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8/25/2014
Detección de los Patógenos I
METODOS DE ANALISIS
M.Cs. Mercedes Iriarte P.
CASA – UMSS
Enumeración de Microorganismos
• Medidas cuantitativas
• Cualitativo (presence/absence)
• Para Bacteria: CFU=Unidad Formadora de Colonia
• Para Viruses: PFU =Unidad Formadora de placa
• Para Parásitos (y algunas bacterias) conteo celular
usando microscopia
• MPN : Número Más Probable (método estadístico
para estimar las concentraciones con múltiples
ensayos en diluciones para la extinción [0])
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Medida del crecimiento microbiano
• Métodos indirectos
– Actividad metabólica
– Peso seco
– Turbiedad
Cultivo/Métodos estandar para la detección de
patógenos en el medio ambiente
• Virus
– Concentración/separación
– Cultivo celular (una linea celular, no detecta todas)
– Identificacion por PCR
• Bacteria
–
–
–
–
Concentración/separación
Medio de enriquecimiento
Medio selectivo
Test Bioquímico, serologia, immunoquímica
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BACTERIAS EN UNA PLACA EN AGAR
COLONIAS FORMANDO UNIDADES UFC
Bacterias necesitan incubación para formar UFC
en 24 a 48 horas
Salmonella, E. coli, Staphylococcus
aureus, Streptococos faecalis
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Métodos basados en el crecimiento:
Organismos
indicadores fecales para medida de la calidad del agua
Filtración de
100 ml de
muestra de
agua
E.coli en agar y
colonias por FM
Total coliforms
En agar y colonias
por FM
Coliformes fecales
Coliformes
totales
En agar y colonias
por FM
E.coli
NMP
NMP
Número Mas Probable
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INDICADORES CLASICOS DE CONTAMINACION
Relación entre coliformes totales, termotolerantes y E. coli
Escherichia coli
cccc
Coliformes
termotolerantes
Coliformes totales
Métodos de coliformes Totales
 Método de filtración por membrana (FM) - Un total de 100 ml
de muestra en uno o más filtros; por ejemplo, 1 filtro con
100 ml ó 4 filtros con 25 ml cada uno.
 Método de fermentación en tubos múltiples (FTM) o del
número más probable (NMP) - 10 tubos con 10 ml cada uno
ó 5 tubos con 20 ml cada uno.
 Método de presencia-ausencia (PA) - 100 ml en 1 botella.
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VENTAJAS DEL MÉTODO DE
FILTRACIÓN POR MEMBRANA

Proporciona recuentos directos.

Es más preciso (se obtienen resultados más
reproducibles) que la prueba de TM o NMP.

Rápido y fácil de realizar.

