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Recibido 23/07/2012, Aceptado 23/07/2012, Disponible online 07/12/2012
Bioinformatic Analysis of virulence regulator PrfA and Antimicrobial Resistance of
Listeria monocytogenes isolated from artisan cheeses in Cundinamarca
Angélica Garzón Boada1, Cristian Baquero Duarte2, Juan David Sánchez Calderón3,
Nathalie López4, Maria Mercedes Zambrano5* y María Consuelo Vanegas López6*.
1,2,3,
Laboratorio de Ecología Microbiana y de Alimentos – LEMA, Departamento de
Ciencias Biológicas, Universidad de los Andes. Bogotá, Colombia. Teléfono: 3394949
Ext. 3339. Dirección: Carrera 1 No. 18A – 10 Oficina A 216.
4,
Estudiante de Microbiología, Universidad de los Andes. Bogotá, Colombia..
5,
Directora Científica Corpogen. Bogotá, Colombia. Correo electrónico: Teléfono:
8050106. Dirección: Carrera 5 No. 66A – 34.
6
Directora Laboratorio de Ecología Microbiana y de Alimentos – LEMA
[email protected]. [email protected].
ABSTRACT
Several studies have demonstrated the presence of L. monocytogenes in non industrialized
cheeses in Colombia. In Cundinamarca one of the main products is artisan cheese, which is
highly consumed by tourist and native population. Previously, molecular serotyping was
consider as a determinant test to establish L. monocytogenes virulence, however today it is
consider that this test is not sufficient and efforts have been made in the characterization,
molecular study and function of PrfA regulator in the expression of the virulence of this
microorganism.The aim of this study was to find the frequency of Listeria monocytogenes in
artisan cheeses from the main producer area in Cundinamarca, carry out a bioinformatic
analysis of PrfA regulator and determine the antimicrobial resistance of circulant strains.
From 50 samples, 33 presuntive strains of L. monocytogenes were isolated; 14 (42.3%) of
them were identified as L. monocytogenes by PCR. prfA regulator sequencing was performed
to the 14 strains. Multiple alignment by t-coffee found a great identity (>80%) between the
nucleotide and amino acid sequences isolated in this study and Listeria monocytogenes
serotype 4b str. F2365 reported as virulent in NCBI. All strains were resistant to more than 2
antibiotics and two strains showed resistance to more than 8, including streptomycin and
penicillin, which are some of the first choice antibiotics in Colombia to treat L. monocytogenes
infections. The results of this study evidence that in Colombia are circulating multiresistant
strains of Listeria monocytogenes in food, which may be important in epidemiology and
become a vehicle of transmission of resistance genes to other pathogenic and nonpathogenic
bacteria, also causing problems in clinical treatment. This is the first report of the prfA
Vol 21, No 27 (2012), Revista Alimentos Hoy - 115
regulator on native strains of L. monocytogenes in Colombia, which is important due to the
presence and association of this regulator with virulent strains involved in outbreaks.
Key words: L. monocytogenes, PrfA regulator, bioinformatic analysis, antimicrobial
resistance, virulence.
RESUMEN
Diversos estudios han demostrado la alta frecuencia de L. monocytogenes en quesos no
industrializados en Colombia. En Cundinamarca el queso artesanal es uno de los principales
productos altamente consumido por turistas y población de la localidad. Anteriormente se
consideraba una prueba determinante la serotipificación molecular para determinar la
virulencia de L. monocytogenes; hoy en día se considera que esta prueba no es suficiente y
se está trabajando en la caracterización, estudio molecular y función del regulador PrfA en la
expresión de la virulencia de este microorganismo. Por lo anterior, el objetivo del estudio fue
encontrar la prevalencia de Listeria monocytogenes en quesos artesanales de la principal
zona productora de quesos en Cundinamarca, realizar un análisis bioinformático del
regulador PrfA y determinar la resistencia antimicrobiana de las cepas circulantes. De 50
muestras, se aislaron 33 cepas presuntivas de L. monocytogenes, de éstas 14 (42.3%)
fueron identificadas como L. monocytogenes por PCR. A las 14 cepas se les secuenció el
regulador prfA, se realizaron alineamientos múltiples por t-coffee que mostraron una alta
identidad (>80%) entre las secuencias de nucleótidos y aminoácidos aisladas en este estudio
y Listeria monocytogenes serotipo 4b str. F2365 reportada como virulenta en el NCBI. Todas
las cepas fueron resistentes a más de dos antibióticos y dos cepas mostraron resistencia a
más de ocho, incluidos estreptomicina y penicilina, los cuales son los antibióticos de primera
opción en Colombia. Los resultados de este estudio evidencian que en Colombia están
circulando cepas multiresistentes de Listeria monocytogenes en alimentos, las cuales son
importantes en epidemiologia y se convierten en un vehículo de transmisión de genes de
resistencia para otras bacterias patógenas y no patógenas, así como generan problemas en
el tratamiento clínico. Este es el primer reporte del regulador prfA en cepas nativas de L.
