Download Bacterial CNS Flow Chip Kit (HS24)
Document related concepts
no text concepts found
Transcript
Bacterial CNS Flow Chip Kit (HS24) Detección de bacterias causantes de meningitis/encefalitis en humanos mediante PCR múltiple e hibridación reversa para hybriSpot 24 (HS24) MAD-003935M-HS24-24 24 tests Para Uso Diagnóstico In Vitro Según Directiva 98/79/CE y Norma ISO 18113-2. Máster Diagnóstica S.L. Avda. Conocimiento, 100. P.T. Ciencias de la Salud. 18016. Granada (España). Tel: +34 958 271 449. [email protected]; www.masterdiagnostica.com 1/17 Rev: 12/01/2016 Contenidos 1 USO PREVISTO .................................................................................................................................................. 3 2 PRINCIPIO DEL MÉTODO ................................................................................................................................... 3 3 COMPONENTES ................................................................................................................................................ 4 4 3.1 Reactivos para PCR múltiple ............................................................................................................................ 4 3.2 Reactivos para la hibridación reversa.............................................................................................................. 4 MATERIAL ADICIONAL REQUERIDO NO SUMINISTRADO .................................................................................. 5 4.1 Reactivos y Materiales..................................................................................................................................... 5 4.2 Equipamiento .................................................................................................................................................. 5 5 CONDICIONES DE ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD ..................................................................................... 5 6 ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES ..................................................................................................................... 5 7 PREPARACIÓN DE LA MUESTRA ........................................................................................................................ 6 7.1 Toma de muestras .................................................................................................................................................. 6 7.2 Extracción de ácidos nucleicos desde el LCR .......................................................................................................... 6 8 PROCEDIMIENTO DE ANÁLISIS .......................................................................................................................... 7 8.1 Reacción de amplificación por PCR múltiple ................................................................................................... 7 8.2 Preparación de los reactivos de hibridación ................................................................................................... 8 8.3 Hibridación reversa por flow-through ............................................................................................................. 8 9 PROCEDIMIENTO DE CONTROL DE CALIDAD ..................................................................................................... 9 10 INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS ..................................................................................................................10 11 CARACTERÍSTICAS DEL FUNCIONAMIENTO ......................................................................................................11 11.1 Repetitividad ................................................................................................................................................. 11 11.2 Reproducibilidad ........................................................................................................................................... 12 11.3 Especificidad analítica ................................................................................................................................... 12 11.4 Sensibilidad analítica ..................................................................................................................................... 13 11.5 Sensibilidad clínica......................................................................................................................................... 13 11.6 Funcionamiento analítico en hybriSpot 24 ................................................................................................... 