Analiza mayores volúmenes de muestras con
bajas concentraciones de organismos.
DESVENTAJAS DEL MÉTODO DE
FILTRACIÓN POR MEMBRANA
 Interfieren los altos niveles de turbiedad.
 Los coliformes debilitados pueden sobrevivir
mejor en la prueba de TM o NMP.
 Las altas concentraciones de no coliformes
interfieren en el recuento.
 Efecto del tipo de filtro de membrana.
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Métodos rápidos: Colilert (Ausencia/Presencia)
• Su formulación es específica para crecimiento de coliformes y
E. coli en agua dulce o tratada. Está basada en la tecnología de
substrato definido (DST).
• Enzima ß-galactosidasa. Bacteria coliforme metabolizará al
ONPG formando una coloración amarilla.
• E. coli - enzima ß-glucoronidasa. Si está presente en la
muestra, metabolizará al MUG, produciendo fluorescencia.
Conteo directo al microscopio
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CRECIMIENTO DE VIRUS EN CULTIVO CELULAR
CELULAS no infectadas y células en tejido de mono
infectadas
Crecimiento puede tomar varias semanas para algunos virus
FAGOS (colifagos)
Siembra en placa en agar
Microfotografía electrónica
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INFECCION DEL VIRUS
UNIDAD FORMADORA
DE PLACA PFU
CULTIVO CELULAR,
CON AGAR DE RECUBRIMIENTO
TEÑIDO PARA MOSTRAR
DONDE HAY LISIS CELULAR
Metodos para la Detección de
Patógenos
• Protozoarios
• Concentración o elución
• Purificación
• Centrifugación diferencial
• Separación Inmuno Magnetica
• Tinción con anticuerpos monoclonales
• Observación bajo la luz UV
• Observación de características
• Forma y tamaño
• Estructuras internas
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Volumen (típico) de muestra de agua
• Bacterias indicadoras y patogénicas
• 100 to 1000 ml
• Viruses
• Aguas negras 1-5 litros
• Residual tratada 40 litros
• Agua superficial 400 litros
• Aguas subterraneas y de bebida 400 a
2000 litros
• Protozoarios
• Residual tratada 4 liters
• Agua superficial 10 a 100 litros
• Agua de consumo 10 a 100 litros
Concentración de viruses del agua
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Elución de los virus, reconcentracion, filtracion de
bacterias, tratamiento con antibióticos, listo para
qPCR o cultivo celular
1.5% beef
extract
(pH9.5)
Viral particles
were eluted
from 1MDS
filter using
1.5% beef
extract (pH 9.5)
1M
DS
filte
r
Dr, Xagoraraki, MSU
Peristaltic
pump
Cartri
dge
housin
g
sistema de
ultrafiltración de bajo
costo con filtros de
fibra porosa
desechables
Filtrate/waste
Ultrafilter
(MWCO
30kDa)
Feed
Retentate
Sample/retentate
reservoir
-
De exclusión por
tamaño
-
Amplia gama de
virus se puede
recuperar en una
única muestra de
agua
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Muestreo
de aerosol
• Impingers
• Impact- Anderson
Aerosol
• Filters
• High volume fluid
samplers
• Electrostatic
participators
• Settling plates
• Efficacy affected by
• Collection media
• Relative humidity
• Desiccation
Tipos de Fómites
Acrílico
Cerámica
Vidrio
Acero Inox
Laminado
Algodón
Poliéster
Dinero
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Muestreo de Fómites
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Graphic
representation
Cryptosporidium
y Giardia
del agua of the primary
concentration step
A: Sample
B: Filter inlet
C: Filter
outlet
D: Peristaltic
pump
E: Flow meter
F: To waste
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Giardia y Cryptosporidium
- EPA 1623 (EPA 2005), kit Dynabeads GC-Combo de Dynal Biotech, tinción IFA
(Cryptosporidium/Giardia de Merifluor)
concentración
-
Separación inmunomagnética
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Separación Inmunomagnética de
Cryptosporidium parvum oocysts

oocysts
IMS beads
captured
oocysts
Perlas: superparamagnético,
recubierto con una cubierta de
polímero delgada (contenido de
hierro: 20%)
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Observación al microscopio de epifluorescencia
Quistes de Giardia sp.
Conteo al microscopio de quistes de
parásitos Giardia y ooquistes de
Cryptosporidium.
Ooquistes de Cryptosporidium sp.
Microscopio de fluorescencia.
Estados medioambientales
Las estructuras son marcadas con
anticuerpos específicos con
marcadores fluorescentes
Huevos de helmintos
• Método modificado en el Centro de Aguas y
Saneamiento Ambiental bajo la versión del
Estándar Métodos de México (Secretaria de
Comercio y Fomento Industrial 1999).
- Comprende: Procesos de coagulación,
sedimentación, flotación, decantación y técnica
bifásica (para recuperar los huevos y realizar el conteo).
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Procedimiento:
- sedimentación (8 hrs. o una noche)
- Eliminación del sobrenadante
- Centrifugación
- Lavados sucesivos
- Lavado a través de tamices de
diferentes tamaños
• Homogenización del
concentrado
• ZnSO4.7 H2O (etapa
bifásica)
• Limpieza de la muestra
• Lavado a través de un
tamiz de 160 µ
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• Lavados sucesivos a través
de tamices
ayuda con una brocha
suave.
- Viabilidad: incubación de la
muestra tratada por 15 dias a
25°C
Observación al microscopio
•
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