monocytogenes en Colombia, lo cual es importante debido a la presencia y asociación de
este regulador con cepas virulentas involucradas en brotes.
Palabras clave: L. monocytogenes, regulador PrfA, análisis bioinformático, resistencia
antimicrobiana, virulencia.
Vol 21, No 27 (2012), Revista Alimentos Hoy - 116
1. INTRODUCCIÓN
Listeria
monocytogenes
es
un
microorganismo zoonótico y uno de los
principales
patógenos
emergentes
trasmitido por alimentos, cuya importancia
en salud pública radica en su alta tasa de
mortalidad entre 20% y 30% en los grupos
de riesgo y que está asociada a alimentos
de elaboración industrial (Camacho,
Gallegos et al. 2005; Burbano, Sierra et al.
2006; Camacho, Sarmiento et al. 2007;
Camacho, Pinales et al. 2008; MolinaMoreno, Mercado-Reyes et al. 2009;
Vanegas, Vásquez et al. 2009; Adzitey
and Huda 2010; Camacho, Sepúlveda et
al. 2011; Ruiz-Bolivar Z 2011). El 99% de
los casos de listeriosis son de origen
alimentario, por el consumo de alimentos
contaminados (Camacho, Pinales et al.
2008; Camacho, Sepúlveda et al. 2011).
Dentro de los alimentos comúnmente
asociados a casos de listeriosis se
encuentran la leche y sus derivados,
quesos
artesanales
y
procesados,
helados, mantequilla, paté, carne de res,
cerdo y pollo, vegetales, productos de mar
y particularmente los productos listos para
consumo
rápido,
los
cuales
son
importantes en la alimentación colombiana
(Camacho, Mercado et al. 2004; Gallegos,
Germán et al. 2007; Camacho, Albarracín
et al. 2008; Vanegas, Vásquez et al. 2009;
Rahimi, Ameri et al. 2010; Camacho,
Sepúlveda et al. 2011).
El alimento reportado a nivel mundial
como uno de los de mayor riesgo de
contaminación es el queso debido al uso
de leche cruda para su fabricación (Rudolf
M. & Scherer 2001; Millet 2006). En
Colombia el estudio publicado por la
UERIA (Unidad de Evaluación de Riesgos
e Inocuidad Alimentaria), reporta una
prevalencia de L. monocytogenes en
quesos entre 3.57% hasta 33.1%. Así
mismo, el INVIMA reporta en sus IVC
(Programas de Inspección, Vigilancia y
Control), entre 4.21% hasta un 40%
(Camacho, Sepúlveda et al. 2011).
También en Colombia se ha reportado la
transmisión por el consumo de leche no
pasteurizada cruda o productos lácteos
artesanales (Rogga 2005), ya que la leche
cruda es utilizada como principal insumo
para el consumo rural y la preparación de
quesos artesanales (Albarracín 2006;
Gallegos, Germán et al. 2007; Camacho,
Sepúlveda et al. 2011). Otros estudios
desarrollados
alrededor
del
país,
reportaron
prevalencia
de
L.
monocytogenes en un 26.9% de los
quesos artesanales y en un 25.9% de las
muestras de leche cruda de Boyacá
(Vanegas, Vásquez et al. 2009). Todos los
aislamientos presentaron el fragmento
85M asociado a los serotipos 4b-4e-4d,
que son los más frecuentes en casos de
listeriosis invasivas (Vanegas, Medrano et
al. 2012).