14 12 LIMITACIONES .................................................................................................................................................15 13 PROBLEMAS Y SOLUCIONES.............................................................................................................................15 14 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................................................................................16 15 SÍMBOLOS DE LA ETIQUETA .............................................................................................................................16 16 GLOSARIO ........................................................................................................................................................17 Máster Diagnóstica S.L. Avda. Conocimiento, 100. P.T. Ciencias de la Salud. 18016. Granada (España). Tel: +34 958 271 449. [email protected]; www.masterdiagnostica.com 2/17 Rev: 12/01/2016 1 USO PREVISTO Bacterial CNS Flow Chip es un kit de diagnóstico in vitro de bacterias y hongos causantes de meningitis y encefalitis en humanos. Los métodos que se usan actualmente para su diagnóstico son muy laboriosos y no siempre muestran una especificidad del 100%. El sistema Bacterial CNS Flow Chip permite la detección simultánea de nueve especies bacterianas (Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus agalactiae, Listeria monocytogenes, Haemophilus influenzae, Mycobacterium tuberculosis complex, Treponema pallidum, Coxiella burnetti, y Borrelia burgdorferi) y un hongo (Cryptococcus neoformans) mediante la amplificación del ADN bacteriano por PCR múltiple y posterior hibridación reversa sobre una membrana que contiene sondas de ADN específicas para cada especie. Organismo Gen diana Neisseria meningitidis Haemophilus influenzae Streptococcus pneumoniae Streptococcus agalactiae Listeria monocytogenes Cryptococcus neoformans Treponema pallidum Mycobacterium tuberculosis complex Coxiella burnetti Borrelia burgdorferi ctrA gyrB ply cfb hly 18S PolA IS6110 trans osp Tabla 1: Genes usados en la amplificación de las bacterias y hongos. Estado microbiológico: Producto no estéril. 2 PRINCIPIO DEL MÉTODO Bacterial CNS Flow Chip se basa en una metodología que consiste en la amplificación simultánea de 9 bacterias y un hongo por PCR múltiple, seguido de hibridación en membranas de nylon con sondas de ADN específicas mediante la tecnología ADN-Flow. La plataforma de hibridación automática hybriSpot 24, basada en la tecnología ADN-Flow, permite una unión muy rápida entre el producto de PCR y su sonda específica en un ambiente tridimensional poroso, en contraste con la hibridación en superficie convencional. Una vez producida la unión entre los amplicones específicos y sus sondas correspondientes, la señal se visualiza mediante una reacción inmunoenzimática colorimétrica con Estreptavidina-Fosfatasa y un cromógeno (NBT-BCIP), que genera precipitados insolubles en la membrana en aquellas posiciones en las que se ha producido la hibridación. Esta señal es capturada y analizada de forma automática mediante el software hybriSoft. Máster Diagnóstica S.L. Avda. Conocimiento, 100. P.T. Ciencias de la Salud. 18016. Granada (España). Tel: +34 958 271 449. [email protected]; www.masterdiagnostica.com 3/17 Rev: 12/01/2016 3 COMPONENTES El kit proporciona todos los reactivos necesarios para la amplificación por PCR múltiple y posterior hibridación de 24 muestras clínicas. 3.1 Reactivos para PCR múltiple - 24 tests (MAD-003935M-P-HS24-24): Nombre Formato Referencia Bacterial CNS PCR Mix Hot Start DNA Polymerase Uracil-DNA Glycosylase 1 vial x 1200 µl 1 vial x 15 µl 1 vial x 28 µl MAD-003935M-MIX-HS24 MAD-POL-3 MAD-UNG-3 Tabla 2: Reactivos suministrados para realizar la PCR múltiple. Bacterial CNS PCR mix contiene tampón de PCR, MgCl2, dNTPs (U/T), agua libre de ADNsas/RNAsas y cebadores biotinilados. Los cebadores incluidos son específicos para la amplificación de nueve especies de bacterias (Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus agalactiae, Listeria monocytogenes, Haemophilus influenzae, Mycobacterium tuberculosis complex, Treponema pallidum, Coxiella burnetti, y Borrelia burgdorferi) y el hongo Cryptococcus neoformans. Además incluye cebadores para la amplificación de un fragmento de ADN genómico humano (beta-globina como control interno) y cebadores y ADN de control exógeno sintético de amplificación. 3.2 Reactivos para la hibridación reversa - 24 tests (MAD-003935M-H-HS24-24): Nombre Formato Referencia Hybridization Solution (Reagent A) Blocking Solution (Reagent B) Streptavidin-Alkaline Phosphatase (Reagent C) Washing Buffer I (Reagent D) Substrate (Reagent E1) Chromogen (Reagent E2) Reagent E Washing Buffer II (Reagent F) Bacterial CNS Chip 60 ml 10 ml 10 ml 35 ml 14 ml 14 ml -18 ml 1X 24 units MAD-003930MA-HS24-24 MAD-003930MB-HS24-24 MAD-003930MC-HS24-24 MAD-003930MD-HS24-24 MAD-003930ME1-HS24-24 MAD-003930ME2-HS24-24 MAD-003930ME-HS24 MAD-003930MF-HS24-24 MAD-003935M-CH-HS-24 Tabla 3: Reactivos suministrados para realizar la hibridación. IMPORTANTE: Todos los reactivos son suministrados “listos para uso”, excepto reactivos E-1 y E-2, los cuales deben ser mezclados en proporción 1: 1 justo antes de su uso en el vial vacío proporcionado para tal fin y etiquetado como “Reagent E”. Máster Diagnóstica S.L. Avda. Conocimiento, 100. P.T. Ciencias de la Salud. 