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Wolf & Brem
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DESARROLLO Y APLICACIONES DE LAS CELULAS EMBRIONARIAS PRIMORDIALES
E. Wolf & G. Brem
Introducción
A partir de la exitosa producción de líneas celulares pluripotentes de embriones de ratón a comienzos
de la década del '80, las mismas se emplean intensamente como modelos para el estudio embrionario
básico como así también como vectores para la transferencia de genes. Otros objetivos en la
investigación de células primordiales embrionarias comprende su empleo como donantes de núcleos en
experimentos de clonado como también la conservación ex situ de información genética. El presente
capítulo presenta un resumen de los resultados en la investigación. Estos documentan el estado actual
de la puesta a punto y empleo de las células embrionarias primordiales en animales de experimentación
y de interés productivo.
Definición y características
Las células embrionarias primordiales son líneas celulares continuas de origen embrionario y
totipotentes, a partir de las cuales se pueden desarrollar todos los órganos, incluyendo la hilera
germinal. Las células pluripotentes de origen embrionario pueden obtenerse mediante diferentes
métodos (ROBERTSON, 1987). Un camino posible lo constituye el aislamiento de células pluripotentes
de teratocarcinomas espontáneos como también su producción a partir de localizaciones embrionarias
ectópicas (DAMJANOV y col., 1987). Junto con esas alternativas existe actualmente la posibilidad de
aislar células pluripotentes directamente de los embriones. Las células pluripotentes aisladas de
teratocarcinomas se denominan células-EC, las obtenidas de embriones EK (BRANDLEY y col., 1984) o
más comúnmente ES.
Las células EC no pueden diferenciarse de las morfológicamente ES, en su comportamiento antigénico
de superficie como tampoco en su diferenciación in vivo o in vitro (EVANS y KAUFMAN, 1981; MARTIN,
1981). No obstante las células totipotentes embrionarias cuentan con algunas ventajas frente a las del
carcinoma embrionario:
- Directa aislación a través de marcadores genéticos como determinadas isoenzimas (BRADLEY y
col., 1984) o mutaciones (MARTIN y col., 1987)
- La conservación de un número diploide de cromosomas en el cual se hayan establecido las líneas
femenina (XX) y masculina (XY, NICHOLS y col., 1990)
- Un porcentaje relativamente alto de quimeras después de la inyección de células ES en blastocistos
con la posibilidad de formar quimeras de la hilera germinal (BRADLEY y col., 1984)
- Permite la posibilidad de obtener células ES de embriones partenogenéticos que cuentan con una
constitución genética homocigota diploide (ROBERTSON, 1987).
Formación y cultivo
La aislación de líneas totipotentes de embriones se basa en las siguientes condiciones (BRADLEY,
1990):
- Las células deben estar presentes en el estadio del embrión
- Las células deben ser protegidas de señales que desencadenen su diferenciación
- Deben se capaces de reproducirse in vitro
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Dos grupos de investigación lograron por primera vez el aislamiento de líneas celulares totipotentes de
ratón al comienzo de la década del 80. EVANS y col. (1981) cultivaron blastocistos de la cepa
consanguínea 129, cuya implantación fue impedida a través de una ovariectomía del animal donante en
el día 2,5 después del estro y un tratamiento simultáneo con progesterona (implante). Las células ES se
obtuvieron los días 6-8 de comenzado el estro, fueron cultivadas durante 4 días, momento en el cual los
blastocistos producidos eclosionan y las células trofoectodérmicas se diferencian en trofoblastos
gigantes (grandes). La masa celular interna (MCI), estructura con forma oval-cilíndrica, ubicada en el
centro del blastocisto fue aislada con un capilar de vidrio y tripsinada. Las células obtenidas fueron
cultivadas en un medio DMDM (Dulbecco's modified Eagles medium) modificado, individualmente o en
pequeños grupos sobre una línea continua de fibroblastos de ratón (STO) inactivados con mitomicina.
Las colonias con una morfología típica ES (colonias claras, continuas, sin limites celulares visibles, foto
1) fueron recolectadas y colocadas sobre una capa de células nutrientes (feederlayer).
Foto 1: Célula embrionaria primordial totipotente (ES)
MARTIN (1981) aisló MCIs de blastocistos expandidos a través de cirugía inmunológica (foto 2). A
través de un tratamiento con Pronase (0,5%) en M2 (37o C, 3-10 min) se eliminó la zona pelúcida (foto
2a). Las MCIs fueron cultivadas en DMEM modificado con fibroblastos STO inactivados en su mitosis. El
medio DMEM fue previamente condicionado con células de carcinoma de la línea PSA-1. Una
información más exacta sobre el protocolo de trabajo se encuentra en el trabajo de ROBERTSON
(1987).
La aislación y cultivo de células ES se logró originalmente sólo con el empleo de células nutrientes
(fibroblastos STO inactivados en su mitosis o fibroblastos embrionales primarios), cuyas funciones como
la desintoxicación del medio en general, la fijación de las células y la inhibición de la diferenciación en
particular fueron descriptas (ROBERTSON, 1987). La presencia de células nutrientes complica, sin
embargo, la manipulación genética de las células ES como así también la caracterización de los
factores de crecimiento y diferenciación.
SMITH y HOOPER (1987) descubrieron un factor soluble en un medio condicionado con células BRL
(buffalo Rat liver), que podía inhibir la diferenciación en forma reversible (differentiation inhibiting activity
= DIA) aún cuando es cultivado sin células nutrientes. En forma pura DIA es una glicoproteína con un
peso molecular de 43000 e idéntico al factor inhibidor de la leucemia (LIF = Leukeaemia inhibitory
factor, SMITH y col., 1988; WILLIAMS y col., 1988). LIF está actualmente disponible
biotecnológicamente (GEARING y col., 1989) y se ofrece en el mercado bajo la denominación ESGRO
(Amrad, Australia).