La
expresión
de
los
genes
involucrados en los diferentes pasos del
proceso infeccioso de L. monocytogenes
(invasión, multiplicación intracelular y
dispersión) están controlados por la acción
del regulador positivo PrfA, una proteína
de unión al DNA de 27 kDa que es
esencial para la patogénesis de L.
monocytogenes (Arslan and Özdemir
2008; Ruiz-Bolivar Z 2011). El regulador
PrfA activa la transcripción uniéndose a
una secuencia de 14 bp que está
localizada a -45 bp de los promotores de
genes de virulencia hly, pclA, pclB, actA,
InlA e InlB (Kreft and Vázquez-Boland
2001; Vázquez-Boland, Kuhn et al. 2001;
Nadon, Bowen et al. 2002; Scortti, Monzó
et al. 2007; de las Heras, Cain et al. 2011).
Mutantes
sin
el
gen
prfA
son
completamente avirulentos (Kreft and
Vázquez-Boland 2001; Johnson, Jinneman
Vol 21, No 27 (2012), Revista Alimentos Hoy - 117
et al. 2004; Scortti, Monzó et al. 2007;
Freitag, Port et al. 2009; de las Heras,
Cain et al. 2011).
El regulador PrfA pertenece a la familia
de reguladores transcripcionales de
enterobacterias Crp (cAMP receptor
protein) también conocido como Cap
(catabolite gene activator protein). PrfA y
Crp son homodímeros con arreglos de sus
subunidades muy similares (Kreft and
Vázquez-Boland 2001; Scortti, Monzó et
al. 2007; Freitag, Port et al. 2009). PrfA
comparte varias características con Crp.
La región N-terminal de Crp tiene una
serie de láminas β más una región de
hélice α, que están involucradas en la
unión del cofactor cAMP. PrfA contiene
una región similar en su región N-terminal.
Por otra parte, dos de tres de las regiones
en las que Crp interactúa con la RNA
polimerasa son conservadas en PrfA (Kreft
and Vázquez-Boland 2001; VázquezBoland, Kuhn et al. 2001). PrfA tiene en su
C-terminal una región de unión al DNA
(HTH) con más del 70% de similitud a la
correspondiente en Crp. Mutagénesis
dirigida a esta zona ha evidenciado
cambios en la actividad transcripcional de
PrfA (Kreft and Vázquez-Boland 2001;
Scortti, Monzó et al. 2007).
No obstante, adicional a los factores
de virulencia que caracterizan a L.
monocytogenes,
la
resistencia
a
antibióticos es una problemática que
aumenta rápidamente. Estudios en Europa
mostraron un incremento del 60%
aproximadamente en la resistencia a
antibióticos en 202 aislamientos de L.
monocytogenes entre 1993 y 2006. Todas
las cepas mostraron resistencia de al
menos a un antibiótico, siendo la
resistencia más representativa para los
antibióticos gentamicina, estreptomicina,
ciprofloxacina, tetraciclina entre otros.
Además se encontró una multiresistencia
del 84% de las cepas evaluadas (Zulema
Ruiz-Bolivar 2008; Yan, Neogi et al. 2010;
Ruiz-Bolivar Z 2011; Alonso-Hernando,
Prieto et al. 2012).
En Colombia está autorizado el uso de
más de 16 antibióticos como promotores
de crecimiento ó para tratamiento de
infecciones animales, lo cual contribuye a
la presencia de residuos de antibióticos en
alimentos y potencializa su transferencia
de genes entre microbiota normal de
alimentos y patógenos de alimentos a
través de elementos genéticos móviles
como transposones y plásmidos. Las
fuentes más comunes de genes de
resistencia a L. monocytogenes hasta
ahora reportados son Enterococcus sp. y
Streptococcus sp. (Conter, Paludi et al.
2009; Bahar, Jamali et al. 2010;
Pesavento, Ducci et al. 2010; Ruiz-Bolivar
Z 2011).
El presente estudio tuvo como objetivo
encontrar la prevalencia de Listeria
monocytogenes en quesos artesanales de
Cundinamarca,
realizar
un
análisis
bioinformático del regulador PrfA y
determinar la resistencia antimicrobiana de
las cepas circulantes, con el fin de realizar
un acercamiento a la patogénesis de este
microorganismo en el país y conocer su
potencial como vehículo de transmisión de
resistencia a antibióticos a través de los
alimentos.
