex
Streptococcus agalactiae
Haemophilus influenzae
Cryptococcus neoformans
Treponema pallidum
Coxiella burnetti
Borrelia burgdorferi
Tabla 9: Ensayo de repetitividad para cada uno de las bacterias/hongo incluidos en el panel.
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11.2 Reproducibilidad
Se analizó la precisión del método variando dos factores que podrían contribuir a la variabilidad:
termociclador y operador. Se ensayaron por triplicado tres especies incluidas en el panel a dos
concentraciones distintas, usando dos operadores y dos termocicladores distintos. No se obtuvieron falsos
positivos. El operador 1 obtenía un mayor porcentaje de casos positivos que el operador 2.
Bacteria
GE/reacción
Neisseria meningitidis
100 copias
10 copias
Streptococcus pneumoniae
100 copias
10 copias
Haemophilus influenzae
100 copias
10 copias
Nº de termociclador
N°
Positivos/validos
014 6/6
021 6/6
014 6/6
021 6/6
014 6/6
021 6/6
014 6/6
021 6/6
014 6/6
021 5/6
014 6/6
021 5/6
%
100
100
100
100
100
100
100
100
100
83
100
83
Nº de operador
N° Positivos/validos
1
6/6
2
6/6
1
5/6
2
5/6
1
6/6
2
6/6
1
5/6
2
5/6
1
6/6
2
5/6
1
6/6
2
5/6
%
100
100
83
83
100
100
83
83
100
83
100
83
Tabla 10: Reproducibilidad de Bacterial CNS Flow Chip kit.
11.3 Especificidad analítica
No se observaron reacciones cruzadas entre los diez organismos incluidos en el test.
Organismo
Especificidad
Neisseria meningitidis
Streptococcus pneumoniae
Listeria monocytogenes
Mycobacterium tuberculosis complex
Streptococcus agalactiae
Haemophilus influenzae
Cryptococcus neoformans
Treponema pallidum
Coxiella burnetti
Borrelia burgdorferi
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
Tabla 11: Especificidad de Bacterial CNS Flow Chip.
No se observaron reacciones cruzadas con otros virus y bacterias:
Bacteria
Staphylococcus aureus
Mycobacterium abcessus
Enterococcus faecalis
Klebsiella.pneumoniae
Proteus mirabilis
Escherichia coli
Pseudomonas aeruginosa
Enterobacter cloacae
Virus
Herpes simplex-1
Herpes simplex-2
Epstein Barr virus
Cytomegalovirus
Varicella Zoster virus
Tabla 12: Especificidad de Bacterial CNS Flow Chip.
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11.4 Sensibilidad analítica
Se calculó el límite de detección para cada patógeno. La sensibilidad analítica fue realizada usando varias
diluciones de ADN genómico de cada patógeno incluido en el panel. Cada muestra se ensayó un mínimo
de 6 veces para calcular la sensibilidad, especificidad e intervalos de confianza. Los resultados se
analizaron con la plataforma hybriSpot y el software hybriSoft. Se estableció un valor de 4 como punto de
corte de positividad de la muestra.
Organismo
Neisseria meningitidis
Streptococcus
pneumoniae
Listeria monocytogenes
Mycobacterium
tuberculosis complex
Streptococcus
agalactiae
Haemophilus influenzae
Cryptococcus
neoformans
Treponema pallidum
Coxiella burnetti
Borrelia burgdorferi
GE/reacción
Positivos
detectados/positivos
totales
Sensibilidad
10 copias
10 copias
12/12
12/12
100%
100%
10 copias
10 copias
12/12
12/12
50 copias
30 copias
10 copias
10 copias
50 copias
10 copias
100 copias
100 copias
50 copias
Intervalo de
confianza
95%
Especificidad
Intervalo de
confianza
95%
(75.8%-100%)
(75.8%-100%)
100%
100%
(98%-100%)
(98%-100%)
100%
100%
(75.8%-100%)
(75.8%-100%)
100%
100%
(98%-100%)
(98%-100%)
12/12
3/6
12/12
12/12
100%
50%
100%
100%
(75.8%-100%)
(18.8%-81.3%)
(75.8%-100%)
(75.8%-100%)
100%
100%
100%
100%
(97.8%-100%)
(97.8%-100%)
(98%-100%)
(98%-100%)
12/12
3/6
12/12
12/12
8/12
100%
50%
100%
100%
67%
(75.8%-100%)
(18.8%-81.3%)
(75.8%-100%)
(75.8%-100%)
(39.1%-86.2%)
100%
100%
100%
100%
100%
(97.8%-100%)
(97.8%-100%)
(97.9%-100%)
(97.9%-100%)
(97.9%-100%)
Tabla 13: Sensibilidad Analítica (LoD): copias de ADN genómico de cada patógeno incluidos en la reacción de PCR con un resultado
positivo en el 100% de los casos, analizados con el software hybriSoft y punto de corte de positividad en un valor de 4.