18016. Granada (España). Tel: +34 958 271 449. [email protected]; www.masterdiagnostica.com 4/17 Rev: 12/01/2016 4 MATERIAL ADICIONAL REQUERIDO NO SUMINISTRADO 4.1 Reactivos y Materiales • • • • • • 4.2 Reactivos para purificar ADN bacteriano de líquido cefalorraquídeo (LCR) Guantes desechables Tubos Eppendorf 0.5 ml PCR Encoded Plates with Flat Cap Strips and Adhesive Film, Ref: MAD-003900P-HS24 HS24 PCR Tube Strips and Flat Cap Strips, Ref: MAD-003900ST-HS24 Puntas de pipeta con filtro libres de ADNsa/RNasa Equipamiento • • • • • • • Microcentrifuga Micropipetas automaticas: P1000, P200, P20 y P2 Termociclador Baño termostatizado o bloque térmico. Bloque hielo o placa de frío (4º C). Equipo automatizado para hibridación hybriSpot 24 HybriSoft Software 5 CONDICIONES DE ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD Reactivos de PCR: Envío entre 2 y 8 °C*. Una vez recibido se debe conservar almacenado a -20 °C, siendo estable hasta la fecha de caducidad especificada. Descongelar en hielo justo antes de usar. Los reactivos de PCR deben ser conservados en zonas libres de contaminación por ADN o productos de PCR. Evitar ciclos múltiples de congelación y descongelación. Reactivos de hibridación. Envío y conservación a 2-8 °C*. No congelar. Tanto los reactivos como los Bacterial CNS CHIPs son estables hasta la fecha de caducidad especificada. La solución de revelado se debe preparar justo antes de usar. El reactivo de hibridación (Reagent A) debe estar a 41°C antes de ser usado y el resto de reactivos deben usarse a temperatura ambiente. * Se incluye un indicador de temperatura con el embalaje. En caso de que la cadena de frío se rompa se recomienda contactar con el fabricante antes de utilizar los reactivos. 6 ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES • Lea las instrucciones de uso antes de utilizar este producto. • Recomendaciones de seguridad: Las precauciones de seguridad se describen en la ficha de seguridad. Este producto está destinado únicamente para uso profesional en un laboratorio, y no como fármaco, para uso doméstico ni otros fines. La versión actual de la ficha de seguridad de este producto se puede descargar del sitio web www.vitro.bio o puede solicitarse a [email protected]. • Consideraciones generales para evitar la contaminación con producto de PCR: La mayor fuente de contaminación suele ser el propio producto de PCR amplificado, por lo cual es recomendable llevar a cabo la manipulación de los productos amplificados en una zona diferente a Máster Diagnóstica S.L. Avda. Conocimiento, 100. P.T. Ciencias de la Salud. 18016. Granada (España). Tel: +34 958 271 449. [email protected]; www.masterdiagnostica.com 5/17 Rev: 12/01/2016 donde se realiza la reacción de PCR. Es recomendable trabajar en áreas diferenciadas de pre- y postPCR en donde se realice la manipulación del ADN problema y preparación de tubos de PCR (pre-PCR) y la manipulación e hibridación de los productos amplificados (post-PCR). Estas áreas deben estar separadas físicamente y debe emplearse material distinto de laboratorio (batas, pipetas, puntas, etc) para evitar la contaminación de las muestras con el ADN amplificado, lo que podría conducir a falsos diagnósticos positivos. El flujo de trabajo debe ir siempre en una única dirección, desde la zona de prePCR hasta la zona de post-PCR y nunca en dirección opuesta. Se debe evitar el flujo de material y personal desde la zona post-PCR a la zona pre-PCR. De forma adicional, para evitar contaminaciones con productos de PCR, el kit incluye la enzima Uracil-ADN Glycosylase que degrada productos de PCR que contengan dUTP. Se recomienda incluir controles negativos en la amplificación que contengan todos los reactivos de PCR a excepción de la muestra de ADN. 7 PREPARACIÓN DE LA MUESTRA 7.1 Toma de muestras Bacterial CNS Flow Chip ha sido validado con material genético purificado de líquido cefalorraquídeo (LCR). El LCR debe recolectarse en un recipiente estéril y ser transportado a 2-8 °C, según directrices del Centro para el control de enfermedades y prevención (CDC). Este material debe guardarse a 2-8 °C durante un máximo de 3 días o a -70 °C para periodos mayores de tiempo, con la finalidad de presevar la viabilidad viral. 7.2 Extracción de ácidos nucleicos desde el LCR EL LCR debe tratarse como un posible agente infeccioso. Las recomendaciones para el manejo de este tipo de muestras se pueden encontrar en las publicaciones de la CDC. Se deben manejar todos los materiales contaminados con agentes biológicos y peligrosos de forma aceptable según las recomendaciones del centro de trabajo. Bacterial CNS Flow Chip ha sido ensayado con material genético purificado de líquido cefalorraquídeo humano. Este kit ha sido validado con ADN de partida obtenido a partir del siguiente sistema de extracción: • NucliSENS® easyMag® (bioMérieux S.A.) Nota: El sistema no ha sido validado con otros sistemas de extracción de ADN/ARN viral, por tanto no se puede garantizar la fiabilidad de los resultados obtenidos si se emplea otro sistema diferente de purificación. Máster Diagnóstica S.L. Avda. Conocimiento, 100. P.T. Ciencias de la Salud. 