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Foto 2: Aislación inmunológica de las MCIs de un
blastocisto (ratón): a) eliminación de la zona pelúcida;
b) Cultivo de los embriones (37oC, 20-30 min) en suero de
conejo anti ratón, inactivado por medio de calor y lavado en
M2; c) colocación de los embriones en gotas con
complemento de cobayo (1:10) para destruir las células
trofoectodérmicas; d) eliminación de las células lisadas con
una pipeta. La flecha indica la MCI
Con el agregado en el medio de cultivo de LIF se logró la formación de líneas celulares ES diploides
con o sin el empleo de células nutrientes (HENDYSIDE y col., 1989; NICHOLS y col., 1990). WELLS y
col. (1991) pudieron establecer líneas celulares ES de embriones sometidos a un shock térmico (42o C
durante 10 min) y a un tratamiento con Puromicina, con una eficiencia significativamente mayor que con
embriones no tratados. Mientras que en la mayor parte de los ensayos para el desarrollo de células ES
se emplearon embriones de la línea consanguínea 129 LEDERMAN y BURKI (1991) lograron establecer
una quimera de la hilera germinal a partir de embriones de la línea C57BL/6. En ese trabajo, el
aislamiento de las células ES se logró por medio de células con mitosis inactivada de la linea 5637
(carcinoma humano), con mayor frecuencia que con los fibroblastos embrionarios murinos. El trabajo de
SMITH (1991) presenta una lista completa de los métodos disponibles y materiales necesarios para el
cultivo de células ES.
Diferenciación in vivo e in vitro de células embrionales totipotentes
Cuando las células ES alcanzan una alta concentración en el cultivo tienden a diferenciarse
espontáneamente, observándose en primer lugar células epiteloides como endodermo primitivo. Si las
células ES son mantenidas sin células nutrientes, en cultivos de suspensión sobre sustratos no
adhesivos se presenta un fenómeno de diferenciación aún más complejo (DOETSCHMAN y col., 1985).
Como primer estadio se forman agregados de células ectodérmicas, rodeadas por una capa simple de
células endodérmicas (= "Embryoid bodies" = cuerpos embrioides simples; foto 3a). Con un cultivo
progresivo se forman estructuras quísticas que contienen también estructuras mesodérmicas (cuerpos
embrioides complejos; foto 3b).
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Foto 3: Cuerpos embrioides simples (A) y complejos (B)
Bajo las condiciones establecidas por DOETSCHMAN y col. (1985) se formaron "islas de sangre" y
células miocárdicas en 30% de los cuerpos embrioides complejos. Si los cuerpos embrioides son
colocados nuevamente sobre un substrato adhesivo se produce una amplia diferenciación en derivados
de las tres capas dérmicas (por ejemplo, células nerviosas, musculares, pigmentarias, condrocitos, etc).
Tabla 1: Producción de quimeras por medio de la inyección de células primordiales embrionarias * en
blastocistos (resultados no publicados)
Blastocistos
NMRI
C57Bl/6
Balb/c
Blastocistos inyectados y transferidos
225
520
56
Número de transferencias
Blastocistos/transferencia
24
9.4
48
10.8
6
9.3
Preñeces
10 (42%)a
25 (52%)a
3 (50%)a
Nacimientos
33 (15%)b
87 (17%)b
6 (11%)b
Animales destetados
28 (85%)c
54 (62%)c
4 (66%)c
Número de quimeras de pelaje
9 (32%)d
24 (44%)d
4 (100%)d
< 20%
bis 95 %
bis 50%
Quimeras apareadas
9
22
4
Quimeras infértiles
0
7
1
Quimeras con más de 10 descendientes
9
11
3
Quimeras de la hilera germinal
0
6
1
Manifestación del quimerismo de pelaje
*D3 y diferentes clones homólogos recombinados (gene disruption); Valores promedio de atransferencias,
bembriones transferidos, canimales nacidos y danimales destetados
El potencial de diferenciación in vivo de las células ES puede ser evaluado a través de un transplante
sucutáneo en ratones singénicos. EVANS y KAUFMAN (1981) observaron en ese ensayo una alta
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incidencia de tumores de rápido crecimiento. En la evaluación histopatológica de los mismos se observó
la participación de varios tejidos que fueron identificados como teratocarcinomas. Sin embargo el test
definitivo de la totipotencia de las células embrionarias se lleva a cabo a través de la inyección de las
células ES en blastocistos o mórulas de otra especie con el fin de producir quimeras (fig. 1).
Inyección de células ES en los blastocistos y
transferencia de los embriones a receptoras
seudográvidas
Nacimiento de las quimeras
Test para comprobar el quimerismo de la
hilera germinal a través del cruzamiento de
las quimeras con marcadores genéticos
(marcadores de color de pelaje)
Nacimiento de la descendencia, proveniente
de células ES
Fig 1: Evaluación in vivo de la pluripotencia de las células ES a través de la inyección en blastocistos
Una amplia exposición de los materiales necesarios y de los diferentes pasos metodológicos se
encuentran en el trabajo de BRADLEY (1987). Por esa razón nos referiremos a los puntos más
importantes de acuerdo a nuestra experiencia. Las células ES se inyectan en blastocistos (d 3)
recolectados de ratonas donantes superovuladas. Alternativamente se pueden utilizar mórulas (d 2).
