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Ciencia UANL
Universidad Autónoma de Nuevo León
[email protected]
ISSN (Versión impresa): 1405-9177
MÉXICO
2002
Jorge Guillermo Gómez Gutiérrez / Luis G. Bermúdez Humarán / Reyes Tamez
Guerra / Juan Manuel Adame Rodríguez / Roberto Montes de Oca Luna
PRODUCCIÓN Y PURIFICACIÓN DE LA TAQ DNA POLIMERASA A PARTIR DE E.
COLI RECOMBINANTE
Ciencia UANL, julio-septiembre, año/vol. V, número 003
Universidad Autónoma de Nuevo León
Monterrey, México
pp. 316-321
Producción y purificación
de la Taq DNA polimerasa
a partir de E. coli recombinante
Jorge Guillermo Gómez Gutiérrez*, Luis G. Bermúdez Humarán*, Reyes Tamez Guerra*, Juan Manuel
Adame Rodríguez**, Roberto Montes de Oca Luna*
L
a DNA polimerasa de Thermus aquaticus (Taq
DNA polimerasa) es la enzima usada en el
procedimiento del PCR (reacción en cadena
de la polimerasa). Este es un método extraordinario para la síntesis de ácido desoxirribonucleico
(DNA) in vitro. El PCR puede amplificar un gen o un
fragmento específico de DNA en varios millones de
veces en menos de dos horas. Sus vastas aplicaciones dieron lugar a un avance vertical en el área de
las ciencias biológicas. Dentro de algunas de las
aplicaciones del PCR se encuentran el diagnóstico
molecular de enfermedades genéticas humanas, de
infecciones virales y bacterianas, en estudios de evolución molecular, clonación y expresión de genes,
identificación de individuos, etc.
El PCR es una reacción de varios ciclos en cadena, donde cada ciclo se compone de tres etapas
que son: (a) desnaturalización del DNA, (b) hibridación de oligonucleótidos y (c) síntesis de DNA. En el
primer paso se separan las cadenas de DNA a temperaturas de aproximadamente 94oC, esto permite
que en el segundo paso se hibriden los oligonucleótidos a la región de DNA que se desea amplificar y,
finalmente, en el tercer paso la enzima Taq DNA
polimerasa lleva a cabo la síntesis de DNA a una
temperatura de 72 oC. Estos tres pasos se repiten en
un promedio de 30 veces. Es decir, que durante cada
ciclo los componentes de la reacción pasan por temperaturas muy elevadas a las cuales se inactivan la
mayoría de las enzimas. Originalmente el procedimiento del PCR se estableció usando la DNA polimerasa I de Escherichia coli. 1 Esta enzima no es
resistente a las temperaturas usadas en la
desnaturalización del DNA y por ende se adicionaba nueva enzima después del primer paso en cada
ciclo de reacción. Este problema se resolvió al sustituir la DNA polimerasa I de Escherichia coli por una
316
Representación tridimensional de la Taq DNA polimerasa.
enzima termoestable que no perdía su actividad a
dichas temperaturas. Esta enzima es la Taq DNA
polimerasa producida por la bacteria termófila
Thermus aquaticus.2 La Taq DNA polimerasa simplificó en gran medida la reacción de PCR al prescindir de adicionar enzima en cada uno de los 30
ciclos que se repite la reacción.
La importancia que cobró esta enzima determinó que se establecieran procedimientos para facilitar su purificación, a partir de la bacteria productora de esta enzima, Thermus aquaticus. Posteriormente, con el uso de la tecnología del DNA recombi*Laboratorio de Inmunología y Virología.