18016. Granada (España). Tel: +34 958 271 449. [email protected]; www.masterdiagnostica.com 6/17 Rev: 12/01/2016 8 PROCEDIMIENTO DE ANÁLISIS 8.1 Reacción de amplificación por PCR múltiple • • Con el fin de evitar los ciclos de congelación y descongelación se recomienda alicuotear la Mix de PCR la primera vez que se usa: Descongelar Bacterial CNS PCR Mix en hielo. Mezclar bien invirtiendo varias veces el vial. Añadir al vial de PCR mix todo el volumen de Hot Start DNA Polymerase y Uracil-DNA Glycosylase, mezclar bien invirtiendo varias veces el vial y centrifugar unos segundos. Alicuotear 45 µl de la nueva mezcla en PCR Encoded Plates (Ref: MAD-003900P-HS24) or the HS24 PCR Tube Strips (Ref: MAD-003900ST-HS24) cover with the Flat Cap Strips y almacenar a -20°C (estable durante al menos 6 meses). Descongelar un tubo de PCR por muestra y añadir 5 µl del ADN purificado. Nota importante: usar exclusivamente las placas o tiras de tubos suministrados por Master Diagnóstica S.L. con referencias MAD-003900P-HS24 y MAD-003900ST-HS24. • Si la mezcla se prepara en el momento de su uso, mezclar de acuerdo a las siguientes instrucciones: Componente Volumen por reacción Bacterial CNS PCR mix Hot Start DNA Polymerase Uracil-DNA Glycosylase ADN purificado 43.5 µl 0.5 µl 1 µl 5 µl Tabla 4: Reactivos y volúmenes necesarios para realizar la reacción de PCR. Nota: es muy importante que todo el proceso se lleve a cabo en hielo con el fin de evitar la degradación de las enzimas que contiene la Mix PCR múltiple. • Colocar los tubos de PCR en el termociclador y programar las condiciones de amplificación que se detallan a continuación: 1 ciclo 1 ciclo 40 ciclos 1 ciclo 25°C 94°C 94°C 50°C 72°C 72°C 8°C 10 min 3 min 30 s 30 s 30 s 5 min ∞ Tabla 5: Programa PCR Multiple. Mantener los productos de PCR a 8-10°C cuando la reacción haya sido completada. Las muestras pueden ser hibridadas inmediatamente o almacenarse en el área post-PCR a 8-10°C durante 1-2 días. Para almacenar durante un periodo mayor de tiempo se recomienda a -20°C. Máster Diagnóstica S.L. Avda. Conocimiento, 100. P.T. Ciencias de la Salud. 18016. Granada (España). Tel: +34 958 271 449. [email protected]; www.masterdiagnostica.com 7/17 Rev: 12/01/2016 8.2 Preparación de los reactivos de hibridación Todos los reactivos son suministrados en formato “listo para uso”. La solución de revelado de la hibridación se suministra como dos reactivos (Reactivos E1 y E2) que deben mezclarse en proporción 1:1 justo antes de su uso en el vial “Reactivo E”, con un volumen en función del nº de muestras a procesar (ver tabla 6). Tras cada uso es necesario limpiar el vial con agua destilada para evitar el acúmulo de precipitados por usos sucesivos. Las membranas son de un solo uso y se deben manejar con guantes. 8.3 Hibridación reversa por flow-through Todo el proceso de hibridación se realiza de forma automática en hybriSpot 24 (HS24). La gestión de las muestras, la captura de las imágenes y el análisis e informe de los resultados se realizan a través del software hybriSoft. Nota: Configurar el instrumento siguiendo las instrucciones del manual de usuario (proporcionadas con el instrumento). Antes de comenzar el proceso de hibridación: 1. Desnaturalizar los productos de PCR calentando a 95 °C durante 10 min en un termociclador y enfriar rápidamente en hielo durante al menos 2 min. 2. Preparar el Reactivo E (Reagent E) en el momento de usar, mezclando en proporción 1:1 los componentes 1 y 2 suministrados en el kit. En la siguiente tabla se indican los volúmenes requeridos de reactivo E1 y E2 en función del número de tests: vol (µl)/1 tests vol (µl)/4 tests vol (µl)/8 tests vol (µl)/12 tests vol (µl)/16 tests vol (µl)/20 tests vol (µl)/24 tests E1 E2 1200 1800 2300 3000 3800 4200 5000 1200 1800 2300 3000 3800 4200 5000 Tabla 6: Volúmenes de reactivos E1-E2 que se deben mezclar en el vial E en función del nº de test a procesar. 3. Disponer las muestras amplificadas, Bacterial CNS Chips y reactivos en el lugar designado del HS24 y seleccionar el correspondiente protocolo del instrumento para que se inicie de forma automática el proceso. Máster Diagnóstica S.L. Avda. Conocimiento, 100. P.T. Ciencias de la Salud. 18016. Granada (España). Tel: +34 958 271 449. [email protected]; www.masterdiagnostica.com 8/17 Rev: 12/01/2016 9 PROCEDIMIENTO DE CONTROL DE CALIDAD Bacterial CNS Flow Chip kit contiene varios controles internos para asegurar la calidad de los resultados. SONDA CONTROL B Control hibridación CI Control de amplificación exógeno BG Control de amplificación endógeno Tabla 7: Sondas control incluidas en Bacterial CNS Chip. Control de hibridación: Tras el revelado de las membranas debe aparecer una señal intensa en las cinco posiciones de control de hibridación (B) que sirve como control de calidad. Esta señal indica que los reactivos de hibridación y revelado han funcionado correctamente. Si no aparece señal indicará que ha habido un fallo durante el proceso de hibridación o que algún reactivo no se ha usado correctamente. Además, esta