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INFORME FINAL DE INVESTIGACIÓN
“CARACTERIZACIÓN BIOINFORMÁTICA DE LA
RAMNOGALACTURONANO B LIASA DE Bacillus
cereus ASOCIADA A LA DEGRADACIÓN DE
PECTINA”
Responsable del Estudio
Dr. Gustavo Adolfo Sandoval Peña
LIMA – PERÚ
2015
Resumen
Objetivo: Caracterizar la estructura inicial y el modelamiento de la enzima Ramnogalacturonano
B liasa de Bacillus cereus y su comparación con las de otras especies del mismo género. Material
y métodos: Para llevar a cabo esta caracterización se realizó la búsqueda de las secuencias de
esta enzima provenientes de B. cereus (CUB24579.1), B. subtilis (2ZUX_A) y B. licheniformis
(4CAG_A) en el GenBank. A partir de estas secuencias se determinaron sus principales
parámetros bioquímicos, dominios conservados, predicción de estructuras secundarias y
modelamiento por homología, empleando las herramientas ProtParam, Prosite, PHD Secondary
Structure Prediction y SWISS-MODEL, respectivamente. Adicionalmente, para el análisis
filogenético se utilizó el método NJ empleando la interfaz MEGA 7. Resultados: La enzima en
estudio presenta 614 aminoácidos, con un peso molecular de 66.75 kDa y un punto isoeléctrico
de 5.48. De la predicción de dominios se encontraron regiones altamente conservadas,
caracterizadas por los residuos His357, Asp395, Arg446, Thr528, Lys529 y Tyr589. A partir de la
predicción de su estructura secundaria, se determinó que su conformación presenta 11.56% de
alfa hélices y 33,06% de láminas beta, siendo su estructura tridimensional del tipo mixta (alphabeta). Finalmente, el alineamiento y árbol NJ generado, mostraron una alta conservación de la
enzima dentro del género Bacillus. Conclusión: La enzima ramnogalacturonano B liasa de
Bacillus cereus, es una biomolécula ácida de mediano peso molecular y con una alta
conservación de sus dominios, lo cual representa un interés biotecnológico para la industria de
alimentos.
Palabras claves: Bacillus cereus, Ramnogalacturonano B liasa, B. subtilis, in silico.
Introducción
En la industria de los zumos de fruta, la disponibilidad de enzimas degradadoras de la pared
celular, resulta capital en la actualidad, ya que su función es principalmente la de descomponer
polisacáridos complejos de los tejidos vegetales a moléculas mucho más simples que puedan
solubilizar con mucha mayor rapidez, de manera que reduce en gran proporción la turbidez y
amargura. En tanto en la industria textil estas enzimas tienen un papel fundamental para la
buena calidad de papel; las aplicaciones en otros campos comerciales están el tratamiento de
aguas residuales de industrias de procesamiento de cítricos, extracción de petróleo,
recuperación de aceites de la cáscara [1].
Dentro de toda la variedad de estructuras del tejido vegetal, la pectina es una de ellas que se
encuentra en gran proporción, en la pared primaria y lamina media de planta dicotiledóneas [2].
La pectina es un heteropolisacárido muy heterogéneo conformado por homogalacturonano
(HG), ramnogalacturonano I (RGI), y ramnogalacturonano II, de ahí que recientemente se han
realizado trabajos enfocados en la degradación selectiva de estos oligosacáridos a través de una
reacción de β-eliminación del enlace α (1,4) entre la ramnosa y el ácido galacturónico mediada
por la enzima ramnogalacturonano B liasa [3].
Las poligalacturonasas, pectina liasas, y las pectato liasas fragmentan a las regiones
homogalaturonanos de la pectina, mas no la degradan; en tanto la enzima ramnogalacturonano
liasa B, presenta la potencial capacidad de degradarlos, he allí su importancia a nivel fisiológico,
otorgando valor para la elucidación estructural de la pared celular de las plantas. Además de la
utilidad de estas enzimas en el tratamiento de la fruta [4,6,7].