11.5 Sensibilidad clínica
La sensibilidad clínica de Bacterial CNS Flow Chip kit se determinó usando LCR positivos simulados. LCR
artificiales se inocularon con diferentes concentraciones de cada patógeno. El ADN de estos LCR positivos
se extrajo usando NucliSENS® easyMAG® (bioMérieux). Los resultados se analizaron con el software
hybriSoft.
Patógeno
Sensibilidad clínica
(cfu/µl LCR)
Neisseria meningitidis
Streptococcus pneumoniae
Listeria monocytogenes
Mycobacterium tuberculosis
complex
Streptococcus agalactiae
Haemophilus influenzae
Cryptococcus neoformans
Treponema pallidum
Coxiella burnetti
Borrelia burgdorferi
1
1
1
1
1
1
nd
nd
nd
nd
Tabla 14: Sensibilidad clínica de Bacterial CNS Flow Chip. Nd: no determinado.
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11.6 Funcionamiento analítico en hybriSpot 24
Se validó el funcionamiento y robustez de Bacterial CNS Flow Chip en el equipo automático HS24
analizando concentraciones límite de ADN genómico de todos los genotipos incluidos en el panel (10
copias para N. meningitidis, L. monocytogenes, Mycobacterium tuberculosis complex, C. neoformans, S.
pneumoniae y H. influenzae, 50 copias para T. pallidum y S. agalactiae y 100 copias para B. burgdorferi y C.
burnetti). Esta validación demuestra la reproducibilidad de los resultados entre las posiciones 1 y 24 del
equipo HS24 y la reproducibilidad de los resultados con diferentes programas para distinto número de
muestras.
-
Reproducibilidad de resultados en programas para distinto número de muestras
Se realizaron réplicas de una muestra positiva que contenía una concentración límite de S. agalactiae (50
GE). Estas réplicas se situaron en diferentes posiciones de la cámara de reacción del equipo HS24 y se
evaluaron diferentes protocolos:
Protocolo para 2 muestras (2 réplicas)
Protocolo para 12 muestras (3 réplicas)
Protocolo para 15 muestras (3 réplicas)
Protocolo para 24 muestras (4 réplicas)
Los resultados fueron analizados de forma automática con hybriSoft y no se detectaron diferencias
entre las distintas posiciones de la cámara de reacción ni entre los protocolos utilizados.
-
Reproducibilidad de resultados en diferentes posiciones de hibridación en HS24
Se realizaron cuatro réplicas para cada patógeno, situadas en diferentes posiciones de las dos cámaras de
reacción del HS24 y con el protocolo para 24 muestras. Los resultados fueron analizados de forma
automática con hybriSoft, demostrando un 100% de reproducibilidad para todos los genotipos analizados
en diferentes posiciones.
Organismo
Neisseria meningitidis
Streptococcus pneumoniae
Listeria monocytogenes
Mycobacterium tuberculosis complex
Streptococcus agalactiae
Haemophilus influenzae
Cryptococcus neoformans
Treponema pallidum
Coxiella burnetti
Borrelia burgdorferi
Nº GE/ reacción
Positivos/testados
Diferencias entre
posiciones
10
10
10
10
50
10
10
50
100
100
4/4
4/4
4/4
4/4
4/4
4/4
4/4
4/4
4/4
4/4
No
No
No
No
No
No
No
No
No
No
Tabla 15: Reproducibilidad de Bacterial CNS Flow Chip kit en HS24. La positividad se analizó con hybriSoft estableciendo como
punto de corte un valor de 4.
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12 LIMITACIONES
Uso de muestras inadecuadas: el método ha sido validado con material genético purificado de LCR. El
análisis de cualquier otro tipo de muestra puede generar resultados erróneos o no concluyentes por
inhibición de la reacción de PCR por agentes químicos inhibitorios.
13 PROBLEMAS Y SOLUCIONES
Problema
Posibles causas
Soluciones
Error en el protocolo de hibridación.
Comprobar que se han añadido todos los
reactivos de hibridación correctamente.
Verificar el funcionamiento del equipo HS24.
Repetir el test.
No se observa ninguna señal/
no hay señal de hibridación
Reactivos de hibridación caducados
almancenados correctamente.
o
no
Verificar la fecha de caducidad así como el
correcto almacenamiento de los reactivos
de hibridación y Chips. Repetir el test.
Limpiar con agua destilada abundante las
cámaras de reacción. Repetir el test.
Presencia de patógeno en control negativo
Posible degradación del ADN de los Chips durante
el proceso de descontaminación de superficies y
material.
Problemas de contaminación en las zonas pre-PCR
o post-PCR.
