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CLONACIÓN Y SECUENCIACIÓN DEL GEN aroA DE Flavobacterium psychrophilum
Álvarez, B.; Secades, P.; Guijarro, J.A.
Área de Microbiología, Departamento de Biología Funcional, Facultad de Medicina, Universidad de
Oviedo, c/ Julián Clavería s/n, 33006 Oviedo
Resumen
Flavobacterium psychrophilum es el agente etiológico de la enfermedad denominada “cold water disease”
(CWD) que afecta a salmones y truchas en las piscifactorías de todo el mundo. La patología causada por
esta bacteria Gram negativa, aerobia estricta y psicrotrofa, es recurrente y causa un alto grado de
mortalidad entre alevines de trucha y salmón con la consiguiente pérdida económica. Hasta el momento
no se ha desarrollado ningún tratamiento eficaz, en consecuencia, cuando se presenta la enfermedad en
una piscifactoría los daños económicos son ya inevitables. La enfermedad afecta a alevines con un
sistema inmunológico inmaduro, es por ello que hasta ahora los intentos de vacunación con
microorganismos muertos se han visto frustrados. La estrategia a seguir es infectar a los alevines con una
cepa viva atenuada, que mediante su crecimiento lento en el pez, y sin ocasionar la enfermedad, permita
el desarrollo progresivo de una respuesta inmune capaz de contrarrestar infecciones futuras Para el
desarrollo de este sistema de profilaxis se interrumpirá el gen aroA de la cepa salvaje. Este gen codifica la
enzima 5-enolpiruvilsiquimato-3-fosfato sintasa, necesaria para la síntesis de aminoácidos aromáticos y
cuya función es esencial para la supervivencia y crecimiento de la bacteria y por tanto, para poder causar
la enfermedad.
Justificación
El proceso de obtención de la cepa atenuada tiene los siguientes pasos:
1º. Clonación y secuenciación del gen aroA de F. psychrophilum.
2º. Obtención por interrupción génica de una cepa mutante aroA de F. psychrophilum.
3º. Determinación de la virulencia de la cepa mutante aroA en relación con la cepa salvaje y su posible
uso como vacuna.
En la comunicación que se llevará al congreso se describe el primer paso en el desarrollo de la vacuna
que es la clonación y secuenciación del gen aroA.
Resultados y discusión
Para lograr la clonación del gen aroA de F. psychrophilum se utilizó la cepa mutante auxotrofa para dicho
gen Escherichia coli AB2829. La clonación se realizó mediante la complementación de la mutación de la
cepa de E. coli con un fragmento de DNA de F. psychrophilum. El posterior análisis de este fragmento
reveló la presencia de una pauta abierta de lectura cuya secuencia deducida de aminoácidos presentaba
un grado de homología significativo con las secuencias de aminoácidos de la proteína codificada por los
genes aroA de diversos microorganismos. Se pudo observar que la secuencia de F. psychrophilum tenía
un mayor grado de similitud con las secuencias de Haemophilus influenzae y de Pasteurella multocida (35
% de homología en ambos casos). El análisis de los dominios conservados de esta proteína se realizó
utilizando los programas informáticos Pileup (programas GCG de análisi de secuencias) y Boxshade de la
página de internet http://www.ch.embnet.org/software/BOX_form.html.