señal permite que el software pueda orientar correctamente el panel de sondas para su posterior análisis. Control de amplificación exógeno (CI): Sonda para la detección del ADN sintético incluido en la mezcla de PCR. Este ADN se co-amplificará junto con el material genético de la muestra. Las dos posiciones positivas en el Control de amplificación exógeno (CI) indicarán que la reacción de PCR ha funcionado correctamente. Control de amplificación endógeno (BG): Sonda para la detección del gen de la beta-globina humana contenido en la muestra problema, que es co-amplificado durante la PCR. Todas las muestras donde el ADN problema se haya amplificado correctamente tendrán una señal positiva en el Control de amplificación endógeno (BG). Esta señal es indicativa de la calidad/cantidad del ADN empleado en la amplificación. Una señal positiva indica que la amplificación ha funcionado correctamente y que la calidad y cantidad del ADN de partida han sido óptimas. La ausencia de señal para este control nos indica fallos durante la amplificación, baja calidad/ cantidad del ADN utilizado en la amplificación o ausencia de ADN humano en la muestra. Este último caso es posible cuando el líquido cefalorraquídeo no contenga células humanas y en el análisis automático con el software hybriSoft aparece un aviso de “ausencia de ADN humano”. Si no se observa señal para este control de amplificación endógeno, el usuario debería verificar que el proceso de extracción del ADN de la muestra de partida se ha realizado correctamente, añadiendo un ADN humano exógeno a la muestra de líquido cefalorraquídeo antes de la extracción (p. ej. 200-500 ng de ADN genómico humano, en función del volumen final de elución del método). Cuando una muestra es positiva para alguno de los virus incluidos en el kit, con resultado negativo para los controles de amplificación exógeno y endógeno, en el informe de análisis automático de los resultados con el software hybriSoft aparece un aviso de “ausencia de ADN genómico humano/presencia de inhibidores de PCR” para que el usuario realice las verificaciones oportunas antes de validar el resultado. El usuario es responsable de determinar los procedimientos de control de calidad apropiados para su laboratorio y cumplir con la reglamentación aplicable. Máster Diagnóstica S.L. Avda. Conocimiento, 100. P.T. Ciencias de la Salud. 18016. Granada (España). Tel: +34 958 271 449. [email protected]; www.masterdiagnostica.com 9/17 Rev: 12/01/2016 10 INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS En el siguiente esquema se muestra la distribución de las sondas en el Bacterial CNS Chip: “B”: control de hibridación “CI”: Control de amplificación exógeno “BG”: Control de amplificación endógeno (fragmento ß-Globina humana) “X”: Sondas específicas para cada bacteria/hongo Todas las sondas están duplicadas para garantizar la fiabilidad en el análisis automático de los resultados. El control de hibridación (B) está repetido en 5 posiciones y permite que el software pueda orientar correctamente el panel de sondas para su posterior análisis. A continuación se muestra la distribución de las diferentes sondas incluidas en el Bacterial CNS Chip así como los posibles resultados esperados. 1 2 3 4 5 6 7 8 A B B B B MTB C CI D BG E NEISS AGAL TPA PNEU HINF COX F LIS B CRYP BOR NEISS AGAL TPA CI G LIS H MTB I B CRYP BOR BG PNEU HINF COX Tabla 8a: Posición de las sondas incluidas en Bacterial CNS Chip. Máster Diagnóstica S.L. Avda. Conocimiento, 100. P.T. Ciencias de la Salud. 18016. Granada (España). Tel: +34 958 271 449. [email protected]; www.masterdiagnostica.com 10/17 Rev: 12/01/2016 Sonda/Posición (columna-fila) Resultados esperados Organismo B CI BG Positivo Neisseria meningitidis 2C-6E 1A-1B-2I-5E-8A 1C-5F -- / 1D-5G Positivo Streptococcus pneumoniae 2E-6G 1A-1B-2I-5E-8A 1C-5F -- / 1D-5G Positivo Listeria monocytogenes 2G-6C 1A-1B-2I-5E-8A 1C-5F -- / 1D-5G Positivo Mycobacterium tuberculosis complex 2H-8B 1A-1B-2I-5E-8A 1C-5F -- / 1D-5G Positivo Streptococcus agalactiae 3C-7E 1A-1B-2I-5E-8A 1C-5F -- / 1D-5G Positivo Haemophilus influenzae 3E-7G 1A-1B-2I-5E-8A 1C-5F -- / 1D-5G Positivo Cryptococcus neoformans 3G-7C 1A-1B-2I-5E-8A 1C-5F -- / 1D-5G Positivo Treponema pallidum 4C-8E 1A-1B-2I-5E-8A 1C-5F -- / 1D-5G Positivo Coxiella burnetti 4E-8G 1A-1B-2I-5E-8A 1C-5F -- / 1D-5G Positivo Borrelia burgdorferi 4G-8C 1A-1B-2I-5E-8A 1C-5F -- / 1D-5G Negativo -- 1A-1B-2I-5E-8A 1C-5F -- / 1D-5G Muestra no válida (PCR inhibida) -- 1A-1B-2I-5E-8A -- -- Muestra negativa (ausencia de ADN genómico humano) -- 1A-1B-2I-5E-8A 1C-5F -- Error de hibridación -- -- -- -- Tabla 8b: Posicionamiento de las sondas incluidas en Bacterial CNS Chip e interpretación de resultados. 