Estas deben ser tratadas, sin embargo, con citocalasina B en un medo libre de Ca++ y Mg++ para
lograr un reversible aflojamiento del citoesqueleto. BRADLEY (1987) recomienda para la inyección una
cámara enfriada (10o C), que de acuerdo a nuestra experiencia no es necesaria. De importancia es la
calidad de las micropipetas de inyección y sujeción. Su construcción se presenta en las figuras 2 y 3.
Los aparatos necesarios para ello en el capítulo X (fotos 5, 6 y 8).
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Fig 2: Elaboración de las pipetas para inyección de lás células ES en blastocistos o mórulas. Los
capilares de borosilicato son estirados con un estirador de pipetas y cortados en diagonal en un
diámetro de 18 a 22 m con un escalpelo sobre goma siliconada. Con cierta experiencia se
obtiene el 50% de los capilares con la forma ideal (a). Pipetas muy largas (b), muy cortas (c) y
con irregularidades (d) son inadecuadas para la inyección
Ambas pipetas se manipulan a través de micromanipuladores. El sistema de sostén es llenado con aire
y controlado con la boca o una jeringa de 10 ml. El sistema de microinyección que contiene silicona
líquida es accionado por medio de una jeringa Hamilton (fig. 4). La inyección se lleva a cabo como se
indica en la fig. 8, siendo la mejor posición el límite entre 2 células trofoectodérmicas. Después de la
inyección de 8-15 células ES en cada blastocisto ó 3-4 células ES en cada mórula, los embriones son
cultivados 30 a 60 min y posteriormente transferidos en el útero de receptoras seudográvidas (d 2).
Fig 3: Elaboración de una pipeta de sostén. El capilar es estirado a mano hasta un diámetro de 80-120
m y apoyado sobre la esfera de vidrio de la microfragua (a). La esfera es calentada hasta que la pared
del capilar y la esfera se funden ligera-mente (b). Se interrumpe a continuación la corriente eléctrica de
forma tal que el filamento que calienta la esfera se contrae y el capilar se quiebra (c). A continuación se
redondea y reduce el borde de la pipeta con ayuda de la esfera candente (d, e, f) a un diámetro final de
20 a 30 m.
La eficacia de la producción de quimeras como así también el porcentaje de células ES en los tejidos
somático y reproductivo dependen esencialmente de la calidad de las líneas celulares ES pero también
del origen genético de los embriones receptores. De esta forma los blastocistos de la línea C57BI/6 se
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adecuan muy bien para la inyección de células ES de la línea 129 (SCHARTZ-BERG y col., 1989;
resultados propios no publicados; foto 5, tabla 1). NAGY y col. (1990) pudieron producir quimeras a
partir de células ES y embriones tetraploides. En las quimeras se pudo comprobar su completo origen
de células ES. Los animales murieron, sin embargo, poco después del nacimiento por razones no
establecidas.
La colonización de la hilera germinal a través de células ES fue observada por primera vez por
BRADLEY y col. (1984). Un factor de importancia en ese sentido es el cariotipo de las células ES
(BRADLEY, 1990). Mientras las traslocaciones y trisomías sólo tienen un efecto reducido sobre el
porcentaje de células ES en tejidos somáticos, la participación en los tejidos de la hilera germinal es
muy improbable.
Células embrionarias totipotentes de la hilera germinal
A partir de las experiencias descriptas en el ratón, diferentes grupos de trabajo intentaron establecer
líneas celulares totipotentes a partir de embriones bovinos, porcinos, caprinos y ovinos. Las primeras
publicaciones sobre la aislación de líneas celulares contínuas de embriones bovinos y ovinos datan del
año 1987.
Foto 4: Inyección de células primordiales embrionarias en un
blastocisto, a) antes de la inyección; b) colocación de la pipeta en el
límite entre dos células trofoectodérmicas; c) inyección de 8-10
células ES; d) el blastocisto se colapsa luego de retirar la pipeta
STRINGFELLOW y col. (1987) cultivaron un embrión bovino de 11 dias, obtenido en forma no
quirúrgica, en medio Ham's F-20 (100 ml suplementado con 10 ml de suero fetal bovino, 11 mg Piruvato
de Na, 0,5 mg insulina y 10 l EGF). Después de 13 días se estableció una monocapa (monolayer), que
fue separada con 0,4% de Tripsina en medio PBS libre de Ca2+ y Mg2+ y nuevamente cultivada. Nueve
días después 50% de las células mostraron confluencia. Esa línea celular pudo ser mantenida en el
medio de cultivo hasta el pasaje 38 (1:2 respectivamente). Las células mono- y binucleares fueron
consideradas morfológicamente similares a las trofoblásticas. Los mismos autores lograron, poco
después, establecer una línea celular totipotente (BE12-6) bajo las mismas condiciones y con
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morfología comparable a la anterior que ha podido mantenerse en cultivo más de 200 pasajes y que
actualmente es considerada inmortal (STRINGFELLOW y col., 1991).