**Laboratorio de Micología Médica, Facultad de Ciencias Biológicas, UANL, [email protected]
CIENCIA UANL / VOL. V, No. 3, JULIO-SEPTIEMBRE 2002
JORGE GUILLERMO GÓMEZ G., LUIS G. BERMÚDEZ H., REYES TAMEZ G., JUAN MANUEL ADAME R., ROBERTO MONTES DE O.
nante el gen de la Taq DNA polimerasa se clonó a
partir de T. aquaticus y se expresó en Escherichia
coli.3 La expresión de este gen en E. coli facilitó su
producción y purificación.4
En el presente trabajo se describe la adaptación
de un procedimiento para la producción y purificación de esta enzima Taq DNA polimerasa, a partir
de una cepa recombinante de E. coli.
Metodología
Cepa recombinante de E.coli
y plásmido pTRC-Taq
Se introdujo por electroporación en una cepa DH5α
de E.coli (Stratagene) el plásmido pTRC-Taq (figura1), el cual porta el gen de la Taq DNA polimerasa
bajo la regulación del promotor lac. Para demostrar la presencia del gen de la Taq DNA polimerasa
se aisló el DNA plasmídico, según la técnica descrita por Birnboim and Doly (1979),5 se digirió con la
enzima de restricción XhoI por 2h a 37ºC y se analizó en un gel de agarosa al 0.8%, teñido con bromuro de etidio.
Producción de la Taq en medio LB versus TB
El medio TB es un medio más enriquecido y se alcanzan densidades celulares de bacterias mayores que
las que se obtienen con LB. Por tal motivo decidimos
probar si en el medio TB se obtenía un mayor producción de Taq DNA polimerasa que en el medio LB.
Para este propósito se preparó un preinóculo de
5 ml de la bacteria recombinante y se usaron 2.5
ml, para inocular 25 ml de ambos tipos de medio:
LB (peptona de caseína 1%, NaCl 1%, y extracto de
levadura 0.5%) y TB (peptona de caseína 1.2%, extracto de levadura 2.4% y glicerol 0.1ml). Se incubaron las bacterias hasta una densidad óptica, DO550
= 0.250 y se añadieron 20mg/ml de IPTG (Isopropyl
B D thiogalactopyranosido), para inducir la expresión del gen Taq DNA polimerasa y se incubó toda
la noche a 37°C con agitación. Posteriormente, los
cultivos se centrifugaron y la pastilla se resuspendió
en Buffer A (Tris 50mM pH 7.9, glucosa 50mM y
EDTA 1mM ) y se lisaron las células por sonicación.
Nuevamente se centrifugaron las células y se recuperó el sobrenadante del cual se prepararon diluciones (1:2, 1:4, 1:8, 1:16). La actividad de Taq
DNA polimerasa se determinó por PCR, amplificando el transgen p53 humano, a partir de genoma
murino. Lo anterior se hizo para las células proveCIENCIA UANL / VOL.V, No. 3, JULIO-SEPTIEMBRE 2002
nientes de cada medio, LB y TB.
Inducción de la expresión del gen Taq
Para determinar el tiempo óptimo de producción de
Taq DNA polimerasa, básicamente se hizo lo mismo que en el procedimiento anteriormente descrito,
con la diferencia que solamente se crecieron las bacterias en el medio LB, ya que como se verá más
adelante (resultados) en éste se obtuvo mayor actividad enzimática que en el medio TB. Se tomaron
muestras de 1ml del cultivo celular cada dos horas
durante 18h, a partir de la inducción con IPTG. Se
prepararon extractos celulares, mediante sonicación,
y se les determinó la actividad de Taq DNA polimerasa, de acuerdo a lo descrito en el punto anterior.