11 CARACTERÍSTICAS DEL FUNCIONAMIENTO 11.1 Repetitividad Se analizó la repetitividad del kit ensayando el método un mínimo de seis veces para cada bacteria/hongo incluidos en el panel a dos concentraciones distintas. El ensayo fue realizado por un mismo operador, en una sola localización, en el mismo día y usando el mismo lote de reactivos. La hibridación se realizó en la plataforma hybriSpot y los resultados se analizaron con el software hybriSoft. Organismo Concentración (copias/reacción) Positivos/testados % positivos Neisseria meningitidis 100 10 100 10 100 10 100 10 100 50 100 10 100 10 100 50 100 50 100 50 6/6 6/6 6/6 6/6 6/6 6/6 6/6 6/6 6/6 6/6 6/6 6/6 6/6 6/6 6/6 6/6 6/6 3/6 6/6 4/6 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 50% 100% 67% Streptococcus pneumoniae Listeria monocytogenes Mycobacterium tuberculosis complex Streptococcus agalactiae Haemophilus influenzae Cryptococcus neoformans Treponema pallidum Coxiella burnetti Borrelia burgdorferi Tabla 9: Ensayo de repetitividad para cada uno de las bacterias/hongo incluidos en el panel. Máster Diagnóstica S.L. Avda. Conocimiento, 100. P.T. Ciencias de la Salud. 18016. Granada (España). Tel: +34 958 271 449. [email protected]; www.masterdiagnostica.com 11/17 Rev: 12/01/2016 11.2 Reproducibilidad Se analizó la precisión del método variando dos factores que podrían contribuir a la variabilidad: termociclador y operador. Se ensayaron por triplicado tres especies incluidas en el panel a dos concentraciones distintas, usando dos operadores y dos termocicladores distintos. No se obtuvieron falsos positivos. El operador 1 obtenía un mayor porcentaje de casos positivos que el operador 2. Bacteria GE/reacción Neisseria meningitidis 100 copias 10 copias Streptococcus pneumoniae 100 copias 10 copias Haemophilus influenzae 100 copias 10 copias Nº de termociclador N° Positivos/validos 014 6/6 021 6/6 014 6/6 021 6/6 014 6/6 021 6/6 014 6/6 021 6/6 014 6/6 021 5/6 014 6/6 021 5/6 % 100 100 100 100 100 100 100 100 100 83 100 83 Nº de operador N° Positivos/validos 1 6/6 2 6/6 1 5/6 2 5/6 1 6/6 2 6/6 1 5/6 2 5/6 1 6/6 2 5/6 1 6/6 2 5/6 % 100 100 83 83 100 100 83 83 100 83 100 83 Tabla 10: Reproducibilidad de Bacterial CNS Flow Chip kit. 11.3 Especificidad analítica No se observaron reacciones cruzadas entre los diez organismos incluidos en el test. Organismo Especificidad Neisseria meningitidis Streptococcus pneumoniae Listeria monocytogenes Mycobacterium tuberculosis complex Streptococcus agalactiae Haemophilus influenzae Cryptococcus neoformans Treponema pallidum Coxiella burnetti Borrelia burgdorferi 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% Tabla 11: Especificidad de Bacterial CNS Flow Chip. No se observaron reacciones cruzadas con otros virus y bacterias: Bacteria Staphylococcus aureus Mycobacterium abcessus Enterococcus faecalis Klebsiella.pneumoniae Proteus mirabilis Escherichia coli Pseudomonas aeruginosa Enterobacter cloacae Virus Herpes simplex-1 Herpes simplex-2 Epstein Barr virus Cytomegalovirus Varicella Zoster virus Tabla 12: Especificidad de Bacterial CNS Flow Chip. Máster Diagnóstica S.L. Avda. Conocimiento, 100. P.T. Ciencias de la Salud. 18016. Granada (España). Tel: +34 958 271 449. [email protected]; www.masterdiagnostica.com 12/17 Rev: 12/01/2016 11.4 Sensibilidad analítica Se calculó el límite de detección para cada patógeno. La sensibilidad analítica fue realizada usando varias diluciones de ADN genómico de cada patógeno incluido en el panel. Cada muestra se ensayó un mínimo de 6 veces para calcular la sensibilidad, especificidad e intervalos de confianza. Los resultados se analizaron con la plataforma hybriSpot y el software hybriSoft. Se estableció un valor de 4 como punto de corte de positividad de la muestra. Organismo Neisseria meningitidis Streptococcus pneumoniae Listeria monocytogenes Mycobacterium tuberculosis complex Streptococcus agalactiae Haemophilus influenzae Cryptococcus neoformans Treponema pallidum Coxiella burnetti Borrelia burgdorferi GE/reacción Positivos detectados/positivos totales Sensibilidad 10 copias 10 copias 12/12 12/12 100% 100% 10 copias 10 copias 12/12 12/12 50 copias 30 copias 10 copias 10 copias 50 copias 10 copias 100 copias 100 copias 50 copias Intervalo de confianza 95% Especificidad Intervalo de confianza 95% (75.8%-100%) (75.8%-100%) 100% 100% (98%-100%) (98%-100%) 100% 100% (75.8%-100%) (75.8%-100%) 100% 100% (98%-100%) (98%-100%) 12/12 3/6 12/12 12/12 100% 50% 100% 100% (75.8%-100%) (18.8%-81.3%) (75.8%-100%) (75.8%-100%) 100% 100% 100% 100% (97.8%-100%) (97.8%-100%) (98%-100%) (98%-100%) 12/12 3/6 12/12 12/12 8/12 100% 50% 100% 100% 67% (75.8%-100%) (18.8%-81.3%) (75.8%-100%) (75.8%-100%) (39.1%-86.2%) 100% 100% 100% 100% 100% (97.8%-100%) (97.8%-100%) (97.9%-100%) (97.9%-100%) (97.9%-100%) Tabla 13: Sensibilidad Analítica (LoD): copias de ADN genómico de cada patógeno incluidos en la reacción de PCR con un resultado positivo en el 100% de los casos, analizados con el software hybriSoft y punto de corte de positividad en un valor de 4. 