2. MATERIALES Y MÉTODOS
Se utilizaron como cepas referencia
en todos los ensayos L. monocytogenes
ATCC 7644 y L. ivanovii ATCC 19119.
2.1 Aislamiento e Identificación de las
cepas
Vol 21, No 27 (2012), Revista Alimentos Hoy - 118
Se procesaron 50 muestras de
quesos artesanales de un municipio de
Cundinamarca.
El
aislamiento
e
identificación de L. monocytogenes se
realizó de acuerdo al método para
recuento y detección de L. monoytogenes
en alimentos del Bacteriological Analytical
Manual (BAM) de la FDA (U. S. Food and
Drug Administration) (Medrano, Restrepo
et al. 2006; Vanegas, Vásquez et al. 2009;
Hitchins 2011). Las cepas fueron
confirmadas como L. monocytogenes
mediante la amplificación del gen actA
(Cai, Kabuki et al. 2002).
2.1.1 Extracción de DNA
Las
cepas
aisladas
fueron
cultivadas en Caldo BHI durante 48 horas
a 37°C. Se centrifugó 1 ml del caldo BHI a
13000 rpm durante 5 minutos y se
descartó el sobrenadante. Se realizaron
lavados mediante la adición de 1 ml de
Agua Destilada Estéril, centrifugación y
descarte de sobrenadante. Posteriormente
se adicionaron 100 μl de Agua Destilada
Estéril y se llevó a ebullición durante 20
minutos a 80 °C. Las extracciones de DNA
fueron mantenidas a –20°C hasta la
reacción de PCR.
2.1.2 Amplificación del gen actA
DNA de las 28 cepas aisladas
fueron sometidos a PCR utilizando primers
específicos para el gen actA con el fin de
identificar a L. monocytogenes mediante
métodos moleculares (Cai, Kabuki et al.
2002). La reacción de PCR se llevó a cabo
en un volumen final de 25 μl conteniendo
12.5 μl de GoTaq Master Mix (Promega,
Madison, WI), 2.0 μL de primer ActA
Forward 5´TAGCGTATCACGAGGAGG3´,
2.0 μL de primer ActA Reverse
5´TTTTGAATTTCATATCATTCACC3´, 6.5
μL de Agua libre de nucleasas y 2 μL de
DNA. Los ciclos de amplificación
consistieron en una denaturación de 95 °C
por 5 min, seguida de 35 ciclos de 95 °C
por 90 segundos, anillaje a 50 °C por 45
segundos, extensión a 72 °C por 90
segundos y una extensión final 72 °C por 7
min en un Termociclador Gene CyclerTM
(Bio-Rad Laboratories, Inc. USA).
2.2 Visualización de los productos de
PCR
Los productos de la PCR fueron
separados en un gel de agarosa 2% (p/v)
en buffer Tris Borato EDTA (pH 8.2). Los
residuos fueron teñidos con GelRedTM
(BIOTUM) y visualizados con ChemiDoc
XRS UV transilluminator system (Bio-Rad,
Laboratories, Inc. USA).
2.3 Evaluación de la resistencia
antimicrobiana.
Todos los aislamientos fueron
probados por el método de difusión de
disco estándar de Kirby & Bauer en agar
Mueller Hinton, incubados a 37ºC durante
24 h contra los siguientes 20 antibióticos
(Pesavento, Ducci et al. 2010): kanamicina
(30 ug), ácido nalidíxico (30 ug),
vancomicina (30 ug), Sulfamethoxazole
trimethropim (1.25 ug), nitrofurantoína
(300 ug), eritromicina (15 ug), tetraciclina
(30 ug), cefoxitina (30 ug), cloranfenicol
(30 ug), rifampin (5 ug), ciprofloxacina (5
ug), Imipenem (10 ug), estreptomicina de
(10 ug) y gentamicina de (10 ug),
penicilina (10 ug), ampicilina (10 ug),
amikacina (30 ug), meropenem (10 ug),
cefepime (30 ug) y oxacilina (1 ug).
2.4 Análisis del Regulador PrfA
2.4.1 Amplificación del gen prfA
Las 14 cepas que amplificaron para
actA se sometieron a PCR usando primers
específicos
para
el
regulador
transcripcional PrfA (Germini, Masola et al.