Purificación de Taq DNA polimerasa
Una vez que se demostró que el medio LB proporcionaba mayor actividad enzimática y que a las diez
horas de incubación se obtenía la mayor producción de Taq (ver resultados). Se inoculó 1 litro de
LB/Amp (40mg/ml) y se indujo la expresión de la
Taq con IPTG, como se describió anteriormente. Se
cosecharon las bacterias por centrifugación y se lavaron con Buffer A, posteriormente las bacterias se
resuspendieron nuevamente en Buffer A, conteniendo lisozima a 4 mg/ml, se incubó a temperatura
ambiente por 15 minutos (min) y se le adicionó un
volumen de Buffer B (10mM Tris pH 7.9, 1mM EDTA,
1mM PMSF, 0.5% Tween20, 0.5% IGEPAL). El lisado
celular se centrifugó a 25,000 rpm por 45 min en
un rotor SW 28. Al sobrenadante obtenido se le ajustó la concentración de KCl a 200 mM, se pasó por
una columna de DE52 (BIO-RAD), previamente preparada y equilibrada con buffer B. Se colectaron
fracciones de 5 ml y se combinaron aquéllas que en
ensayos de PCR presentaron actividad de Taq. Las
fracciones se dializaron toda la noche contra tres
volúmenes de Buffer C (HEPES 20mM, pH 7.9, EDTA
1mM, PMSF 0.5mM, Twen20 0.5% e IGEPAL 0.5%).
El dializado se pasó por una columna de resina Bio
Rex 70 (BIO-RAD), equilibrada con Buffer C, y la
Taq DNA polimerasa se eluyó con el mismo buffer,
conteniendo KCl a 200 mM. Se colectaron fracciones de 1ml y se les determinó la actividad de la enzima mediante un ensayo de PCR.
Medición de la actividad de Taq purificada
La actividad de la Taq purificada se determinó mediante la amplificación del transgen humano p53 a
317
PRODUCCIÓN Y
PURIFICACIÓN DE LA
TAQ DNA
partir de un genoma murino. Las reacciones de PCR
se realizaron en volúmenes de 25 µl, conteniendo
100 ng de cada oligonucleótido, desoxiribonucleótidos de trifosfato a una concentración final de 250
mM, 100 ng de DNA genómico y 1 µl, ya sea de
extractos celulares o fracciones de las columnas. Las
condiciones del PCR fueron (°C/min): un ciclo inicial de 94/4, 30 ciclos de 94/1, 56/1, 72/3 y un
ciclo final a 72/7. Para medir la actividad de la enzima purificada, así como su calidad, se realizaron
diferentes tipos de amplificaciones (sencillas y múltiples) y se usaron diferentes tipos de templados de
diferentes especies. Generalmente se usaron 100
ng de DNA genómico.
Almacenamiento de la Taq DNA polimerasa
Puesto que se obtuvo una enzima Taq DNA polimerasa con actividad biológica, es recomendable
almacenarla y mantenerla estable por un periodo
largo. Por lo tanto, decidimos probar dos diferentes
Buffers de almacenamiento y monitorear a través
del tiempo su actividad biológica. La enzima purificada se almacenó en dos diferentes tipos de buffer.
Esto se llevó a cabo con la diálisis de la enzima purificada contra 100 volúmenes de Buffer I (HEPES
20mM, KCl 100mM, EDTA 0.1mM, PMSF 0.5mM,
DTT 1 mM y Glicerol al 50%) o Buffer II (Tris 1M pH
8, DTT 1mM, EDTA 0.1mM, KCl 100mM, Tween
20 al 0.5%, IGEPAL al 0.5% y Glicerol 50%). La
enzima dializada se almacenó a -20ºC y se le determinó su actividad de Taq DNA polimerasa, a través del tiempo, a intervalos de tres meses.
Resultados
Aislamiento y caracterización
del gen de la Taq DNA polimerasa
Para corroborar que nuestra cepa recombinante de
E.coli porta el plásmido pTRC-Taq se realizó un aislamiento de DNA plasmídico por la técnica de miniprep (ver metodología) y se digirió con la enzima de
restricción XhoI. Ya que el gen Taq posee tres sitios
XhoI en las posiciones 461 ,1540 y 2487 pb, la
digestión del plásmido con esta enzima debe de
generar la liberación de dos fragmentos de 1079 y
947pb (figuras 1 y 2 ).
Producción de Taq DNA polimerasa en dos diferentes medios de cultivo
La bacteria recombinante se creció en los dos me318
POLIMERASA A PARTIR DE
E. COLI
RECOMBINANTE
Fig.1. Mapa del plásmido pTRC-Taq.