Las ramnogalacturonano B liasas son un grupo de enzimas de origen bacteriano, responsables
de la degradación de las paredes celulares vegetales, específicamente los dominios
ramnogalacturonanos presentes en las pectinas [5]. En la actualidad son utilizadas en la
industria de alimentos, ya que participan en los procesos de solubilización e hidrólisis de
regiones ramificadas de la pectina, que de otra forma permanecerían como polímeros
insolubles imposibilitando las etapas de filtración y aclaramiento [6].
Por este motivo, en el presente trabajo se realizó la caracterización estructural inicial de la
enzima ramnogalacturonano B liasa de Bacillus cereus y su comparación con las de otras
especies del mismo género. Si bien son enzimas de suma importancia en diversos procesos, no
se conoce al detalle su mecanismo de acción molecular, de ahí la necesidad de resolver el
mecanismo de acción de la enzima a nivel estructural y funcional para mejorar su utilización en
estos procesos.
Materiales y métodos
Obtención de la secuencia aminoacídica de la proteína Dpr
Se obtuvieron las secuencias primarias correspondiente a la enzima Ramnogalacturonano B
Liasa provenientes de B. cereus, B. subtilis y B. licheniformis por medio de la base de datos del
GenBank con códigos de accesión (CUB24579.1), (2ZUX_A) y (4CAG_A) respectivamente. Dicha
secuencia fue utilizada para las posteriores predicciones in silico y obtención de la información
estructural de dicha proteína.
Determinación de parámetros bioquímicos y dominios conservados
Para determinar los principales parámetros bioquímicos de la enzima Ramnogalacturonano B
Liasa se empleó la herramienta ProtParam del ExPASy (http://web.expasy.org/protparam/) [8],
mientras que los dominios conservados presentes en dicha proteína fueron analizados
mediante la herramienta Prosite del ExPASy (http://prosite.expasy.org/) [9].
Predicción de estructuras secundarias
El
análisis
de
predicción
de
estructuras
secundarias
presentes
en
la
enzima
Ramnogalacturonano B Liasa de B. cereus fue realizada empleando la herramienta PHD
Secondary Structure Prediction Method (http://npsa-prabi.ibcp.fr) [10].
Modelamiento por homología
El modelo tridimensional de la enzima Ramnogalacturonano B Liasa de B. cereus se obtuvo
empleando la herramienta SWISS-MODEL (http://swissmodel.expasy.org) [11], a partir de la
información depositada en la base de datos del Protein Data Bank. La visualización del modelo
obtenido se realizó empleando el programa PyMol Molecular Graphics System (versión 1.3).
Predicción de la interacción proteica
La red de interacción de proteínas se obtuvo usando el programa STRING [12]
Resultados
Del análisis de la secuencia primaria de la enzima Ramnogalacturonano B Liasa de B. cereus se
obtuvieron un total de Bacillus cereus presenta 614 aminoácidos, con un peso molecular de
66.75 KDa, un punto isoeléctrico de 5.48 y una proporción de 73 aminoácidos ácidos versus 65
aminoácidos básicos. Esto define a la enzima Ramnogalacturonano B Liasa como una proteína
ácida de alto peso molecular. Por otro lado, de la predicción de dominios se observó la
presencia de regiones altamente conservadas, caracterizadas por los residuos His357, Asp395,
Arg446, Thr528, Lys529 y Tyr589 del sitio activo, correspondiente a la superfamilia de proteínas
RGL1 (Fig. 1).
Con respecto a la predicción de su estructura secundaria, se determinó que su conformación
presenta 11.56% de alfa hélices y 33,06% de láminas beta, siendo su estructura tridimensional
del tipo mixta (alpha-beta). Del modelamiento por homología mostró que la proteína
Ramnogalacturonano B Liasa de B. cereus presenta una estructura monomérica, y un rearreglo
tridimensional típico de una enzima, caracterizado por un core de alfa hélice rodeada de
láminas beta (Fig. 2). Del alineamiento y árbol NJ generado, mostraron una alta conservación de
la enzima dentro del género Bacillus (Fig.3).
