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 Ensayo para evaluar la actividad antitumoral Recuento en el lector ADAM • Seleccionar la línea celular con la que trabajar y tomarlas del número de paso adecuado. Cultivarla en botellas según indicaciones de su medio nutritivo en un incubador a 37⁰C , 95% humedad y 5% CO2, durante 24-­‐72h. • Retirar el medio de las células confluentes (aspiración por vacío). Si las células no son adherentes tener extremo cuidado al aspirar para no perder las células. • Lavar con 2mL (botella de 75 cm2) de solución PBS 10X para eliminar restos de medio nutritivo que pueden inhibir a la tripsina/EDTA, mezclar con un suave balanceo de la botella y después aspirar el PBS. • Si las células son adherentes, añadir 2mL (botella de 75 cm2) de 0.25% Tripsina-­‐1% EDTA y mover para distribuir adecuadamente. Tratar durante 4 min en el incubador de células a 37⁰C, 5% de CO2 y 95% de humedad para asegurar las células se han soltado. • Añadir 8mL de medio fresco y homogeneizar bien con una pipeta serológica estéril. • Pasar el volumen a un tubo Falcon de 15mL y centrifugar a 900 rpm durante 4min. • Aspirar el medio y resuspender el pellet en 10mL de medio nutritivo fresco. • Rotular dos tubos Eppendorf estériles de 1,5mL como T y N respectivamente. • Añadir 12μL de la solución T al tubo T y 12μL de la solución N al tubo N. • Agitar suavemente las células y añadir 12μL a cada tubo Eppendorf (T y N). • Cargar el chip con 12μL de cada mezcla T y N, en su carril correspondiente. • Introducir el chip en el lector Adam. • El aparato proporciona V= % de células viables. Si es inferior al 90% no utilizar este cultivo para el ensayo en placa de 96 pocillos. N = Número de células no viables (células/mL) T = Número de células totales (células/mL) T-­‐N =Concentración de células en el cultivo (células/mL) Preparación de extractos Los extractos orgánicos fueron disueltos en DMSO estéril. •
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A cada extracto (40mg) se le añadió asépticamente 1mL de DMSO estéril quedando a una concentración de 40.000µg/mL. Para la correcta disolución se sometieron a agitación en vortex, y sonicado cuando fuere necesario. Los extractos disueltos en tubos Eppendorf estériles se guardan en nevera a 4-­‐5⁰C hasta su uso. Los extractos ricos en beta-­‐carotenos fueron disueltos en 1mL de una mezcla de Kolliphor RH40 y DMSO estéril 25:75 (v/v) como se indica más arriba. Ensayo de MTT (Methyl Thiazolyl Tetrazolium) • Sembrar las células en la placa de 96 pocillos (5.000 o 10.000 células/pocillo dependiendo de la línea celular). El volumen final de células en cada pocillo será de 100μL. No se añaden células a los pocillos elegidos como blanco. En estos pocillos añadimos solo 100μL de medio nutritivo con el vehículo (compuesto usado para disolver los extractos, ej. DMSO a la misma concentración que en el extracto). • Tras 24h de crecimiento de las células en el incubador, a 37⁰C, 5% de CO2 y 95% de humedad, se le añade el tratamiento en 100μL de medio, bien a 50 o 100µg mL (sin retirar el medio en el que se sembraron). Los extractos y como control positivo la Adriamicina (concentración final 20%) se incluyen por triplicado. A los pocillos elegidos como control negativo se les añade 100μL de medio con el vehículo. Para evitar toxicidad no superar la concentración de 0,1% DMSO y 0,01% EtOH. • Incubar a 37⁰C, 5% de CO2 y 95% de humedad durante 48h. • Observar la morfología de las células al microscopio y evaluar si existen diferencias entre el grupo control y los tratados. • Añadir 10μL de MTT 10X (atemperado previamente en el incubador y preparado en fresco) a cada pocillo (concentración final: 0,3mg/mL) e incubar a 37⁰C, 5% de CO2 y 95% de humedad durante 1.5-­‐2h. Controlar la reacción observando los precipitados de Formazan que se forman. • Retirar el medio de cultivo aspirando bajo la lupa con cuidado de no arrastrar las células y tener exquisito cuidado si no es una línea celular adherente. • Lisar las células y solubilizar las sales de Formazan con 200μL/pocillo de DMSO. Incubar a 37⁰C, 5% de CO2 y 95% de humedad durante 20 min para que se resuspenda completamente. • Con una punta de pipeta cerrada y doblada (para evitar capilaridad) homogeneizar el color formado en cada pocillo (usar la misma punta de pipeta para todos los pocillos). • En un espectrofotómetro, leer la absorbancia a 570-­‐600nm de cada pocillo, incluyendo el blanco. 2 Análisis de los datos • Se calcula la media del valor de absorbancia de los triplicados, tanto para los extractos como para el control negativo, y se les resta la media del blanco. • Para calcular el porcentaje de supervivencia se aplica la fórmula: Supervivencia (%)= (abs extracto*100/(control-­‐vehículo) • Para calcular el porcentaje de inhibición se aplica la fórmula: Inhibición (%)= 100 -­‐ % Supervivencia Aspecto de una placa multipocillo tras el ensayo. Los pocillo menos coloreados indican actividad antitumoral; por el contrario, los pocillos más oscuros indican que no ha habido efecto antitumoral. (Drs. R. Ramírez, R. Zárate) 3