2009; Mohammed Sayed 2009). La
Vol 21, No 27 (2012), Revista Alimentos Hoy - 119
extracción de DNA fue llevada a cabo
como se menciona en el numeral 2.1.1. La
reacción se llevo a cabo con un volumen
final de 25µl conteniendo 12.5µl de GoTaq
Master Mix (Promega, Madison, WI), 1.0
μL
de
primer
PrfA
Forward
5´TCATCGACGGCAACCTCGG 3´, 1.0 μL
de
primer
PrfA
Reverse
5´TGAGCAACGTATCCTCCAGAGT 3´, 8
μL de Agua libre de nucleasas y 2 μL de
DNA. Los ciclos de amplificación
consistieron en una denaturación de 95 °C
por 5 min, seguida de 40 ciclos de 95 °C
por 30 segundos, anillaje a 54 °C por 30
segundos, extensión a 72 °C por 30
segundos y una extensión final 72 °C por
10 min en un Termociclador Gene
CyclerTM (Bio-Rad Laboratories, Inc.
USA).
http://tcoffee.crg.cat/apps/tcoffee/index.ht
ml, entre las secuencias de prfA de
aislamientos colombianos y la secuencia
de Listeria monocytogenes serotipo 4b str.
F2365 anotada en NCBI y reportada
como virulenta.
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
De las 50 muestras de quesos
artesanales procesadas se aislaron un
total de 33 cepas presuntivas de L.
monocytogenes, de las cuales sólo 14
fueron
confirmadas
como
Listeria
monocytogenes con la amplificación del
gen actA.
2.4.2
Análisis
bioinformático
del
regulador PrfA.
Las cepas aisladas e identificadas
como L. monocytogenes fueron sometidas
a la amplificación del regulador prfA
mediante PCR (Germini, Masola et al.
2009; Mohammed Sayed 2009). Los
productos
fueron
secuenciados
en
Macrogen Inc., seguida de la comparación
con la herramienta de alineamientos
(BLAST) a través de la página web
http://www
BLAST.
ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/. Se tuvieron en
cuenta los resultados con porcentajes de
identidad mayores al 97% y E-values de
0,0.
Se realizó un alineamiento múltiple a
través de la herramienta T-coffee en la
página
web
Tal como se muestra en la Figura 1, el
alineamiento de las secuencias del gen
prfA
evidenció
pares
de
bases
conservadas entre las todas cepas
aisladas
en
Colombia
y
Listeria
monocytogenes serotipo 4b str. F2365
reportada en NCBI como virulenta con una
similitud mayor al 80%. Para el análisis de
los resultados es necesario tener en
cuenta la escala de colores brindada por el
programa de alineamiento que permite
observar de forma directa la similitud de
los alineamientos (Ver figura 1). De
acuerdo a esta escala, nucleótidos ó
aminoácidos que estén con color rojo
presentan
porcentajes
de
similitud
mayores a 80, nucléotidos ó aminoácidos
de color naranja presentan porcentajes de
similitud del 50% aproximadamente y
nucléotidos ó aminoácidos de color verde
ó azul presentan porcentajes de similitud
inferiores al 50%.
Vol 21, No 27 (2012), Revista Alimentos Hoy - 120
Figura 1: Fragmento del alineamiento múltiple en T-coffee del gen prfA de cepas aisladas en
Colombia y Listeria monocytogenes serotipo 4b str. F2365 del NCBI.
Después de este análisis se realizó la traducción in silico de las secuencias de
nucleótidos a secuencias de aminoácidos y se hizo el correspondiente alineamiento múltiple
en T-coffee (Ver Figura 2). Los resultados también evidencian una alta similitud para
aminoácidos del regulador PrfA.
Figura 2: Fragmento del alineamiento múltiple en T-cofee de la secuencia de aminoácidos
del regulador PrfA de cepas aisladas en Colombia y Listeria monocytogenes serotipo 4b str.
F2365.
Este hallazgo no es suficiente para
determinar la virulencia de las cepas
nativas de L. monocytogenes circulantes
en Colombia, ya que existen diversos
mecanismos de control del regulador PrfA
dentro de los cuales se encuentran la
regulación transcripcional, control de
temperatura, inhibición por azúcares, entre
otros (Scortti, Monzó et al. 2007; Loh,
Dussurget et al. 2009; de las Heras, Cain
et al. 2011) que pueden determinar si una
cepa es virulenta o no.
