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INTERACCIÓN DEL
SUPLEMENTO SELECTIVO
E.COLI/COLIFORMES CON
FILTROS DE MEMBRANA
Edurne Gorostiaga
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E.COLI Y COLIFORMES
• La presencia y el nivel de contaminación fecal constituyen un factor
importante en la evaluación de la calidad de una masa de agua y
del riesgo de infección que representa para la salud humana.
• El análisis de muestras de agua para detectar la presencia de
Escherichia coli, que normalmente habita en el tracto intestinal de
hombres y otros animales de sangre caliente, proporciona una
indicación de este tipo de contaminación.
• Los resultados del análisis de bacterias coliformes son más difíciles
de interpretar ya que algunas bacterias coliformes viven en el suelo
y en las aguas dulces superficiales y por lo tanto no tienen siempre
origen intestinal.
• La presencia de bacterias coliformes, aunque no pruebe de forma
concluyente una contaminación de origen fecal, si puede indicar
fallos en el tratamiento o en la distribución del agua.
2
E.COLI Y COLIFORMES
•
Bacteria coliforme:
– Miembro de la familia Enterobacteriaceae
que expresa el enzima B-D-galactosidasa.
•
Escherichia coli:
– Miembro de la familia Enterobacteriaceae
que expresa los enzimas B-D-galactosidasa
y B-D-glucuronidasa.
•
anexo A de la ISO 9308, las bacterias coliformes son bacterias Gram
negativas, no formadoras de esporas, oxidasa negativas y con forma de
bastoncillo, que pueden crecer en medio aerobio y anaerobio facultativo
en presencia de sales biliares y que, normalmente, son capaces de
fermentar lactosa con producción de ácido y aldehído en 48 h cuando se
incuban a una temperatura de (36± 2)ºC. Las bacterias E.coli son
bacterias coliformes capaces de producir indol a partir de triptófano, en
(21±3)h a (44±0.5)ºC.
3
E.COLI Y COLIFORMES
1)fermentación de la lactosa con producción de ácido y gas
2)fermentación ácida de la lactosa
3)enzima B-Galactosidasa
4
CHROMOCULT
•
•
•
El Chromocult es un medio de
cultivo selectivo para la
detección y recuento de
coliformes y de E.coli. Contiene
una combinación de dos
sustratos cromogénicos de
manera que se hace posible la
detección simultánea de los dos
tipos de bacterias coliformes.
La enzima característica de los
coliformes, ß-D-Galactosidasa No coliforme
se fija en el sustrato SalmonGAL y es la causa del color rojo
de los coliformes.
coliforme
E.coli
La enzima característica de los
E.coli, ß-D-Glucuronidasa se
fija en el sustrato XGlucuronida y es la
responsable de que las colonias
positivas E.coli presenten un
azul oscuro o violeta.
5
Suplemento E.coli/coliformes
• El suplemento E.coli/coliformes es una mezcla de dos inhibidores;
la vancomicina inhibe el crecimiento de bacterias grampositivas,
mientras que la cefsulodina suprime Pseudomonas spp. y
Aeromonas spp.
• La composición por frasco es de 2.5mg de vancomicina y 2.5mg de
cefsulodina. El liofilizado se resuspende con 2ml de agua destilada
y se agrega a 500ml de medio cultivo estéril (chromocult).
• La cefsulodina es un antibiótico perteneciente al grupo de las
cefalosporinas de tercera generación.
• La vancomicina es un antibiótico perteneciente al grupo de los
glucopéptidos. Posee un espectro restringido fundamentalmente a
bacterias grampositivas. Prácticamente todos los bacilos
gramnegativos y micobacterias son resistentes a vancomicina, así
como ciertos grampositivos.
6
FILTRACIÓN MEMBRANA
• Filtrar 100ml de agua
a través de una
membrana de 0.45µm
de poro.
• Tras la filtración se
coloca el filtro en la
placa de medio de
cultivo Chromocult y
se incuba durante 1824 horas a 37±1ºC.
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SUPLEMENTO E.COLI/COLIFORMES
•
Preparamos chromocult al que añadimos diferentes volúmenes de
suplemento. Sobre estos medios ensayamos la recuperación de E.coli
NCTC 9001(vr=53ufc) mediante filtración por membrana.
Ch sin
supl.
Ch +.3 ml
supl.
Ch + 2ml
supl.
5mg/L
Ch + 1ml
supl.
Ch + 0. 5ml
supl.
ufc
50
9
9
27
37
ufc
51
8
13
18
39
Media
50.5
8.5
11
22.5
38
Recuperación
95%
16%
21%
42%
72%
En el certificado del producto (suplemento E.coli-coliformes) se
especifica que por cada 500ml de medio de cultivo se añade 2ml de
suplemento. A esta concentración de suplemento observamos que la
recuperación obtenida es del 21%.