M 1 2
1 KK
1 Kb
1079 pb
947 pb
Fig. 2. Caracterización del plásmido que porta el gen de la
Taq DNA polimerasa. El plásmido se aisló de la bacteria
recombinante y se digirió con la enzima XhoI. Carril 1
plásmido sin digerir; carril 2 plásmido digerido, y M es el
marcador de peso molecular 1 Kb.
dios de cultivo, LB y TB (metodología), se indujo la
expresión del gen con IPTG y se comparó la actividad de la enzima producida en extractos celulares
preparados por sonicación. Se probaron diluciones
de los extractos celulares (1:2, 1:4, 1:8, 1:16). Los
resultados se muestran en la figura 3, donde se observa que los productos del ensayo de PCR son más
intensos en los extractos celulares de las bacterias
crecidas en LB (carriles 1 al 4), en comparación con
los extractos obtenidos del crecimiento en TB (carriles 5 al 8). Este resultado nos indica que existe una
mayor cantidad de actividad enzimática de Taq DNA
polimerasa en las bacterias crecidas en LB.
Cinética del tiempo óptimo de producción de
Taq
Debido a que en la bacteria recombinante el gen
de la Taq DNA polimerasa está bajo la regulación
del promotor lac, el cual es inducible con IPTG, era
necesario definir el tiempo óptimo para cosechar
las bacterias, después de la inducción con dicho inCIENCIA UANL / VOL. V, No. 3, JULIO-SEPTIEMBRE 2002
JORGE GUILLERMO GÓMEZ G., LUIS G. BERMÚDEZ H., REYES TAMEZ G., JUAN MANUEL ADAME R., ROBERTO MONTES DE O.
LB
M 1
2
TB
3
4
5
6
7
8
1.6 kb
1 kb
0.5 kb
Tg p53
Fig. 3. Determinación de la productividad de Taq DNA polimerasa en dos medios de cultivo: LB y TB. Se amplificó el
transgen p53 humano (Tgp53). Los carriles del 1 al 4 corresponden a diluciones (1:2,1:4,1:8,1:16) del extracto celular
obtenido del medio LB, los carriles del 5 al 8 son las diluciones (1:2,1:4,1:8,1:16) del extracto celular obtenido del medio TB.
ductor. Después de determinar la actividad de Taq
obtenida de muestras de cultivo tomadas cada 2 h,
a partir de la inducción hasta un máximo de 18 h,
encontramos que la actividad de Taq comienza a
detectarse a las 4 h, incrementándose progresivamente hasta las 10 h de crecimiento y disminuyendo a partir de las 12 h (figura 4). Estos resultados
indican que a las 10 h se observa mayor actividad
de Taq DNA polimerasa.
Hrs de crecimiento
Post-inducción
M
2 4
P C BII P C BII P C BII
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9
1 Kb
AM
AS
0.5 Kb
Fig. 5. Comparación de la actividad de la Taq purificada (P)
y de una enzima comercial (C). Se amplificó por PCR el gen
p53 murino, en estado heterocigoto: AM, alelo mutante; AS,
alelo silvestre. Carriles 1, 4 y 7 enzima purificada; carriles 2,
5 y 8 enzima comercial, y carriles 3, 6 y 9 corresponden a la
enzima purificada almacenada en Buffer II (BII). M es el marcador de peso molecular 1Kb.
6 8 10 12 14 16 18
1.6 kb
1 kb
0.5 kb
do heterocigoto y usando tres diluciones diferentes
(1:2, 1:4 y 1:8) de ambas enzimas. Los productos
de PCR, del alelo silvestre y del alelo mutado, indican que la Taq DNA polimerasa purificada (carriles
1, 4 y 7) presentó mayor actividad que la enzima
comercial (carriles 2, 5 y 8). Además, el almacenamiento de la enzima en un buffer diferente al I (Buffer II, metodología) no mejoró la estabilidad de la
Taq DNA polimerasa purificada (carriles 3, 6 y 9);
esto, debido a que nuestra enzima purificada mostró tener igual o mayor actividad que la comercial
(5 U/µl).