Foto 5: Quimeras en la hilera germinal, producto de la
inyección de células ES D3 (agutí) en blastocistos Balb/c
(albino)
HANDYSIDE y col. (1987) trataron de establecer células ES de ovino. Los autores aislaron masas
celulares internas (MCIs) de embriones de 6 y 8 días de la raza Welsh Mountain a través de
inmunocirugía y las cultivaron intactas o desmenuza-das (3-5 min en 0,25% de Tripsina, 1 mM EDTA
Na2, 1% suero de pollo en PBS libre de Ca2+ y Mg2+) con células fibroblásticas de la línea STO o de la
piel de ovino (TGskin) inactivadas con mitomicina en 60% de medio CMß condicionado con BRL
(microgotas de 20 l bajo parafina, a 37o C, 5% CO2/95% aire). Los autores emplearon en total 60
embriones (16 mórulas o blastocistos tempranos, 30 expandidos y 14 protruidos). Una evaluación
morfológica de los embriones (cortes semifinos, microscopia electrónica) mostró diferencias entre las
células de la MCI adyacentes al blastocele del resto de sus células. En las primeras los autores
observaron estadios tempranos de diferenciación endodérmica en los blastocistos con zonas intactas,
mientras que en los blastocistos protruidos fue posible reconocer un endodermo claramente
diferenciado. Una aislación de la MCI a través de cirugía inmunológica fue más simple de llevar a cabo
en blastocistos expandidos con zona intacta. Después de la adhesión de las células de la MCI
(comprendiendo cerca de 43 células) se produce un aplanamiento de la colonia celular y no un cilindro
oval como en el ratón. La división celular fue reducida en extremo comparada con el ratón. Algunos
grupos de células, semejantes en un inicio a las células ES de ratón fueron cubiertas enteramente por
células de apariencia endodérmica que formaron estructuras quísticas. Después del primer pasaje no se
encontraron colonias semejantes a las células ES presentes. REXROAD (1990) cultivó embriones
ovinos (d 7-9) y MCIs, obtenidas a través de cirugía inmunológica sobre fibroblastos STO o fibroblastos
embrionarios ovinos. A partir de las MCIs se originaron con mayor eficacia colonias primarias que a
partir de embriones intactos, independientemente de la edad de los embriones y del tipo de células
nutrientes que se emplearon.
PIEDRAHITA y col. (1988) llevaron a cabo ensayos orientados a aislar del cerdo células semejantes a
las ES. Los autores cultivaron embriones de 7 a 8 dias (dia 0 = primer día del celo) en DMEM sobre
fibroblastos STO inactivados por medio de rayos x. El medio fue suplementado con 10% SFB, 0,1
mmol/l 2-mercapto-etanol, 2mml/l L-glutamina y antibióticos. Colonias similares morfológicamente a las
colonias ES fueron cambiadas de medio cada 7-10 días. De 118 MCIs 84 sobrevivieron las
manipulaciones y 3 líneas pudieron ser mantenidas hasta el 10o pasaje. Una de las 3 líneas tenía
morfología de las células ES, las otras 2 estaban compuestas de células similares a las ES y epiteliales.
De 25 embriones cultivados se establecieron 8. Se pudieron establecer 2 líneas que sobrevivieron 10
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pasajes. Ambas líneas contenían células trofoblásticas como así también una pequeña parte de células
similares a las ES. STROJEK y col. (1990) evaluaron el efecto de la edad de los embriones y diferentes
medio de cultivo sobre la formación de células ES. Mientras que con embriones de 9 días no se
obtuvieron resultados positivos se desarrollaron 14 colonias a partir de 69 embriones de 10 días de
edad. Estas colonias provenían, según los autores, de la MCI. El cultivo de los embriones y su
adherencia se lograron sobre fibroblastos de útero de cerdo y no sobre fibroblastos STO. Los autores
sospecharon en una interacción química no definida aún como la razón de ese fenómeno. Los pasajes
posteriores pudieron llevarse a cabo, sin embargo, sobre fibroblastos STO. El medio de cultivo más
adecuado fue el DMEM suplementado con 10% de SFB, 10% de suero de cerdo, 0,2 mg/ml de insulina
bovina y 0,1 mM 2-mercaptoetanol. En total se pudieron expandir 7 colonias mediante 3 a 5 pasajes y
las líneas resultantes pudieron ser congeladas.
EVANS y col. (1990) y NOTARIANNI y col (1991) emplearon blastocistos expandidos de la raza Large
British White para producir células embrionarias totipotentes. Fueron cultivados los embriones intactos o
las MCIs después de su aislación mecánica en medio DMEM modificado (+ 10% de suero de ternero +
5% de SFB + 10-4 mol/l 2-mercaptoetanol + antibióticos) sobre fibroblastos STO inactivados con
mitomicina. Los autores observaron el crecimiento de los embriones y de las MCIs aisladas sobre las
células nutrientes (fibroblastos STO), contrariamente a lo encontado por STROJEK y col. (1990). Al
principio se observó el desarrollo de células epiteloides (grandes, aplanadas, translúcidas), mientras
que después del primer pasaje (7-14 dias después del comienzo del cultivo) se observaron colonias de
dos tipos. El primer grupo, formado por pequeñas colonias, se caracterizó por células grandes
indiferenciadas de las cuales surgían células gigantes similares a las trofoblásticas. Las células del
segundo grupo fueron caracterizadas de acuerdo a los criterios morfológicos (células con un núcleo
translúcido claro, nucléolo visible y poco citoplasma) como células similares a las ES. Estas formaron
grandes colonias. Como criterio bioquímico del estatus indiferenciado de esas células se demostró la
falta del filamento intermediario Vimentin a través de una prueba de fluorescencia. Esas células
pudieron ser mantenidas en cultivo cerca de un año, sin alteraciones morfológicas, con pasajes
semanales. Los ensayos de diferenciación in vitro indicaron diferencias claras con respecto a la
morfología de las cuerpos embrioides en relación con el ratón. Sin embargo las células se diferenciaron
en las 3 capas embrionarias (epitelio, endotelio, células musculares y nerviosas) sobre un substrato
adhesivo. La comprobación de la totipotencia in vivo de las células similares a las ES, a través de la
producción de quimeras, no fue publicada hasta el momento. NOTARIANNI y col. (1990) lograron
establecer, en la especie ovina, una línea similar a la ES empleando las mismas condiciones de cultivo.