11.5 Sensibilidad clínica La sensibilidad clínica de Bacterial CNS Flow Chip kit se determinó usando LCR positivos simulados. LCR artificiales se inocularon con diferentes concentraciones de cada patógeno. El ADN de estos LCR positivos se extrajo usando NucliSENS® easyMAG® (bioMérieux). Los resultados se analizaron con el software hybriSoft. Patógeno Sensibilidad clínica (cfu/µl LCR) Neisseria meningitidis Streptococcus pneumoniae Listeria monocytogenes Mycobacterium tuberculosis complex Streptococcus agalactiae Haemophilus influenzae Cryptococcus neoformans Treponema pallidum Coxiella burnetti Borrelia burgdorferi 1 1 1 1 1 1 nd nd nd nd Tabla 14: Sensibilidad clínica de Bacterial CNS Flow Chip. Nd: no determinado. Máster Diagnóstica S.L. Avda. Conocimiento, 100. P.T. Ciencias de la Salud. 18016. Granada (España). Tel: +34 958 271 449. [email protected]; www.masterdiagnostica.com 13/17 Rev: 12/01/2016 11.6 Funcionamiento analítico en hybriSpot 24 Se validó el funcionamiento y robustez de Bacterial CNS Flow Chip en el equipo automático HS24 analizando concentraciones límite de ADN genómico de todos los genotipos incluidos en el panel (10 copias para N. meningitidis, L. monocytogenes, Mycobacterium tuberculosis complex, C. neoformans, S. pneumoniae y H. influenzae, 50 copias para T. pallidum y S. agalactiae y 100 copias para B. burgdorferi y C. burnetti). Esta validación demuestra la reproducibilidad de los resultados entre las posiciones 1 y 24 del equipo HS24 y la reproducibilidad de los resultados con diferentes programas para distinto número de muestras. - Reproducibilidad de resultados en programas para distinto número de muestras Se realizaron réplicas de una muestra positiva que contenía una concentración límite de S. agalactiae (50 GE). Estas réplicas se situaron en diferentes posiciones de la cámara de reacción del equipo HS24 y se evaluaron diferentes protocolos: Protocolo para 2 muestras (2 réplicas) Protocolo para 12 muestras (3 réplicas) Protocolo para 15 muestras (3 réplicas) Protocolo para 24 muestras (4 réplicas) Los resultados fueron analizados de forma automática con hybriSoft y no se detectaron diferencias entre las distintas posiciones de la cámara de reacción ni entre los protocolos utilizados. - Reproducibilidad de resultados en diferentes posiciones de hibridación en HS24 Se realizaron cuatro réplicas para cada patógeno, situadas en diferentes posiciones de las dos cámaras de reacción del HS24 y con el protocolo para 24 muestras. Los resultados fueron analizados de forma automática con hybriSoft, demostrando un 100% de reproducibilidad para todos los genotipos analizados en diferentes posiciones. Organismo Neisseria meningitidis Streptococcus pneumoniae Listeria monocytogenes Mycobacterium tuberculosis complex Streptococcus agalactiae Haemophilus influenzae Cryptococcus neoformans Treponema pallidum Coxiella burnetti Borrelia burgdorferi Nº GE/ reacción Positivos/testados Diferencias entre posiciones 10 10 10 10 50 10 10 50 100 100 4/4 4/4 4/4 4/4 4/4 4/4 4/4 4/4 4/4 4/4 No No No No No No No No No No Tabla 15: Reproducibilidad de Bacterial CNS Flow Chip kit en HS24. La positividad se analizó con hybriSoft estableciendo como punto de corte un valor de 4. Máster Diagnóstica S.L. Avda. Conocimiento, 100. P.T. Ciencias de la Salud. 18016. Granada (España). Tel: +34 958 271 449. [email protected]; www.masterdiagnostica.com 14/17 Rev: 12/01/2016 12 LIMITACIONES Uso de muestras inadecuadas: el método ha sido validado con material genético purificado de LCR. El análisis de cualquier otro tipo de muestra puede generar resultados erróneos o no concluyentes por inhibición de la reacción de PCR por agentes químicos inhibitorios. 13 PROBLEMAS Y SOLUCIONES Problema Posibles causas Soluciones Error en el protocolo de hibridación. Comprobar que se han añadido todos los reactivos de hibridación correctamente. Verificar el funcionamiento del equipo HS24. Repetir el test. No se observa ninguna señal/ no hay señal de hibridación Reactivos de hibridación caducados almancenados correctamente. o no Verificar la fecha de caducidad así como el correcto almacenamiento de los reactivos de hibridación y Chips. Repetir el test. Limpiar con agua destilada abundante las cámaras de reacción. Repetir el test. Presencia de patógeno en control negativo Posible degradación del ADN de los Chips durante el proceso de descontaminación de superficies y material. Problemas de contaminación en las zonas pre-PCR o post-PCR. Problemas en la amplificación por PCR. Comprobar que el programa del termociclador es el adecuado, que la mezcla madre de PCR se ha preparado de forma adecuada y que los reactivos se conservan correctamente. Repetir el test. Presencia de inhibidores de PCR en la muestra problema. Verificar el correcto funcionamiento del sistema de extracción de ácidos nucleicos empleado. Repetir el test. Verificar que el sistema de extracción del material genético empleado funciona correctamente incluyendo un control de extracción. Ausencia de control exógeno de amplificación Ausencia de control endógeno de amplificación Cantidad insuficiente de ADN humado en la muestra problema. Presencia de inhibidores de PCR en la muestra problema. Mezcla de sustrato, E1 y E2, antigua, no preparada justo antes de usar. Precipitado de cromógeno en los Chips tras la hibridación Señales débiles en la hibridación Descontaminar (lejía 1%) trabajo y repetir el test. las áreas de