Problemas en la amplificación por PCR.
Comprobar
que
el
programa
del
termociclador es el adecuado, que la mezcla
madre de PCR se ha preparado de forma
adecuada y que los reactivos se conservan
correctamente. Repetir el test.
Presencia de inhibidores de PCR en la muestra
problema.
Verificar el correcto funcionamiento del
sistema de extracción de ácidos nucleicos
empleado. Repetir el test.
Verificar que el sistema de extracción del
material genético empleado funciona
correctamente incluyendo un control de
extracción.
Ausencia de control exógeno de
amplificación
Ausencia de control endógeno de
amplificación
Cantidad insuficiente de ADN humado en la
muestra problema.
Presencia de inhibidores de PCR en la muestra
problema.
Mezcla de sustrato, E1 y E2, antigua, no preparada
justo antes de usar.
Precipitado de cromógeno en los Chips tras
la hibridación
Señales débiles en la hibridación
Descontaminar (lejía 1%)
trabajo y repetir el test.
las áreas de
Preparar una nueva mezcla de sustrato
mezclando los reactivos E1 y E2 (1:1) justo
antes de su uso. Repetir el test.
Vial de preparación “E” con restos procedentes de
un uso previo.
Reactivos de PCR y/o hibridación caducados o
almacenados de forma incorrecta.
Lavar bien con agua el vial “E” antes de
usarlo. Repetir el test.
Comprobar la caducidad de los reactivos, la
conservación de mezcla de PCR y reactivos,
Error en el protocolo de hibridación.
Comprobar las temperaturas y tiempos de
hibridación y verificar el funcionamiento del
equipo hybriSpot 24.
El producto de PCR no se desnaturalizó
correctamente antes de la hibridación.
Verificar que la desnaturalización se ha
realizado correctamente. Repetir el test.
Baja calidad/cantidad del ADN empleado.
Incrementar la cantidad de muestra o ADN
de
partida.
Verificar
el
correcto
funcionamiento del sistema de extracción de
ácidos nucleicos empleado.
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14 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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N Engl J Med 1993; 328:21–8.
Lavoie FW, Caucier JR. In: Marx JA, Hockberger RS,Walls RM, et al. Central nervous system infections. 6th
edition.Philadelphia: Mosby Elsevier; 2006. p. 1710–25
Durand ML, Calderwood SB, Weber DJ, et al. Acute bacterial meningitis in adults: a review of 493 episodes.
N Engl J Med 1993; 328:21–8.
Loring KE. In: Tintinalli JE, Kelen GD, Stapczynski JS. CNS infections. Emergency medicine: a comprehensive
study guide. 6th edition. New York: McGraw-Hill; 2004. p. 1431–7
Lavoie FW, Caucier JR. In: Marx JA, Hockberger RS,Walls RM, et al. Central nervous system infections. 6th
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Pickering LK, Baker CJ, Long SS, et al. Haemophilus influenzae infections. Report of the Committee on
Infectious Diseases. 27th edition. Elk Grove Village (IL): American Academy of Pediatrics; 2006. p. 310–8
Pickering LK, Baker CJ, Long SS, et al. Pneumococcal infections. 27th edition. Elk Grove Village (IL): American
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Matthijs C. Brouwer, Allan R. Tunkel and Diederik van de Beek. Epidemiology, Diagnosis, and Antimicrobial
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Wang X, Theodore MJ, Mair R, Trujillo-Lopez E, du Plessis M, Wolter N, Baughman AL, Hatcher C, Vuong J,
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Zhu H, Wang Q, Wen L, Xu J, Shao Z, Chen M, Chen M, Reeves PR, Cao B, Wang L. Development of a
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Wang Y, Guo G, Wang H, Yang X, Shao F, Yang C, Gao W, Shao Z, Zhang J, Luo J, Yang Y, Kong F, Zhu B.
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multiplex PCR-based reverse line blot (mPCR/RLB) hybridization assay in the diagnosis of bacterial
neonatal meningitis. BMC Pediatr. 2014 Sep 8;14:224
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16 GLOSARIO
CNS: sistema nervioso central
LCR: líquido cefalorraquídeo
ADN: ácido deoxirribonucleico
ARN: ácido ribonucleico
PCR: reacción en cadena de la polimerasa
HS24: hybriSpot 24
GE: equivalentes de genoma
NBT-BCIP: nitroblue tetrazolium chloride- 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate
Cod UNG: Cod Uracil-DNA Glycosylase
MgCl2: magnesium chloride
dNTPs: Deoxynucleotide triphosphates
DNases: deoxyribonuclease
RNases: ribonuclease
dUTP: Deoxyuridine Triphosphate
CDC: Centros para el control de enfermedades y prevención
Cfu: Unidades formadoras de calvas
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