Download Identificación de Escherichia coli O157H7 y Listeria monocytogenes

VII CONGRESO INTERNACIONAL DE EPIDEMIOLOGÍA
San Andrés Cholula, Puebla.
IDENTIFICACIÓN DE Escherichia coli O157:H7 Y Listeria monocytogenes EN
QUESOS FRESCOS POR TÉCNICAS BACTERIOLÓGICAS Y PCR
Villanueva Valencia M*.1; Martínez Herrera D. I.;1 Peniche Cardeña A.1; López
Merino A1; Hernández Ruiz S.G.1; Morales Estrada A. I.2; Morales Álvarez J. F.3;
Vázquez Navarrete J.1; Flores Castro R.3
1
Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Veracruzana. Veracruz,
Veracruz, México. [email protected]. 2Escuela Nacional de Ciencias Biológicas.
Instituto Politécnico Nacional. Miguel Hidalgo, México, Distrito Federal. 3Instituto
Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias. Centro Nacional de
Investigación disciplinaria en Microbiología Animal. Cuajimalpa, México, Distrito
Federal.
RESUMEN
Los quesos frescos no pasteurizados, pueden estar contaminados con bacterias de
importancia para la salud pública como Escherichia coli O157:H7 y Listeria
monocytogenes. Así, se estableció como objetivo aislar e identificar estos
microorganismos por pruebas bacteriológicas convencionales y por la técnica de
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) a partir de quesos frescos que se
venden en los mercados de la zona conurbada Veracruz-Boca del Río. Para ello, se
recolectaron 30 muestras de igual número de establecimientos procedentes de los
los mercados seleccionados en las temporadas de estiaje y lluvias de. Para el
aislamiento de Listeria monocytogenes se utilizo la NOM-143-SSA1-1995 y para
Escherichia coli el protocolo propuesto por Narváez–Bravo et al. (2007). La PCR
identificó género y especie en al caso de L. moonocytogenes y la Verotoxina 2 (Vtx2)
para Escherichia coli O157:H7. Los resultados se analizaron por epidemiología
descriptiva con intervalos de confianza del 95% y la asociación por chi cuadrada. Se
identificaron 17 municipios que distribuyen los quesos frescos en la conurbación
Veracruz-Boca del Río. Por bacteriología se aisló Listeria monocytogenes en 1/60
(1.6%; IC95%: 0.09-10.14) de los quesos analizados, de la temporada de invierno y se
recolecto en el mercado Malibrán y provino de Tenextepec (25%; IC 95%: 1.32-78.06),
respecto a Escherichia coli O157:H7 se identificaron 9 aislamientos que
serotipicamente corresponde con el serotipo O157; las muestras correspondieron a
los mercados, Malibrán, Unidad Veracruzana e Hidalgo y su origen correspondió en
3/8 quesos de Tlalixcoyan (37.5%; IC95%: 10.24-74.11), 1/18 de Ignacio de la Llave o
región de la Mixtequilla (5.56%; IC95%: 0.29-29.38) y de 5/8 se desconoció el lugar de
procedencia (62.5%; IC95%: 25.89-89.76), no se identifico diferencia estadística
significativa entre las temporadas estudiadas. Los resultados obtenidos indican que
el empleo de técnicas bacteriológicas convencionales y moleculares permiten
establecer la presencia de bacterias patógenas en quesos; sin embargo, ambas
presentan limitantes para su uso como la cantidad de Unidades Formadoras de
Colonias (UFC) necesarias para el aislamiento o de iniciadores estandarizados para
PCR, que identifiquen más de una característica del microorganismo en estudio.
PALABRAS CLAVE identificación, quesos frescos, PCR, Listeria monocytogenes,
Vtx2
“LA EPIDEMIOLOGÍA POR UNA SOLA SALUD”
Celebrando 250 años de la Educación Veterinaria en el mundo
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San Andrés Cholula, Puebla.
INTRODUCCIÓN
La elaboración de quesos a partir de leche sin pasteurizar es una práctica recurrente
que favorece la presencia de bacterias como Escheria coli O157:H7 y Listeria
monocytogenes, ambas catalogadas por la Organización Mundial de la Salud como
principales causantes de enfermedades transmitidas por alimentos1,2. A nivel
nacional, está normada la ausencia de microorganismos en 25 g de queso fresco 3.