PIEDRAHITA y col. (1990a) estudiaron el efecto de diferentes células nutrientes sobre la eficiencia de la
producción de líneas celulares embrionarias de cerdo. En ese experimento se emplearon fibroblastos
STO, células BRL, combinación de esos cultivos (9:1 y 1:1), fibroblastos embrionarios primarios de
cerdo (PEF) y ratón (MEF), PEF en combinación con células BRL, células epiteliales uterinas de cerdo y
células epiteloides aisladas de embriones porcinos. Los fibroblastos STO fueron evaluados en
combinación con medio condicionado con células BRL. La aislación de células epiteloides como
también de líneas celulares similares a la ES se logró exclusivamente sobre células fibroblásticas STO
con y sin medio condicionado con células BRL. Los autores no pudieron mejorar las condiciones de
cultivo establecidas por EVANS y col. (1990). Mientras PIEDRAHITA y col. (1990a) confirmaban la
aparición de diferentes tipos celulares después de la desagregación de MCIs proliferadas y adheridas,
resultaron divergencias en el potencial de diferenciación de las líneas celulares de tipo epitelial y
similares a ES. En las primeras se formaron estructuras en cultivos de suspensión que fueron
consideradas análogas de los cuerpos embrioides de ratón. Las líneas celulares similares a la ES, por
el contrario, no mostraron diferenciación in vitro alguna.
En un estudio posterior PIEDRAHITA y col. (1990b) pudieron comprobar el status indiferenciado de las
células similares a las ES dado que éstas no exprimieron Vimentina ni Citoqueratina 18. El intento de
establecer paralelamente en el mismo trabajo líneas celulares ovinas fue menos exitoso, las células
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pudieron mantenerse vivas sólo 3 pasajes como máximo. El estudio de MEINECKE-TILLMAN y
MEINECKE (1991) con el objeto de establecer líneas celulares pluripotentes a partir de embriones
ovinos, caprinos y porcinos comparó diferentes células nutritivas (fibroblastos de hígado, riñón y
testículo fetales de bovino; células granulosas de porcino y bovino; células epiteliales de útero y
oviducto de oveja, cabra y cerda como así también fibroblastos STO). Principalmente con el empleo de
fibroblastos embrionarios de hígado de bovino los autores pudieron establecer líneas embrionarias
totipotentes de las tres especies estudiadas e incluso mantenerlas por varios meses en cultivo. El
trabajo no contiene, sin embargo, información más detallada de la caracterización de esas líneas
celulares. STROJEK y col. (1991) emplearon embriones obtenidos el día 7 in vivo o producidos in vitro
para la producción de células totipotentes. Los autores evaluaron el efecto de diferentes medios (DMEM
y BME/Ham's F 10 (1:1), cada uno suplementado con 5 y 20% de SFB, 10% de suero de ternero
neonato y 10-4 mol/l 2-mercaptoetanol), células nutrientes (fibroblastos embrionarios primarios de ratón
y células primarias de la granulosa de vaca) y diferentes presiones de oxígeno (5 y 20%) sobre la
protrusión, fijación y diferenciación de los blastocistos. Los mejores resultados de protrusión se
obtuvieron sin células nutrientes en BME/Ham's F 10 con 5% de CO2 en atmósfera de aire a una
temperatura de 39o C. Por otro lado el empleo de células nutrientes tuvo un efecto positivo sobre la
fijación de los blastocistos protruidos. En ese sentido los autores diferencian 2 tipos de fijaciones: el tipo
A caracterizado por un crecimiento radial de las células trofoectodérmicas (fig. 10), el tipo B mostró la
fijación de la MCI con degeneración de las células trofoectodérmicas.
Aunque bajo particulares condiciones de cultivo se produjo una fuerte proliferación de las células
trofoectodérmicas, en ningún caso se observó una proliferación de la MCI. No se observaron diferencias
entre los embriones producidos in vivo o in vitro. La falta de proliferación de las masas celulares
internas de embriones bovinos fue publicada anteriormente por SCHELLANDER y col. (1989), quienes
trabajaron bajo condiciones similares. En un ensayo posterior los autores observaron el efecto positivo
de LIF sobre la proliferación de MCIs de blastocistos bovinos cuando éstos fueron cultivados sin células
nutrientes en medio DMEM modificado. Sin embargo, el intento de establecer líneas celulares no tuvo
éxito (HASSAN-HAUSER y col., 1990).