Finalmente, de la red de patrones de interacción proteica, con fines prácticos se tomó un score
superior o igual 0.818 solo de las proteínas que tiene una estructura resuelta
tridimensionalmente
y
se
determinó
la
relación
filogenética
entre
la
enzima
Ramnogalacturonano B Liasa (yesX) con yesZ, yesY, yesO, yesP, yesR, rhgT, yteR y YesQ con
identidades de homología de 21.3%, 25.8%, 23.1%, 26.1%, 26.2%, 26.6%, 100% y 24.4%
respectivamente; así como también la fusión de genes de yesX con yesY y rhgT; la colocalización
de yesX y yesZ, yesY, yesO, yesP y rhgT; en tanto no hubo coexpresión de genes yesX de B.
licheniformis (Fig. 4).
Fig. 1. Regiones conservadas del sitio activo de la Ramnogalacturonano B liasa de Bacillus
cereus
Fig. 2. Modelado tridimensional por homología de la enzima
Ramnogalacturonano B liasa de Bacillus cereus. Las estructuras
secundarias, α hélice son de color rojo, las láminas β son de color
amarillo y los loops se muestran de color verde.
Fig. 3. Árbol filogénico de 20 especies bacterianas del género Bacillus
Fig. 4. Red de patrón de interacción de la enzima Ramnogalacturonano B Liasa (yesX) con yesZ,
yesY, yesO, yesP, yesR, rhgT, yteR y YesQ con identidades de homología de 21.3%, 25.8%, 23.1%,
26.1%, 26.2%, 26.6%, 100% y 24.4%, respectivamente.
Discusión
En el presente artículo se han determinado las principales características in silico de la proteína
Dpr de Streptococcus mutans. En estudios previos, se ha demostrado que la enzima
Ramnogalacturonano B liasa es una proteína catalítica similar a la familia de las pectinas, la cual
está vinculada con la degradación de regiones ramificadas de ramnogalacturonano I [3].
Considerada como una enzima esencial para la virulencia de algunos hongos que puede ser
utilizada biotecnológicamente a nivel industrial en la elaboración de zumos de fruta y otros
procesos comerciales [1]. Con respecto a su estructura primaria y secundaria, se encuentra que
esta proteína es de naturaleza ácida y de mediano peso molecular, mientras que con respecto a
su estructura tridimensional, esta proteína presenta una conformación monomérica, donde este
está compuesto de un core de hélices α, rodeados de láminas β. Este hallazgo es corroborado
por ensayos de difracción de rayos X, los cuales muestran que esta enzima presenta una
estructura monomérica con una alta afinidad del sitio activo, altamente conservado, por el
enlace α (1,4) entre la ramnosa y el ácido galacturónico, y cuya actividad es muy semejante al
de otras enzimas de la familia pectinolíticas [3,13,14].
La predicción de patrones de redes de interacción permite visualizar y analizar de manera
precisa la relación filogenética, co-expresión de genes y proteínas relacionadas en algunas u
otras especies. En nuestro resultado cuando se observa el Gene Neighborhood, los genes que se
encuentran interactuando se ubican repetidamente y se localizan cercanamente entre ellas con
una homología menor del 30% entre las proteínas yesX con yesZ, yesY, yesO, yesP, yesR, rhgT,
yteR y YesQ respectivamente, es decir estas enzimas no se encuentran conservadas y la red de
interacción es única [15].
Se observó una gran cantidad de reportes experimentales de las proteínas yesZ, yesY, yesO,
yesP, yesR, rhgT, yteR y YesQ con un alto grado de score. A pesar de que no existe una
semejanza en homología, funcionalmente estas enzimas cumplen un rol muy conservado, el de
la degradación de regiones de ramnogalacturonano de la pectina [3,4,6,7].
Conclusiones
La enzima ramnogalacturonano B liasa de Bacillus cereus, es una biomolécula ácida de mediano
peso molecular y con una alta conservación de sus dominios, lo cual representa un interés
biotecnológico para la industria de alimentos.
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