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CARACTERIZACIÒN MOLECULAR DE FILAMENTOS ANORMALES DE LA
PROTEINA TAU AISLADOS DE CEREBRO DE SUJETOS CON ENFERMEDAD
DE ALZHEIMER.
D.C. Figueroa1, G. Basurto-Islas1, F. Garcìa-Sierra1, R. Mena2 .
1.Departamento
de Biología Celular, CINVESTAV- IPN [email protected]
de Fisiologìa Biofìsica y Neurociencias, CINVESTAV-IPN
Ave. Instituto Politécnico Nacional No. 2508, Col. San Pedro Zacatenco, C. P. 07360,
México DF.
2 Departamento
RESUMEN
La enfermedad de Alzheimer (EA) es un proceso neurodegenerativo caracterizado clínicamente por la pérdida
gradual de la memoria y un deterioro de las funciones cognoscitivas (9). La EA es ocasionada principalmente
por la acumulación anormal de polímeros insolubles (Pi) dentro de las neuronas, originando su muerte. Los Pi
se componen de la proteína tau que presenta modificaciones postraduccionales: fosforilación, glicosilación,
nitrificación, cambios conformacionales y truncaciones endógenas. Una de estas, (Asp-421) producida por
caspasas se encontró en lesiones neuropatológicas de cerebros de sujetos con EA. No se conoce si esta
proteína es truncada como monómero y/o polímero. Utilizando tejido cerebral de sujetos que murieron con
EA, se caracterizó bioquímicamente la proteína tau truncada (Asp-421) en diversas fracciones de
componentes celulares y poblaciones de filamentos anormales. Por técnicas de ELISA e inmunoblot
encontramos la poza mayoritaria de proteína truncada en la fracción filamentosa y no así en la soluble. Con
tratamientos posteriores de extracción de los polímeros aislados se demostró un enriquecimiento de la
proteína truncada en asociación con tau intacta. Esto comprueba previos modelos de progresión de la
patología neurofibrilar de tau donde se ha propuesto una asociación estrecha entre Tau normal y Tau
truncada en el Asp-421.
1. INTRODUCCIÓN
La enfermedad de Alzheimer (EA) es un desorden neurodegenerativo progresivo caracterizado por
una muerte neuronal selectiva en regiones específicas del cerebro (9). Debido a ello, clínicamente se observa
en los sujetos una pérdida gradual de la memoria y un deterioro de las funciones cognoscitivas. La muerte
celular se debe a la presencia de lesiones neuropatológicas de que son llamadas colectivamente “La
patología Neurofibrilar” e incluye placas neuríticas, marañas Neurofibrilares (MNF´s), e hilillos de neuropilo
(HN), redistribuidos en la corteza cerebral, hipocampo y otras regiones especificas del cerebro (9). En la EA,
la proteína tau que normalmente funciona como una proteína asociada a microtubulos axón-especifica, se
acumula anormalmente en el compartimiento somatodendrítico, especialmente en las neuronas piramidales
corticales. Estas acumulaciones toman forma de MNF´s que contienen estructuras helicoidalmente apareadas
características, llamadas Filamentos Helicoidales apareados (FHAs) que se acumulan neuronas afectadas (2).
La caracterización de las proteínas estructurales y de los factores que dirigen y estabilizan su ensamblaje en
los FHA´s, es crucial para entender la patogénesis de la enfermedad (2).
Muchos factores han sido relacionados a la generación de los FHAs, entre estos, la
hiperfosforilación de la proteína se piensa que contribuye con su agregación en estos filamentos. Además de
la fosforilación, la proteína Tau puede presentar otras modificaciones postraduccionales anormales como son,
glicosilación, nitrificación, ubiquitinación, cambios conformacionales, las cuales han sido propuestas como
alteraciones clave para convertir a Tau en una especie patológica con propiedades de auto agregación.
Aun cuando se han realizado enormes esfuerzos para entender la composición molecular de los
FHA´s, análisis bioquímicos han sido difíciles de realizar, debido a su extrema insolubilidad y por la
dificultad de obtener una fracción homogénea de ellos (7). Los trabajos que existen sobre FHAs han sido
encaminados ala obtención de información acerca como es que son formados estos filamentos y para ello ha
sido necesario identificar sus componentes básicos y aquellos asociados inespecíficamente (3). Existen
protocolos para el aislamiento de los FHAs partiendo de homogenado total de cerebros de pacientes con EA
con los que se ha logrado solubilizar hasta cierto grado los FHA´s y de ello se ha derivado una fracción
soluble a la que pertenecen los filamentos A68. Otra fracción purificada es la denominada IF2, la cual esta
compuesta por filamentos altamente insolubles. La información acerca de la caracterización “parcial” del los
FHAs, ha sido obtenida mediante el uso de tratamientos de extracción con álcali, detergentes, tratamientos
proteolíticos y análisis por microscopia electrónica tanto de filamentos intactos como procesados. A pesar de
que hay datos importantes en estos estudios, no existe una caracterización completa de las fracciones A68 ni
de IF2 en función de las nuevas especies patológicas truncadas que se han descrito recientemente. Novak en
1993 realizo estudios encaminados al la búsqueda de la composición de los filamentos IF2, que hoy en día
sabemos son parte muy importante de algunas de las lesiones de la EA. Estudios recientes han mostrado que
en particular en la fracción de filamentos IF2, se encuentran nuevas especies patológicas de proteína tau
como la truncada en el aminoácido 421, la cual es reconocida por el anticuerpo Tau C3 y es una de las
principales especies patológicas de la proteína tau que podría tener una participación importante en función
de su aparición temprana en la EA que es uno de los objetivos de estudio centrales de este trabajo.