Foto 6: Blastocisto bovino después de 10 días de cultivo
(tipo de fijación A: células trofoectodérmicas de
crecimiento radial, MCI en posición central)
STRELCHENKO y colaboradores lograron, por otra parte, aislar líneas celulares similares a las ES a
partir de MCI de embriones bovinos (SRELCHENKO y col., 1991; SAITO y col., 1992). Los autores
cultivaron 11 hemi-embriones, resultado de la división de 6 embriones de 7 días obtenidos por medios
no quirúrgicos, en TCM 199 suplementado con 10% de suero de ternero neonato sobre fibroblastos
embrionarios primarios de ratón, inactivados con mitomicina. Tres embriones se fijaron de acuerdo al
tipo A, en los cuales no sólo se observó la proliferación de las células del trofoectodermo sino también
un crecimiento de la MCI. Esta fue disociada con tripsina a los 7 días y colocada sobre células
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nutrientes frescas. Los autores emplearon, a partir de ese momento, medio MEM modificado con 10%
SFB, 10-4 mol/l 2-mercaptoetanol como también 4,5 g/l de glucosa. Un 30% del volumen de ese medio
fue condicionado sobre células LIF de la línea 5637 en proliferación. Después de 5 días las primeras
colonias similares a las ES fueron visibles. A partir de ellas se pudieron producir 2 líneas que
sobrevivieron 4 pasajes. Una serie tóxica de SFB eliminó las células producidas sin que se pudiese
comprobar su totipotencia in vitro e in vivo. En la tabla 2 se presentan los diferentes medios de cultivo
empleados exitosamente en la producción de líneas celulares similares a las ES a partir de embriones
de animales de interés productivo. Es importante destacar, sin embargo, que los resultados alcanzados
en la especie murina aún no han podido ser alcanzados por las especies domésticas. Como razón de
esa diferencia se discute el diferente desarrollo después de la implantación entre el ratón y los
ungulados. Mientras en el embrión de ratón ocurre una rápida proliferación de la MCI después de la
implantación, el disco embrionario de las especies unguladas se mantiene inicialmente en inactividad
mitótica (NOTARIANNI y col., 1990).
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Tabla 2: Ensayos exitosos para producir líneas celulares similares a la ES de animales domésticos
EVANS Y COL. (1990)
NOTARIANI Y COL.
(1990/1991)
Autor
PIEDRAHITA y col. (1990a,b)
STROJEK Y COL.(1990)
STRECHELKO y col.
(1991)
Especie
Material empleado
Células nutrientes
Porcina, ovina, bovina
Blastocistos y MCIs d 7-9
Fibroblastos STO
Porcina
MCIs de embriones d 7-8
Fibroblastos STO
Porcina
Embriones d 10
Fibroblastos de útero
porcino (FUP)
Medios de cultivo
DMEM
DMEM
DMEM
L-Gln [mmol/l]
-
2
-
Bovina
Embriones divididos d 7
Fibroblastos
embrionarios murinos
(FEM)
TCM 199
(Para el cultivo inicial
MEM-Alfa
(Cultivos posteriores)
-
2-ME [mmol/l]
0,1
0,1
0,1
0,1
Antibiótico
Si
Si
Si
S. i.
Otros agregados
-
Medio cond. BRL
Temperatura [ C]
S. i.
S. i.
0,2 g/l Insulina, Nucleótidos,
aminoáci-dos no esenciales
S. i.
4,5 g/l Glucosa
Medio 5673-condionado
S. i.
CO2 [%]
S. i.
S. i.
S. i.
S. i.
O2 [%]
S. i.
S. i.
S. i.
S. i.
Medio base
S.i.: sin información; L-Gln= L=-Glutamina; 2-ME= 2-Mercaptoetanol; SF = suero de ternero; SFB = suero fetal bovino; SP = suero porcino
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180
Aplicaciones de las células embrionarias totipotentes
Las células ES del ratón se emplean en la actualidad casi en forma de rutina como vectores en la
transferencia de genes para la producción de modelos animales con modificaciones génicas
determinadas. Dado que la integración del gen en las células de los mamíferos se produce al azar, la
tasa de recombinación homóloga/integración al azar es de alrededor de 13-3 (FROHMAN y MARTIN,
1989; MELTON, 1990). Esa frecuencia de recombinaciones homólogas es muy baja para llevar a cabo
la alteración del genoma a través de la microinyección del gen en el pronúcleo. Por esa razón se opta
por el empleo de las células embrionarias totipotentes, a las que se les ha transfeccionado el gen
deseado y se evalúa la integración en el lugar adecuado. En esos ensayos se emplearon, en la mayoría
de los casos, líneas ES con cariotipo masculino (por ejemplo: B. E14TG2a, CCE, D3, CC1.2). Para lo
cual existe una serie de razones (MANSUR, 1990):
- Las líneas celulares masculinas ES parecen ser más estables en cultivo que las femeninas.
- Solamente a partir de células ES masculinas pueden originarse espermatozoides funcionales. Dado
que la descendencia es más numerosa es más fácil detectar quimeras masculinas que femeninas,
respecto a la presencia de células ES en la hilera germinal.
- Cuando células ES masculinas son inyectadas en un blastocisto femenino y las células totipotentes
forman una parte importante del organismo se produce una conversión del sexo. Esto significa que
se produce un macho. En ese caso la hilera germinal es formada en un 100% por células ES.
La electroporación es el método de elección para la transfección de células ES, dado que en
condiciones experimentales óptimas se integra sólo una copia del vector de ADN (THOMAS y
CAPECCHI, 1987). Los vectores deben estar acompañados de un gen marcador, dada la baja
frecuencia de integraciones estables (10-5-10-2), a partir de la cual puedan ser seleccionadas las
células. En la mayoría de los casos se emplea el gen bacteriano de la Neomicina fosfotransferasa
(neo®). El medio de selección contiene G418. Como forma alternativa a la electroporación se empleó la
microinyección de ADN (ZIMMER y GRUSS, 1989). Ese método permite producir un alto porcentaje de
células transformadas estables (10-20%), sin embargo la ejecución es muy complicada. THOMAS y
CAPECCHI (1987) desarrollaron 2 diferentes tipos de vectores, que emplearon para la disrupción del
gen HPRT (fig. 5).