Tg p53
Fig. 4. Determinación del tiempo óptimo de inducción de
Taq DNA polimerasa. Actividad de la enzima en extractos
celulares obtenidos a los tiempos indicados (2 a 18 hrs) posterior a la inducción con IPTG. La actividad se determinó
mediante la amplificación del transgen Tg p53. M es el marcador de peso molecular 1 kb.
Comparación de la Taq DNA polimerasa purificada y una Taq comercial
La figura 5 se muestra la comparación de la actividad enzimática de la Taq DNA polimerasa purificada en comparación con una enzima comercial
(BioSelec). Para este propósito se realizó un ensayo
de PCR para amplificar un gen p53 murino en estaCIENCIA UANL / VOL.V, No. 3, JULIO-SEPTIEMBRE 2002
Funcionalidad de la Taq DNA polimerasa
A la enzima purificada se le probó su habilidad de
amplificar DNA, a partir de genomas de diferentes
organismos y condiciones de reacción. Primero se
determinó la funcionalidad de nuestra enzima para
la amplificación simultánea de varias regiones del
genoma humano (PCR múltiple, figura 6).
M
1
2
3
4
400 pb
100 pb
50 pb
Fig. 6. PCR múltiple del brazo largo del cromosoma Y usando la Taq DNA polimerasa purificada. M marcador de peso
molecular 50 pb; carriles 1 al 4 productos de PCR esperados de acuerdo al estuche comercial.
319
PRODUCCIÓN Y
PURIFICACIÓN DE LA
TAQ DNA POLIMERASA
En este experimento se usaron todos los reactivos de un estuche de amplificación de diferentes
regiones del brazo largo del cromosoma Y, sustituyendo la Taq del estuche por nuestra enzima. El
resultado obtenido fue el mismo patrón de bandas
esperadas, de acuerdo con el estuche comercial.
Por otro lado, se probó la habilidad de la enzima purificada para amplificar DNA de aves. En la
figura 7 se muestra el resultado que corresponde a
un procedimiento de sexado molecular de aves
monomórficas, en donde se amplificaron regiones
específicas de los cromosomas sexuales Z y W. Los
machos poseen dos cromosomas Z y amplifican una
sola banda (carriles 1, 2, 4, 5, 7 y 9) y las hembras
poseen un cromosoma Z y un W, y amplifican dos
bandas (carriles 3, 6 y 8).
M1 2 3 4 5 6 7 8 9
400 pb
100 pb
W
Z
Fig. 7. Amplificación de los genes CHD-W de la hembra y
CHD-Z del macho. Carriles del 1 al 5, Amazona
leucocephalla y carriles del 6 al 9 pertenecen a Lory sp.
Estabilidad de la enzima purificada
La enzima purificada se almacenó a –200C en dos
diferentes buffers y se monitoreó su actividad a través del tiempo, mediante la amplificación por PCR
del Tg p53 humano a partir de genoma murino. En
la figura 8 se muestra el resultado de la actividad
de Taq DNA polimerasa a los tres, seis y nueve meses de almacenamiento (panel A, B y C, respectivamente). En los dos primeros paneles se aprecia que
la intensidad de las bandas es comparable en ambos buffers, es decir que la actividad permanece
similar hasta los seis meses. Por el contrario a los
nueve meses de almacenamiento (panel C) existe
una actividad ligeramente mayor en la enzima almacenada en el Buffer I.