La patogenicidad de Listeria monocytogenes está determinada por sus genes de
virulencia ubicados en la isla 1 de patogenicidad4 y para E. coli O157:H7, se
relaciona con las verotoxinas que produce, clasificas como Vtx1 y Vtx2; esta última,
asociada con brotes epidemicos5. Por otro lado, el diagnóstico definitivo en ambos
casos es el aislamiento bacteriológico; para Listeria monocytogenes, se emplea la
técnica descrita en la Norma Oficial Mexicana NOM-143-SSA1-19956 y, en
Escherichia coli O157:H7 no existe una metodología regulada; sin embargo, se han
elaborado diversos medios de cultivo7. En la actualidad la Reacción en Cadena de la
Polimerasa (PCR) permite reducir el tiempo en la emisión de resultados y establecer
género y especie a partir de un bajo número de microorganismos 8. Los quesos que
se elaboran con leche sin pasteurizar, favorecen la presencia de bacterias que
representan un riesgo para la salud pública, por lo que resulta necesario conocer si
esas bacterias se encuentran presentes en los quesos que se venden en la
conurbación Veracruz – Boca del Río.
MATERIALES Y MÉTODOS
Esta investigación se realizó en el Laboratorio de Microbiología de la Unidad de
Diagnóstico de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad
Veracruzana y en el Laboratorio de Microbiología General de la Escuela Nacional de
Ciencia Biológicas del Instituto Politécnico Nacional. Las muestras de los quesos
empleados, se colectaron de establecimientos ubicados en los mercados que
cuentan con registro por la autoridad sanitaria en la conurbación Veracruz – Boca
del Río (Malibrán, Zaragoza, Hidalgo, Unidad Veracruzana y Abastos Boticaria),
durante las temporadas de estiaje y lluvias de 2009. El estudio epidemiológico fue
transversal donde el tamaño de muestra se estimó con el programa Win Episcope
Ver. 2.0 en modalidad “detectar enfermedad”, para prevalencia 6% y confiabilidad
95%, lo que dio una “n” de al menos 25 queserías; sin embargo, se trabajaron 30 por
temporada; así, el total muestras fue 60. De cada quesería se colectaron 100 g de
queso en bolsas de polietileno que se trasladaron en refrigeración al laboratorio y
después se conservaron a 4 °C hasta su procesamiento. Para el aislamiento
bacteriológico de Listeria monocytogenes se tomaron 25 g de muestra de diferentes
partes del queso como lo indica la NOM-143-SSA1-1995 con un pre-enriquecimiento
modificado (sin extracto de levadura); después, se sembraron 100 µl del
enriquecimiento en placas de medio Oxford y se incubaron a 36°C entre 18 y 48 Hrs.
Las colonias obtenidas con crecimiento sugestivo se resembraron bajo las mismas
condiciones y se identificaron con las pruebas bioquímicas señaladas en la norma
de referencia6. Para E. coli O157:H7, las muestras se pre-enriquecieron en 225 ml
de caldo de enriquecimiento y se incubaron a 37°C por 24 Hrs, para después tomar
100 µl del sobrenadante que se sembraron en medio Mac Conkey-Sorbitol e
incubarse entre 35° y 37 °C por 18 a 24 Hrs. Las colonias sugestivas, se
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resembraron en placas de agar de soya tripticaseína con extracto de levadura y se
incubaron por 18 a 24 Hrs. a 35 °C y luego se identificaron con pruebas bioquímicas
para coliformes2. Para la prueba de PCR, la extracción del ADN se realizó por la
técnica CTAB a partir de colonias puras para ambos microorganismos 8. En el caso
de Listeria monocytogenes se emplearon los iniciadores de un fragmento de 173 pb
que identifican género y especie por las secuencias genéticas LL7 y LL8/1R9. Para
E. coli O157:H7 se identificó el gen que codifica para la virulencia de Vtx2 que
amplifica 518 pb104.
RESULTADOS
Del mercado Malibrán por ser el más grande, se obtuvieron el mayor número de
muestras; también se observó que los quesos que se venden en la conurbación
proceden de 17 diferentes zonas y que la mayoría 18/60 (30%; IC95% 19.2-43.37)
provienen del municipio de Ignacio de la Llave (Mixtequilla); además en 8/60
muestras colectadas (13.33%; IC95% 6.33-25.14) no fue posible ubicar la procedencia
(Figura 1). Se aislaron 15 cepas de Listeria spp. de las que 1/15 (6.6%) fue
identificada como L. monocytogenes, lo que permitió observar que 1/60 (1.6%; IC95%;
0.09 – 10.14) de los quesos que se expenden en la zona conurbada Veracruz-Boca
del Río, contiene a esta bacteria en particular y que se aisló de una muestra
colectada en la temporada de invierno obtenida del mercado Malibrán y cuyo origen
fue el municipio de Manlio Fabio Altamirano (25%; IC95%: 1.32 – 78.06). De todas las
muestras analizadas se demostró la presencia de Escherichia coli, pero el serotipo
O157:H7 estuvo presente en 9/60 (15%; IC95%: 7.5 – 27.08); los aislamientos se
obtuvieron de 4/16 queserías (25%; IC95%: 8.33-52.59) del Malibrán, 4/7 (57.14%;
IC95: 20.24-88.19) del Unidad Veracruzana y 1/2 (50%; IC95%: 2.67-97.33) del
Hidalgo; asimismo por lugar de procedencia, se aisló de 3/8 (37.5%; IC95%: 10.2474.11) quesos del municipio de Tlalixcoyan, 1/18 (5.56%; IC95%: 0.29-29.38) de
Ignacio de la Llave y de 5/8 (62.5%; IC95%: 25.89-89.76) se desconoció la
procedencia. La cantidad de bacterias aisladas fue similar para ambas temporadas
estudiadas (5 estiaje y 4 lluvias), por lo que no se observaron diferencias
significativas (P>0.05) entre ellas; así como tampoco, para mercado de procedencia.