A
B
Neo
9
6
6
9
Neo
7
1
2 3
4 5
6 78
9
1
2 3
reemplazo de
secuencia
2 3
4 5
hprt- G 4 1
6 78
9
hprt
hprt
1
4 5
6 7 Neo
9
inserción de
secuencia
1
2 3
4 5
6 7 8Neo
9
6 78 9
hprt- G 4 1
Fig 5: Vector para un transferencia génica con un objetivo determinado (según CAPECCHI, 1989)
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Células embrionarias primordiales
181
Los denominados genes de inserción tienen una fractura en la doble hélice en el lugar correspondiente
a la secuencia homóloga del gen endógeno. Si se produce cross over en el momento de la
yuxtaposición del gen endógeno, se integrará todo el vector en el gen endógeno y las secuencias de
ambos se presentan en forma doble. Por otra parte existen vectores complementarios, co-lineales a la
secuencia endógena, que contienen una determinada mutación y que reemplazan al gen endógeno a
través de un cross-over doble.
La frecuencia de clones homólogos recombinados puede ser aumentada en genes que ya son
exprimidos en las células ES si se renuncia a las secuencias promotoras tanto en zona homóloga del
vector como también del Gen neo®. Si se produce la recombinación las secuencias en el vector entran
bajo el control del promotor del gen endógeno el gen neo® se exprimirá. De otra forma se logra la
expresión con una integración al azar y gran parte de las células mueren durante la selección con G418
(MASOUR, 1990).
Con genes que no se exprimen en las células ES se emplea otra estrategia conocida como selección
positiva-negativa (SPN). Ese método propuesto por MASOUR y col. (1988) se basa en dos supuestos:
-
la integración al azar de un una estructura génica lineal ocurre al final de la estructura, mientras
la recombinación homóloga tiene lugar dentro de la zona homóloga a través de cross-over.
Estructuras génicas lineales que no contienen al final secuencias homólogas están en
condiciones de recombinarse en forma homóloga eficientemente
Un vector SPN contiene además del gen neo® como secuencia selectiva positiva dentro de la zona
homóloga, un marcador contra el cual se puede seleccionar en forma negativa. Un ejemplo de ello es el
gen de la Timidinquinasa (VHS-tq) del virus Herpes simplex que está ubicado distal a la región
homóloga (fig. 6).
Si se lleva a cabo la recombinación se pierde la zona que incluye el gen VHS-tq. En el caso de una
integración al azar permanece esa región y las células que expresan el gen VHS-tq mueren mediante
selección con Ganciclovir. Con ese método se pudo aumentar los clones recombinantes por el factor 10
hasta 12500 (MASOUR, 1990). Clones positivos se identifican con ayuda de la sonda de ADN
(polimerase-chain reaction, PCR) como así también por medio del análisis Southern-Blot. Luego se
reproducen para ser inyectados a blastocistos y producir quimeras transgénicas.
Si las células embrionarias totipotentes en esos animales colonizan también la hilera germinal se
produce descendencia heterocigota, después del apareamiento con animales no transgénicos. Esta
puede ser empleada para producir animales y líneas transgénicas homocigotas. Cambios fenotípicos en
portadores homocigotas de cambios genéticos inducidos permiten hacer deducciones sobre la función
del gen en estudio y sus productos. Con ese método fueron inactivados y caracteriza-dos interesantes
genes de importancia biológica y evolutiva en el ratón (tabla 3).
Células ES fueron empleadas también para buscar importantes genes o secuencias regulatorias de
ADN, hasta el momento desconocidos, para la diferenciación durante la ontogénesis (GOSSER y col.,
1989; FIEDRICH y SORIANO, 1991). Con ese objetivo se transfeccionaron células ES con
construcciones (estructuras) génicas, las cuales junto a un marcador selectivo positivo (en el mayor de
los casos neo®) contienen el gen de la -galactosidasa bacteriana (lacZ) con una zona promotora
mínima (enhacer trap) o bien sin promotor (promotor trap, fig 13). Los clones que integran esa
estructura génica se emplean en la producción de quimeras. La expresión del gen lac Z puede hacerse
visible por medio del cronogen X-gal, cuyo fraccionamiento provoca una coloración azul. De esta forma
el gen puede ser determinado en diferentes estadios embrionarios. En el caso que se establezca un
modelo de expresión interesante, es posible clonar las zonas responsables a partir del gen lac Z. En las
estructuras del promotor Trap se produce la expresión del gen lac Z sólo si éstas se integran en la zona
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182
de influencia del promotor endógeno y con ello interrumpen el gen endógeno correspondiente. Si se
logran producir quimeras de la hilera germinal con esa línea puede caracterizarse, entonces, el gen
endógeno interrumpido a través de la reproducción y evaluación del fenotipo de los portadores hetero- y
homocigotas, no sólo estructural sino funcionalmente.
neor
Gene targeting
Pint-2-N/TK
HSV-tk
int-2+
neor
Int-2- neor HSV - tk- (G4 1 8r, GANCr )
Integración al azar
neor
neor
HSV-tk
HSV-tk
Int - 2+ neor HSV - tk+ (G4 1 8r, GANCS)
Fig 6: Vector para una
CAPECCHI, 1989)
selección
positiva-negativa
(según
Las aplicaciones descriptas de las células embrionarias totipotentes pueden llevarse a cabo en principio
en las especies animales de interés zootécnico, si se logran establecer líneas celulares funcionales. La
fig 8 describe un modelo de producción de bovinos transgénicos aplicando líneas celulares pluripotentes
(BREM, 1986). Además surge la interesante posibilidad de evaluar la expresión de transgenes
integrados al azar en las células ES o en sus derivados diferenciados para emplear sólo clones
adecuados para producir quimeras transgénicas. Este es el punto decisivo considerando la baja
eficiencia de la producción de individuos transgénicos a través de la microinyección de ADN en el
pronúcleo de los animales de interés productivo frente a los ratones (BREM, 1988). Contrariamente a la
obtención de embriones uni- o bicelulares, los embriones requeridos para obtener células totipotentes
para la transferencia génica pueden ser obtenidos en la especie bovina en forma no quirúrgica. EVANS
y col. (1990) además someten a discusión a las células ES frente a la posibilidad de llevar a cabo
intervenciones complejas en el genoma con el fin de variar características controladas por varios genes.