Conclusión y discusión
En este trabajo se logró implementar un procedimiento para la purificación de la enzima Taq DNA
320
A PARTIR DE
M BII BI
E. COLI
RECOMBINANTE
M BII BI
M BII BI
Tg p53
(A)
(B)
(C)
Fig. 8. Monitoreo de la Taq DNA polimerasa con respecto a
su actividad a través del tiempo en dos tipos de Buffers de
almacenamiento (BII y BI). Panel A, B y C, enzima con 3, 6 y 9
meses de almacenamiento. M es el marcador de peso molecular 1Kb.
polimerasa, a partir de una bacteria recombinante
de E.coli. En general la actividad de la enzima purificada fue similar a la de una Taq DNA polimerasa
comercial bajo condiciones estándar de nuestro laboratorio. La cantidad producida a partir de 1Lt de
cultivo fue ~ 100,000 U. Dos puntos importantes
de resaltar de la enzima purificada son: (1) su reproducibilidad para amplificar los alelos del gen
endógeno p53 murino (figura 5), con los cuales normalmente se presentaban problemas en nuestro laboratorio con la enzima comercial y (2) la enzima
purificada amplificó secuencias de DNA bacteriano,
a partir de DNA aislado de tejido bovino embebido
en parafina, nuevamente con mayor reproducibilidad que la enzima comercial usada en este trabajo
(datos no mostrados). Asimismo, la enzima purificada se ha probado en dos estuches comerciales, uno
de PCR múltiple para la detección de microdeleciones del cromosoma. Y, y otro para reacciones de
RT-PCR en la amplificación de DNAs complementarios humanos y virales (datos no mostrados). En ambos casos el uso de la Taq DNA polimerasa purificada funcionó en igual medida que la enzima Taq DNA
polimerasa presente en el estuche. Las comparaciones fueron hechas de manera cualitativa y no cuantitativa. Finalmente, la vida media de la Taq bajo
condiciones de almacenamiento en nuestro laboratorio ha sido superior a un año. En conclusión se
implementó un procedimiento para la producción y
purificación de la Taq DNA polimerasa a partir de
una cepa recombinante de Escherichia coli.
Agradecimientos
Este proyecto CN 314-00 fue apoyado por el programa PAICYT de la Universidad Autónoma de Nuevo
León.
CIENCIA UANL / VOL. V, No. 3, JULIO-SEPTIEMBRE 2002
JORGE GUILLERMO GÓMEZ G., LUIS G. BERMÚDEZ H., REYES TAMEZ G., JUAN MANUEL ADAME R., ROBERTO MONTES DE O.
Resumen
Referencias
En el presente trabajo se implementó un método para
la producción y purificación de la enzima Taq DNA
polimerasa, a partir de una cepa recombinante de
Escherichia coli. Se determinó el tiempo de mayor
producción en cultivo, se probaron dos diferentes
medios para el crecimiento de dicha bacteria y dos
diferentes buffers de almacenamiento para la enzima purificada. A partir de un litro de cultivo se logró
obtener enzima Taq DNA polimerasa equivalente a
100,000 unidades. Esta enzima purificada se ha
utilizado en protocolos estándar de laboratorio para
la amplificación de secuencias genómicas de bacterias, virus, aves, ratones, bovinos y humanos, mostrando ser igual o más eficiente que una preparación comercial. La actividad de la enzima purificada
ha permanecido estable durante al menos nueve
meses de almacenamiento a –200C.
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Palabras clave: Taq DNA polimerasa, PCR, PCR
múltiple, Purificación.
Abstract
In the present work we developed a protocol to produce and isolate Taq DNA polymerase of
recombinant Escherichia coli. We determined the
optimum time of Taq DNA polymerase production.
We tested two different culture media for the growth
of the recombinant bacterium and two different
storage buffers for enzyme stability. From one liter
media culture we obtained 100,000 units of said
enzyme. This enzyme was used for gene amplification
from different organisms such as birds, mice, human
and bacteria. The enzyme activity has been stable
for at least nine months at –20ºC storage.
Keywords: Taq DNA polymerase, PCR, PCR
multiplex, Purification.
CIENCIA UANL / VOL.V, No. 3, JULIO-SEPTIEMBRE 2002
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