8
CEFSULODINA
•
•
Decidimos probar la eficacia de estos dos antibióticos por separado
para ver la recuperación de E.coli ya que nos interesa disponer de un
medio de cultivo en el que la mayor parte de flora acompañante sea
inhibida.
Preparamos chromocult al que añadimos diferentes cantidades de
cefsulodina. Esta se hidrata de igual manera que el suplemento
E.coli/coliformes. Sobre estos medios se ensaya la recuperación de E.coli
NCTC 9001.
Ch sin antib.
Ch + 3 ml ant.
Ch +2ml ant.
Ch +1ml ant.
Ch + 0. 5ml ant.
ufc
67
67
69
76
63
ufc
70
67
67
69
67
Media
68.5
67
68
72.5
65
9
CEFSULODINA
•
De acuerdo con estos resultados se observa que la cefsulodina no afecta a
la recuperación de E.coli
•
Se prueba el medio chromocult con cefsulodina en muestras naturales.
– En muestras tratadas, la mayor parte de flora acompañante es inhibida,
creciendo únicamente algunas colonias color crema.
– Las colonias presuntas E.coli y coliformes crecen igualmente en ambos
medios (chromocult con y sin cefsulodina).
– Al utilizar este antibiótico en captaciones (aguas brutas) la mayor parte
de flora acompañante no es inhibida. Crecen muchas colonias cremas y
rosas de todo tipo, lo cual dificulta la posterior confirmación de los
posibles E.coli y coliformes.
10
VANCOMICINA
•
Preparamos chromocult al que añadimos diferentes cantidades de
vancomicina. Esta se hidrata de igual manera que el suplemento
E.coli/coliformes.
•
Sobre estos medios se ensaya la recuperación de E.coli NCTC 9001,
E.coli ATCC 8739 y K.oxytoca ATCC 49131.
E.coli NCTC 9001
Ch sin antib.
Ch +2ml ant.
Ch + 1ml ant.
Ch + 0. 5ml ant.
ufc
71
27
18
37
ufc
70
10
26
35
Media
70.5
18.5
22
36
26%
31%
51%
Recuperación
E.coli ATCC 8739
TSA
Ch sin antib.
Ch +2ml
ant.
Ch + 1ml
ant.
Ch + 0. 5ml
ant.
ufc
50
57
13
11
28
ufc
68
56
10
24
46
Media
59
56.5
11.5
17..5
37
95.8%
19.5%
29.7%
62.7%
Recuperación
11
VANCOMICINA
K.oxytoca ATCC
49131
TSA
Ch +2ml ant.
Ch + 1ml ant.
Ch + 0. 5ml ant.
ufc
36
29
29
36
ufc
33
45
25
28
Media
34.5
34.5
27
32
100%
78%
93%
Recuperación
Según añadimos mayor volumen de vancomicina la recuperación de
E.coli va disminuyendo. Aún añadiendo tan sólo 0. 5ml de antibiótico
obtenemos una recuperación baja.
No podemos utilizar este antibiótico en ninguna concentración para la
recuperación de E.coli.
La recuperación de K.oxytoca es en todos los casos superior al 70%.
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MR: E.coli NCTC9001; valor referencia: 53ufc
Chromocult sin
antibiótico
ufc contadas en
placa
Media
Recuperación %
Recuperación
respecto al Ch.sin
antibiótico
67
71
50
70
70
51
63,2
119,2
Chromocult +2ml antib.
Chromocult +1ml antib.
Chromocult +0,5ml antib.
5mg/L
2,5mg/L
1,25mg/L
cefsulodina vancomicina suplemento cefsulodina vancomicina suplemento cefsulodina vancomicina suplemento
69
27
9
76
18
27
63
37
37
67
10
13
69
26
18
67
35
39
68
128,3
18,5
34,9
11
20,8
72,5
136,8
22
41,5
22,5
42,5
65
122,6
36
67,9
38
71,7
107,6
29,3
17,4
114,7
34,8
35,6
102,8
57,0
60,1
E.coli ATCC8739; TSA: 45 y 55 valor referencia: 50ufc
Chromocult sin
antibiótico
ufc contadas en
placa
Media
Recuperación %
46
54
50,0
100,0
Chromocult +2ml antib.
5mg/L
vancomicina
1
0
0,5
1,0
Chromocult +1ml antib.
2,5mg/L
vancomicina
1
4
2,5
5,0
Chromocult +0,5ml antib.
1,25mg/L
vancomicina
31
19
25
50,0
Chromocult +1ml antib.
2,5mg/L
vancomicina
56
51
53,5
97,3
Chromocult +0,5ml antib.