2. RESULTADOS
Identificación de tau truncada en filamentos A68
Absorbancia
2.5
2
1.5
TauC3
46.1
1
0.5
0
1/32k
1/16k
1/8k
1/4k
1/2k
Concentración
Figura 1. Ensayo de ELISA para la identificación de proteína tau en filamentos A68. A partir de la fracción
filamentosa se obtuvo la fracción soluble A68. Se observa la abundante presencia de proteína tau truncada en
el aminoácido 421 reconocida por el anticuerpo Tau C3, mientras que la proteína tau completa reconocida
por el anticuerpo 46.1 que reconoce el extremo carboxilo no muestra un resultado positivo.
La proteína tau completa se encuentra en mayor proporción
en la fracción soluble respecto a la truncada.
1.2
Asorbancia
1
0.8
tau 12
0.6
46.1
tau C3
0.4
0.2
0
1/32k
1/16k
1/8k
1/4k
1/2k
Concentración
Figura 2. Ensayo de ELISA para identificación de la proteína tau en la fracción soluble de tejido cerebral de
pacientes con EA. A partir de muestra de tejido cerebral de pacientes con EA, se realizo un protocolo de
extracción del cual se obtuvo una fracción soluble y una fracción filamentosa. En la presente figura se
muestra la presencia de proteína tau completa reconocida en su extremo amino por el anticuerpo tau 12 en
mayor cantidad respecto a la proteína truncada en el aminoácido 421 reconocida por el anticuerpo 46.1.
Tau truncada esta presente en la fracción de filamentos insoluble
1.2
Absorbancia
1
0.8
TauC3
0.6
46.1
0.4
0.2
0
1/32k
1/16k
1/8k
1/4k
1/2k
Concentración
Figura 3. Ensayo de ELISA para la identificaciñon de proteina tau en la fracción IF2. A partir de la fracción
filamentosa obtenida de tejido cerebral de pacientes con EA, se obtuvo la fracciñon insoluble filamentosa
llamada IF2. Los resultados muestran la presencia de proteñina tau completa, reconocida en su extremo
carboxilo terminal por el anticuerpo 46.1 y tau truncada en el aminoacido 421, reconocido por el anticuerpo
tau C3.
Extracción e identificación de tau truncada en los filamentos
aislados de la fracción IF2
MPM
201.179
120.284
100.236
55.925
38.289
29.678
20.669
Carril
A B C
Figura 4. Western Blotting de la fracción solubilizada de la fracción IF2 por medio de extracción con NaOH
0.2 M al 20%. A partir de la fracción IF2, se realizaron procedimientos de extracción con NaOH 0.2 M al
20% para liberar proteína. Las muestras extraídas se corrieron en un gel SDS-PAGE al 10 % en condiciones
reductoras y desnaturalizantes, El reconocimiento de proteína tau se realizó utilizando los anticuerpos Tau C3
que reconoce la proteína tau truncada en el aminoácido 421, Tau 12 que reconoce el extremo amino y 46.1
que reconoce el extremo carboxilo terminal. Carril A: Anticuerpo tau C3, carril B: Anticuerpo Tau 12, carril
C: Anticuerpo 46.1.
tau truncada no es un componente estrechamente asociado a los
FHAs
Absorbancia
2
1.5
Tau C3
1
46.1
tau 12
0.5
0
1/500 1/1k
1/2k
1/4k
1/8k 1/16k 1/32k
Concentración
Figura 5. Ensayo de ELISA para la identificación de proteína tau en pastilla resultante de la extracción con
NaOH 0.2M al 20%. Una vez realizado el procedimiento de extracción con las condiciones de 20% de NaOH
0.2 M, la pastilla resultante se utilizo para detectar las poblaciones de proteína tau que aun permanecían en
ella por medio de la utilización de los anticuerpos Tau C3, 46.1 y tau 12. Los resultados obtenidos muestran
que en estas muestras resultantes predomina la presencia de la proteína tau con el extremo amino intacto la
cual es reconocida por el anticuerpo tau 12.
3. CONCLUSIONES
La proteína tau se encuentra formando parte esencial de los FHA´s que se encuentran presentes el las
MNF´s del cerebro de pacientes con EA. La proteína tau truncada en el aminoácido 421 fue aislada
principalmente en la fracción insoluble de filamentos purificados de cerebro. La proteína tau truncada fue
solubilizada de los filamentos de la fracción IF2 por medio de tratamientos consecutivos con álcali (NaOH
0.2M al 20%). En la fracción filamentosa IF2, se encuentra presente la proteína tau truncada en el aminoácido
421 y la proteína tau que conserva su extremo carboxilo intacto. Por último, se concluye que la proteína tau
truncada en el aminoácido 421, no es un componente estrechamente asociado al remanente mínimo de los
FHAs sometidos a tratamientos de extracción con álcali.
4. BIBLIOGRAFÍA
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