Preparar una nueva mezcla de sustrato mezclando los reactivos E1 y E2 (1:1) justo antes de su uso. Repetir el test. Vial de preparación “E” con restos procedentes de un uso previo. Reactivos de PCR y/o hibridación caducados o almacenados de forma incorrecta. Lavar bien con agua el vial “E” antes de usarlo. Repetir el test. Comprobar la caducidad de los reactivos, la conservación de mezcla de PCR y reactivos, Error en el protocolo de hibridación. Comprobar las temperaturas y tiempos de hibridación y verificar el funcionamiento del equipo hybriSpot 24. El producto de PCR no se desnaturalizó correctamente antes de la hibridación. Verificar que la desnaturalización se ha realizado correctamente. Repetir el test. Baja calidad/cantidad del ADN empleado. Incrementar la cantidad de muestra o ADN de partida. Verificar el correcto funcionamiento del sistema de extracción de ácidos nucleicos empleado. Máster Diagnóstica S.L. Avda. Conocimiento, 100. P.T. Ciencias de la Salud. 18016. Granada (España). Tel: +34 958 271 449. [email protected]; www.masterdiagnostica.com 15/17 Rev: 12/01/2016 14 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS • • • • • • • • • • • • • Durand ML, Calderwood SB, Weber DJ, et al. Acute bacterial meningitis in adults: a review of 493 episodes. N Engl J Med 1993; 328:21–8. Lavoie FW, Caucier JR. In: Marx JA, Hockberger RS,Walls RM, et al. Central nervous system infections. 6th edition.Philadelphia: Mosby Elsevier; 2006. p. 1710–25 Durand ML, Calderwood SB, Weber DJ, et al. Acute bacterial meningitis in adults: a review of 493 episodes. N Engl J Med 1993; 328:21–8. Loring KE. In: Tintinalli JE, Kelen GD, Stapczynski JS. CNS infections. Emergency medicine: a comprehensive study guide. 6th edition. New York: McGraw-Hill; 2004. p. 1431–7 Lavoie FW, Caucier JR. In: Marx JA, Hockberger RS,Walls RM, et al. Central nervous system infections. 6th edition.Philadelphia: Mosby Elsevier; 2006. p. 1710–25 Pickering LK, Baker CJ, Long SS, et al. Haemophilus influenzae infections. Report of the Committee on Infectious Diseases. 27th edition. Elk Grove Village (IL): American Academy of Pediatrics; 2006. p. 310–8 Pickering LK, Baker CJ, Long SS, et al. Pneumococcal infections. 27th edition. Elk Grove Village (IL): American Academy of Pediatrics; 2006. p. 525–37 Bøving MK1, Pedersen LN, Møller JK. Eight-plex PCR and liquid-array detection of bacterial and viral pathogens in cerebrospinal fluid from patients with suspected meningitis. J Clin Microbiol. 2009 Apr;47(4):908-13 Matthijs C. Brouwer, Allan R. Tunkel and Diederik van de Beek. Epidemiology, Diagnosis, and Antimicrobial Treatment of Acute Bacterial Meningitis. Clin. Microbiol. Rev. 2010, 23(3):467 Abdeldaim GM, Strålin K, Korsgaard J, Blomberg J, Welinder-Olsson C, Herrmann B. Multiplex quantitative PCR for detection of lower respiratory tract infection and meningitis caused by Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae and Neisseria meningitidis. BMC Microbiol. 2010 Dec 3;10:310 Wang X, Theodore MJ, Mair R, Trujillo-Lopez E, du Plessis M, Wolter N, Baughman AL, Hatcher C, Vuong J, Lott L, von Gottberg A, Sacchi C, McDonald JM, Messonnier NE, Mayer LW. Clinical validation of multiplex real-time PCR assays for detection of bacterial meningitis pathogens. J Clin Microbiol. 2012 Mar;50(3):702-8 Zhu H, Wang Q, Wen L, Xu J, Shao Z, Chen M, Chen M, Reeves PR, Cao B, Wang L. Development of a multiplex PCR assay for detection and genogrouping of Neisseria meningitidis. J Clin Microbiol. 2012 Jan;50(1):46-51 Wang Y, Guo G, Wang H, Yang X, Shao F, Yang C, Gao W, Shao Z, Zhang J, Luo J, Yang Y, Kong F, Zhu B. Comparative study of bacteriological culture and real-time fluorescence quantitative PCR (RT-PCR) and multiplex PCR-based reverse line blot (mPCR/RLB) hybridization assay in the diagnosis of bacterial neonatal meningitis. BMC Pediatr. 2014 Sep 8;14:224 15 SÍMBOLOS DE LA ETIQUETA Producto sanitario para diagnóstico in vitro Fecha de caducidad Número de catálogo Límite de temperatura Código de lote Fabricante Consúltese las instrucciones de uso Contenido suficiente para <n> ensayos Máster Diagnóstica S.L. Avda. Conocimiento, 100. P.T. Ciencias de la Salud. 18016. Granada (España). Tel: +34 958 271 449. [email protected]; www.masterdiagnostica.com 16/17 Rev: 12/01/2016 16 GLOSARIO CNS: sistema nervioso central LCR: líquido cefalorraquídeo ADN: ácido deoxirribonucleico ARN: ácido ribonucleico PCR: reacción en cadena de la polimerasa HS24: hybriSpot 24 GE: equivalentes de genoma NBT-BCIP: nitroblue tetrazolium chloride- 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate Cod UNG: Cod Uracil-DNA Glycosylase MgCl2: magnesium chloride dNTPs: Deoxynucleotide triphosphates DNases: deoxyribonuclease RNases: ribonuclease dUTP: Deoxyuridine Triphosphate CDC: Centros para el control de enfermedades y prevención Cfu: Unidades formadoras de calvas Máster Diagnóstica S.L. Avda. Conocimiento, 100. P.T. Ciencias de la Salud. 18016. Granada (España). Tel: +34 958 271 449. [email protected]; www.masterdiagnostica.com 17/17 Rev: 12/01/2016