1,25mg/L
vancomicina
51
46
48,5
88,2
K.oxytoca ATCC49131; TSA: 56 y 54 valor referencia: 55ufc
Chromocult con
antibiótico
ufc contadas en
placa
Media
Recuperación %
33
46
39,5
71,8
Chromocult +2ml antib.
5mg/L
vancomicina
40
42
41
74,5
Edurne G. 17/04/08
13
SUPLEMENTO E.COLI/COLIFORMES
• PRIMERAS CONCLUSIONES:
• La vancomicina inhibe a E.coli en la misma
proporción que el suplemento E.coli/coliformes.
Por tanto, la ineficacia del suplemento
selectivo se debe a la vancomicina.
• La recuperación de K.oxytoca es en todos los
casos superior al 70% y su crecimiento no se ve
afectado por ninguno de estos antibióticos.
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FILTROS
• Decidimos probar la recuperación de E.coli
ATCC 8739 y E.coli NCTC 9001 en Chromocult
con y sin suplemento selectivo E.coli/coliformes
por diferentes técnicas:
– en masa
– filtración por membrana:
–Millipore EZHAWG474
–Whatman 10407112
–Schleicher & Schuell ME25/21
–PALL GN-6
15
E.coli ATCC 8739
MASA
MILLIPORE
TSA
SIN
suplemento
CON
suplemento
ufc en
58
57
39
33
16
43
0
placa
55
60
51
41
27
37
2
Media
56,5
58,5
45
37
21,5
40
1
103,5
79,6
65,5
38,1
70,8
1,8
Recuperación
SIN
suplemento
WHATMAN
CON
suplemento
SIN
suplemento
CON
suplemento
MR: E.coli NCTC 9001; 53ufc
chromocult con suplemento
whatman nitrato
celulosa
S and S ester
celulosa
chromocult sin
suplemento
11
12
53
21%
23%
100%
16
FILTROS PALL
E.coli ATCC8739
UFC
Media
Recuperación
MASA
FILTRACIÓN
FILTRACIÓN
NMP
Chromocult con suplemento
Pall GN-6
8
8
8
9,7
Chromocult sin suplemento
whatman
64
73
68,5
83,0
COLILERT
TSA
87
78
82,5
100%
74
83
78,5
95,2
K.oxytoca ATCC49131
MASA
UFC
Media
Recuperación
TSA
24
33
28,5
100%
FILTRACIÓN
FILTRACIÓN
Chromocult con suplemento Chromocult con suplemento
Pall GN-6
whatman
37
23
34
22
35,5
22,5
124,6
78,9
NMP
COLILERT
41
38
39,5
138,6
E.coli NCTC 13216
FILTRACIÓN
UFC
Media
Recuperación
VR
95
100%
Chromocult con suplemento
Pall GN-6
37
28
37
25
31,8
33,4
17
FILTROS
• Observamos que la recuperación de E.coli en masa es buena
(mayor del 70%), y que el suplemento selectivo no inhibe el
crecimiento de esta cepa.
• Cuando utilizamos la técnica de filtración, observamos que la
recuperación de E.coli en Chromocult con suplemento selectivo se
ve afectada;
– Con filtros Millipore la recuperación es de 38.1% ,
– con filtros Whatman de 1.8% (21% dependiendo de la cepa),
– con filtros Pall de 9.7% (34% dependiendo de la cepa).
• La recuperación de E.coli en Chromocult sin suplemento, con todos
los filtros ensayados, es buena.
18
EJERCICIO IELAB ABRIL 2012
Filtros Whatman
45
40
35
media laboratorio
NMP
media laboratorio
Ch.sin suplemento
media laboratorio Ch.
con supl.
VALOR CONSENSO
30
25
20
15
10
5
0
E.coli
19
E.Coli NCTC 13216
Chromocult con suplemento
Matriz:agua tratada
a
b
c
media
Millipore
EZHAWG474
60
40
67
58
Pall GN-6
29
35
34
33
80
Whatman
Microplus
21
26
18
22
70
Colilert
88
74
74
79
60
50
Millipore
Pall
Whatman
Colilert
40
30
20
10
0
ufc
20
CONCLUSIONES
• Tras todos los ensayos realizados podemos afirmar que la
vancomicina interacciona con algún componente de los filtros
de membrana y hace que se inhiba el crecimiento de E.coli.
Todos los filtros ensayados muestran una mala recuperación
de E.coli. (incluso los recomendados por el fabricante del
suplemento E.coli/coliformes).
•
El crecimiento de K.oxytoca no se ve en ningun caso afectado.
• El fabricante del suplemento, tras ponernos en contacto, no da
solución al problema.
• No podemos utilizar la técnica de filtración para el recuento de
E.coli en nuestro laboratorio ya que disponemos de muestras
en la que nos es necesario la utilización de un suplemento que
nos inhiba la flora acompañante.
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