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 Ensayo para evaluar la actividad antimicrobiana (bacterias y levaduras) Cultivo de microorganismos • Crecer las bacterias durante la noche (24 h) y/o las levaduras (48h) en incubador a 37⁰C (o a la temperatura que requiera cada microorganismo), en un matraz pequeño esterilizado conteniendo 15-­‐18mL de medio (TSB para bacterias y YPD para levaduras) al que se le han añadido 20-­‐40µL de un cultivo anterior, o un asa de siembra del stock en nevera o congelador, con agitación orbital a 250 rpm. • Una vez crecido, medir la absorbancia a 600nm tomando asépticamente 1mL del cultivo y su respectivo control (TSB o YPD) (este valor será orientativo para hacer la dilución posterior). • Preparar diluciones seriadas: (tener en cuenta el número de pocillos a ensayar para preparar suficiente volumen de la dilución final para el ensayo) y recordar hacer un vortex adecuado para cada dilución y antes de tomar cualquier volumen. • Preparación de extractos Los extractos orgánicos fueron disueltos en DMSO estéril. • A cada extracto (40mg) se le añadió asépticamente 1mL de DMSO, resultando una concentración de 40.000µg/mL (40.000ppm). • Para la correcta disolución se sometieron a agitación en vortex y sonicado cuando fuere necesario. • Los extractos disueltos en tubos Eppendorf esterilizados se guardan en nevera a 4-­‐5⁰C hasta su uso. Los extractos ricos en beta-­‐carotenos fueron disueltos en 1mL de una mezcla de Kolliphor RH40 y DMSO estéril 25:75 (v/v) como se indica más arriba. Ensayo con los extractos • Añadir 100µL de la dilución del cultivo a la concentración adecuada (bacterias 10-­‐4 y 10-­‐5 y levaduras 10-­‐2 y 10-­‐3) (cargar la placa multipocillo comenzando con la menor concentración para ahorrar material). 10-­‐5 10-­‐4 • Posteriormente, tras el cultivo en placa en medio sólido (recuento de células), se sabrá cual de las dos concentraciones empleadas es la que tiene el número adecuado de células. • Añadir 100µL de cada extracto a la concentración a ensayar (50 µg/mL y 100µg/mL) (preparar siempre stock a 2x) y tener en cuenta el número de pocillos para conocer el volumen total de extracto requerido para cargar todos los pocillos. 2 • También se cargan tres pocillos con células a las que se añaden 25 unidades de la mezcla de antibióticos streptomicina/tetraciclina como control positivo. • Incubar la placa durante la noche (24h) a 37⁰C (o temp. requerida) y/o las levaduras (48h), con agitación suave (150 rpm). Para mantener una humedad adecuada en el incubador, colocar las placas multipocillo en una bandeja sobre papel de filtro humedecido con agua destilada, evitando así que se reseque el volumen de cultivo en los pocillos. • Al final del experimento, homogeneizar el contenido de cada pocillo con una punta de pipeta doblada y cerrada y finalmente leer la absorbancia a 600nm. Análisis de los datos • Se calcula la media del valor de absorbancia de los triplicados, tanto para los extractos como para el control negativo y positivo, y se les resta la media del blanco. • Para calcular el porcentaje de supervivencia se aplica la fórmula: Supervivencia (%)= (abs extracto*100/(control-­‐vehículo) • Para calcular el porcentaje de inhibición se aplica la fórmula: Inhibición (%)= 100 -­‐ % Supervivencia Recuento de células cultivadas El número de células cargadas en cada pocillo no se conocerá hasta el día siguiente del comienzo del ensayo. Tras realizar las diluciones del cultivo y cargadas las placas multipocillo con los extractos, se comienza a preparar las placas de Petri con medio nutritivo sólido (TSA o YPD agar) y se cultivan 24-­‐48h según sea bacterias o levaduras respectivamente. Para conocer exactamente el número de células que se han utilizado en el ensayo, se hacen diluciones seriadas en tubos Eppendorf esterilizados a partir de la concentración de trabajo utilizada (10-­‐4, 10-­‐5 para bacterias y 10-­‐2, 10-­‐3, para levaduras) recordando hacer vortex para cada paso y toma de muestra. 10-­‐3 10-­‐1 10-­‐2 10-­‐4 10-­‐4 100µL células + 100µLde 10-­‐1 + 100µLde 10-­‐2 + 100µL de 10-­‐3 + 900µl agua salina 900µL agua salina 900µlLagua salina 900µL agua salina 10-­‐1 10-­‐2 10-­‐3 10-­‐4 10-­‐5 3 • Añadir 100µL de cada una de las diluciones (10-­‐2, 10-­‐3, 10-­‐4) en una placa de Petri 90 mm diámetro con el medio nutritivo sólido adecuado (18-­‐20mL) TSA y YPD agar para bacterias y levaduras respectivamente, y con un asa de siembra extender bien. • Recordar plaquear comenzando con la dilución más baja para poder emplear las mismas puntas pipetas y asas de siembra y ahorrar material. • Incubar a 37⁰C (o la temp. que requiera cada microorganismo) durante la noche 24/48h según sean bacterias o levaduras respectivamente. Cálculo de la concentración de células usadas para el ensayo •
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Contar el número de colonias crecidas en cada placa. La concentración de células en cada dilución se calcula aplicando la siguiente fórmula: Nº de células/mL= (nº de colonias x dilución en positivo x 1000)/100 La concentración final usada en el ensayo será el valor medio de los valores obtenidos para cada dilución. La concentración final correcta debe estar entre 1-­‐6 105 células/mL, tanto para bacterias como para levaduras. Para evaluar los datos del ensayo, usar la placa multipocillo que albergaba el número correcto de células ignorando los resultados de la otra dilución. (Drs. R. Ramírez, R. Zárate) 4