Analizar
las
secuencias
del
regulador PrfA en cepas nativas es un
avance en el entendimiento de la
virulencia de este patógeno en el país, y
los hallazgos encontrados en este estudio
representan una alarma frente a la
circulación de cepas potencialmente
virulentas al compartir nucleótidos y
aminoácidos con alta similitud con los de
cepas como
Listeria monocytogenes
serotipo 4b str. F2365 que ha sido
Vol 21, No 27 (2012), Revista Alimentos Hoy - 121
asociada a brotes y cuya información se
encuentra disponible en NCBI (Donaldson,
Nanduri et al. 2011).
tetraciclina,
imipenem,
cloranfenicol,
cotrimoxazole,
nitrofurantoína
y
vancomicina.
Determinar si una cepa de L.
monocytogenes es virulenta o no se ha
convertido en una problemática mundial,
ya que en los últimos 20 años se han
utilizado
diferentes
alternativas
moleculares
pero
ninguna
es
lo
suficientemente determinante para decidir
la virulencia de una cepa. Este trabajo
arroja información más contundente que
las
otras
técnicas
incluyendo
serotipificación
molecular,
pero
es
necesario complementar estos resultados
en futuros estudios evidenciando la
virulencia en ensayos con modelos
biológicos.
Se confirmó la resistencia natural
de L. monocytogenes a las cefalosporinas
(cefoxitina). El ácido nalidixico fue utilizado
como control pues no se esperaba
encontrar susceptibilidad a esta quinolona.
En cuanto a la resistencia a la oxacilina
(un β-lactamico) en tan alto porcentaje
(100%) es importante para la salud pública
de nuestro país (Ruiz-Bolivar Z 2011). En
estudios anteriores se han reportado
porcentajes de resistencia diferentes a los
obtenidos en este estudio (Ruiz-Bolivar,
Neuque-Rico et al. 2011), lo cual hace
más interesantes los datos obtenidos y
evidencia la importancia de realizar
estudios amplios de resistencia a
antibióticos dada su importancia a nivel
mundial y con el fin de establecer de forma
más precisa la resistencia de cepas
circulantes de L. monocytogenes en
Colombia.
Es necesario tener en cuenta que
también
deben
hacerse
estudios
epidemiológicos
de
listeriosis
en
Colombia, con el fin de integrar la
epidemiología con la inocuidad alimentaria
relacionada con la problemática de este
patógeno en el país.
CONCLUSIONES
En cuanto a la resistencia
antimicrobiana,
todas
las
cepas
previamente
identificadas,
fueron
resistentes a más de dos antibióticos y dos
cepas mostraron resistencias a más de
ocho, incluidos estreptomicina y penicilina,
los cuales son los antibióticos de elección
en el tratamiento de infecciones de L.
monocytogenes en Colombia. Las cepas
mostraron alta resistencia a cefoxitina,
oxacilina y ácido nalidixico (100%);
cefepime (75%); estreptomicina (41,7%);
amikacina (41,7%); kanamicina (33,3%) y
eritromicina (25%). Las cepas presentaron
un 8,3% de resistencia a los antibióticos
penicilina,
ampicilina,
meropenem,
rifampicina y ciprofloxacina. No se
presentó resistencia a gentamicina,
Se encontró una prevalencia
importante de L. monocytogenes en
quesos artesanales en un importante
municipio lácteo de Cundinamarca, de
importancia en salud pública en nuetsro
país.
Se demostró que las cepas de L.
monocytogenes aisladas de quesos
artesanales en Colombia tienen la carga
genética necesaria para ser patogénicas,
debido a la alta similitud genómica con el
regulador PrfA de Listeria monocytogenes
serotipo 4b str. F2365.
Se evidenció que en Colombia circulan
cepas
multiresistentes
de
Listeria
Vol 21, No 27 (2012), Revista Alimentos Hoy - 122
monocytogenes en los alimentos, lo cual
es importante en la epidemiología y como
vehículos de transferencia horizontal de
resistencia antimicrobiana en el país.
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AGRADECIMIENTOS
Esta investigación fue apoyada y
financiada por el Laboratorio de Ecología
Microbiana de los Alimentos y la Facultad
de Ciencias de la Universidad de los
Andes, Bogotá, Colombia.
Vol 21, No 27 (2012), Revista Alimentos Hoy - 125