Por PCR se identificó la Vtx2 de Escherichia coli O157:H7 (figura 3) en 1/9 (11.11%;
IC95%: 0.58 – 49.33) muestras y se obtuvo del mercado Unidad Veracruzana, pero
de procedencia desconocida y correspondiente a la temporada de estiaje.
DISCUSIÓN
Los estudios enfocados en la situación sanitaria de los alimentos se realiza con
muestras procedentes de mercados o vendedores ambulantes, ya que a partir de
estos se obtienen resultados que permiten conocer la situación sanitaria real, como
lo demuestran Schöbitz et al. (2001)1, pues las malas condiciones sanitarias durante
el manejo del producto en los puntos de venta, aumenta el riesgo para los
consumidores, situación que también coincide con esta investigación; asímismo,
conocer la procedencia de los quesos permite establecer zonas de riesgo; sin
embargo, como se expresa en la figura 1, existen muestras en las que no fue posible
ubicar la procedencia, limitante para conocer la dinámica de la población vinculada
con la transmisión y diseminación de cualquier enfermedad11. En México Saltijeral et
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al. (1999)12, demostraron la presencia de L. monocytogenes en 3.4% de quesos
listos para venta, proporción similar a la obtenida en esta investigación, pues 1.6%
(IC95%: 0.09 – 10.14%) de éstos, demuestran que no se cumple con la normatividad
existente. El desarrollo de L. monocytogenes es más frecuente en temporada de
estiaje13, pero como en este trabajo se identificó en ambos periodos, no fue posible
demostrar diferencias (p>0.05), porque las temperaturas en la conurbación no varían
mucho entre temporadas, lo que permite coincidir con un estudio del estado de
Sonora, México13, que identifica la presencia de la bacteria todo el año, pero con
predominio en época de estiaje (invierno) La presencia de Escherichia coli O157:H7
se relaciona en forma directa con animales infectados; sin embargo se ha sugerido
la posibilidad de contaminación cruzada durante el proceso de elaboración de los
quesos (contacto directo humano-animal, interpersonal o por la ruta fecal oral)2. De
esta forma, sólo se puede especular que la contaminación de los quesos analizados
en esta investigación, pudo provenir de leche contaminada con heces, debido a
malas prácticas higiénicas. Asimismo, la presencia de la bacteria durante ambos
periodos de estudio, puede estar relacionada con el nicho ecológico al favorecer la
permanencia y posibilidad de transmisión en cualquier momento 14. El uso de la PCR
en la presente investigación deja claro que esta técnica al igual que la bacteriología
convencional, presenta limitantes como ya ha sido señalado por Poutou et al. (2005)
15
, quienes indicaron que para identificar Listeria monocytogenes de quesos frescos
por esta metodología, es necesaria una concentración bacteriana de al menos 10 5
UFC/g, misma que es posible que no estuviera presente en las muestras analizadas.
La identificación de Escherichia coli O157:H7 por esta técnica y bacteriología
convencional permite establecer que se encuentra en concentración suficiente para
causar enfermedad; sin embargo, es imposible demostrar si las cepas son capaces
de sintetizar las toxinas Vtx1 y Vtx2 que se relacionan con la virulencia, porque estas
últimas son codificadas por la presencia de bacteriófagos insertados en el
cromosoma bacteriano que podrían no estar siempre presentes en todas las cepas
aisladas14.
CONCLUSIONES
La identificación de Listeria monocytogenes demuestra el incumplimiento a la
normativa sanitaria y en el caso de Escherichia coli O157:H7, la carencia de
investigación respecto a su presencia en los productos lácteos y la falta de
regulación sanitaria al respecto.
CUADROS Y FIGURAS
Figura 1. Municipios de
procedencia de los quesos
que se expende en la zona
conurbada Veracruz-Boca del
Río.
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M
(+)
31
(-)
5000 pb 
2000 pb 
1000 pb 
650 pb 
 518 pb
300 pb 
200 pb 
100 pb 
Figura 2. Gel de azarosa al 1.5% teñido con bromuro de etidio. M: marcador de talla
molecular 1kb plus. Carril 2 DNA de Escherichia coli O157:H7. Carril 3 queso del 1er
muestreo. Carril 4 DNA de B. abortus 544.
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