Tabla 3: Ejemplos de la producción de ratones con cambios genéticos establecidos con el empleo de
células ES como vectores para la transferencia génica
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Células embrionarias primordiales
183
Gen
Linea
celular ES
Donante de
blastocistos
Quimera de la
hilera germinal
Literatura
Hox-1.1
D3
C57Bl/6
Hox-1.5
CC1.2
C57Bl/6
3
CHISAKA & CAPECCHI, 1991
Hox-1.6
D3
C57Bl/6
3
LUFKIN Y col., 1991
En-2
D3
CD1
-
JOYNER Y col., 1989
C57Bl/6
-
ZIMMER & GRUSS, 1989
ß2-microglobulina
D3
C57Bl/6
6
ZIJLSTRA y col., 1989/90
N-myc
D3
C57Bl/6
4
STANTON y col., 1990
HPRT
E14TG2a
C57Bl/6JLac x
CBA/CaLac
19
HOOPER y col., 1987
HPRT
CCE
MF1
11
KUEHN y col., 1987
HPRT-
E14TG2a
C57Bl/6/Ola x
CBA/Ca/Ola
1
THOMPSON y col., 1989
HPRT-
ES98-12
C57Bl/6
2
KOLLER y col., 1989
Wnt-1
(int-1)
AB-1
C57Bl/6
19
McMAHON & BRADLEY, 1990
IGF II
CCE.33
CD-1
-
DeCHIARA y col., 1990/91
MF1
3
C57Bl/6
4
MHC
Class II
D3
C57Bl/6
si
COSGROVE y col., 1991
c-abl
CCE
CD-1
0
SCHWARTZBERG y col., 1989/91
MF1
0
C57Bl/6
6
c-abl
CCE
C57Bl/6
1
TYBULEWICZ y col., 1991
IL-2
E14
C57Bl/6
3
SCHORLE y col., 1991
c-src
AB2.1
C57Bl/6
14
SORIANO y col., 1991
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184
Enhancer trap
neo
E
P
neo
gene x
Transcripción
Lac Z protein
neo protein
Translación
Promotor trap
S
P
neo
Integración en el interior del gen x en la
orientación y marco de lectura correctas
ATG
E
P gene x
S
Lac Z fusion protein
P
neo
neo protein
Fig 7: Vectores "Enhacer trap" y "promoter trap" según ROSSANT y JOYNER (1989). Los mismos
contienen como marcador de selección el gen neo y un gen lacz (zona negra) para el
reconocimiento de las regiones inductoras de trascripción con una zona promotora mínima o
reducida
El primer paso es la producción de células pluripotentes. Como donantes de embriones se eligen
madres de toros (MT), apareadas con padres de toros (PT) para alcanzar un nivel genético equivalente
al de los toros de prueba. Las células plirupotentes son transfeccionadas in vitro, la integración y
expresión analizadas y finalmente son empleadas para la producción de quimeras. Las mórulas y
blastocistos receptores se obtienen de las madres de madres apareadas con padres de madres. Los
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Células embrionarias primordiales
185
terneros nacidos son evaluados en su capacidad de transmitir las nuevas cualidades genéticas. La
descendencia de la línea celular son medio hermanos paternos, que poseen la mitad de los genes del
apareamiento programado y heterocigotas con respecto al gen transferido.
ADN clonante
(homólogo-heterólogo)
Plasmidio
BB
KB
Bacteria
transforma
Transferencia de genes
en cultivos celulares
Implantación ectópica
Líneas
celulares (♂)
ADN
clonado
BK
Teratoma
KK
Quimera
Población
Quimera
Medio-hermanos paternos
transgénicos
Fig 8: Modelo para la producción de animales transgénicos a través de la producción de quimeras a
partir de embriones y células de teratocarcinoma (BREM, 1986):
SIMS y FIRST (1993) informaron por primera vez sobre gestaciones producidas con células germinales
totipotentes. De 12 líneas celulares (tabla 4), los autores obtuvieron 10 por medio de cirugía
inmunológica de la masa celular interna de 3 blastocistos producidos in vitro. Se logró establecer 3050% de líneas celulares, no fueron observadas diferencias en la habilidad de las MCIs en establecer
esas líneas. Después del cultivo de los complejos fusionados en medio CRaa+selenio, insulina y
transferrina + 5% de SFB se obtuvieron 109 (24%) blastocistos.
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Tabla 4: Blastocistos (d7) producidos con la transferencia nuclear de células germinales totipotentes
(ES)
Días después de la
inmunocirugía
No. de líneas
celulares
Blastocistos/
complejos fusionados
Blastocistos %
0-14
4a,b,c,
26/102
26
15-28
5a,b,c
47/213
22
29-42
2a,b,c
14/55
25
42-56
1*
6/21
29
57-70
1*
8/36
22
71-84
1
4/18
22
99-112
1a
4/15
27
1 dias después de la inmunocirugía a partir de la transferencia nuclear
* de un blastocisto
a,b,c, líneas celulares con (a) transferencia de embriones, (b) preñeces, (c) fetos de 220 dias
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