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IV CURSO AVANZADO WHO GSS 2006 Buenos Aires 15-24 de mayo de 2006 PCR “Reacción en cadena de la polimerasa” Martes 16 de mayo Bioq. Elizabeth Miliwebsky Servicio Fisiopatogenia, Departamento Bacteriología INEI – ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán” Estructura del ADN Nucleótido OH Grupo fosfato -O P O O H2C Adenina Timina 5´ 4´ Base Nitrogenada 1´ H H H H 2´ 3´ OH H Azúcar desoxirribosa Guanina Citosina Estructura del DNA Fundamento PCR or replicación enzimática de una ecuencia específica de ADN se btiene un producto fácilmente etectable luego ciclos repetitivos e polimerización Etapas de la reacción 3´ 5´ + 3´ 5´ 3´ 5´ 3´ Fragmento Gen 5´ 3´ Gen Gen Gen 5´ 5´ 3´ 3´ ADN blanco DNA blanco Desnaturalización (95ºC) 5´ Desnaturalización + 5´ 3´ 3´ 5´ 5´ 3´ 3´ 5´ 3´ 5´ 3´3´ 3 ´ 3´ 5´ 3´ 3´ 30 – 50 Ciclos 5´ 5´ 3´ 5´ Pegado del primer (55º-65ºC) 5´ 5´ 5´ 3´ Polimerasa d-NTP Mg++ Polimerización Polimerasa + dNTP +Mg (72ºC) 5´ 5´ 3´ 5´ Productos de Acumulación exponencial de la secuencia blanco en el orden de: 2n (n = número de ciclos) Número de ciclos Concentración de ADN blanco Componentes de la reacción d-ATP d-GTP d-CTP d-TTP •Primers •Polimerasa •Mg++ + ADN Producto blanco de amplificación ADN Blanco Longitud del fragmento a amplificar: 100 a 2000 pb Muestra conteniendo el ADN blanco no necesariamente debe estar altamente purificada. Impurezas que pueden interferir e inhibir la amplificación: hemo, heparina, agentes quelantes, detergentes, metales pesados, etc. PRIMERS Oligonucleótidos cortos de simple cadena: Longitud al 10-30 nucleótidos Alta afinidad con la secuencia de reconocimiento del N blanco: extremo 3´ de mayor complementariedad mbos primers deben tener un contenido de G+C similar aja concentración de estos nucleótidos en el extremo 3´ os extremos 3´de ambos primers no deben ser mplementarios entre sí eleccionar primers sin estructura secundaria porque dría interferir en la reacción. Programas para diseño de “primers” merGen searches strings of amino acid residues in order to reverse-translate gonucletide primers of a desired range of lengths and maximum number of generacies. mer (Stanford) Sun Sparcstations only mer (Whitehead) Unix, Vms (and DOS and Mac if you can compile it) mplify, Bill Engels (Macintosh only), is for use in designing, analyzing, and mulating experiments involving the polymerase chainreaction (PCR). You can tain your copy of Amplify here merDesign 1.04, a DOS-program to choose primer for PCR or oligonucleotide obes. See also the PrimerDesign Welcome Page. -Rare, a new software by R. Griffais, which uses a rare octamer at the 3' termini the primer. This powerful (but user friendly) software is available for Macintosh d Windows environment. mer Design, a Java applet by Luca Ida Giovanni TOLDO. ODEHOP, PCR primers designed from protein multiple sequence alignments ocal mirror site at WIS). mer3, an online service to pick PCR primers from nucleotide sequence. (Local rror site at WIS). Magnesio Es indispensable para la actividad de la enzima y ecta el apareamiento de los primers Desoxiribonucleótidos (dNTPs) on requeridos en concentraciones óptimas para dar pecificidad y fidelidad a la reacción Buffer de reacción El buffer recomendado es 10 a 50 mM Tris-HCl H 8.3 a 8.9) El aumento de la concentración de Tris-HCl, o el mento del pH, puede aumentar la formación de oductos inespecíficos de PCR DNA polimerasa aq polimerasa (Thermus aquaticus) NA polimerasa termoestable y termoactiva ene actividad polimerasa y exonucleasa 5´- 3´ Actividad enzimática: Vida media 40´a 95ºc emperatura óptima de polimerización: 72ºC emp. > 96ºC inactivación de la enzima DNA polimerasas termoestables ffel : es más estable, actúa sobre DNA blanco rico en (Thermus thermophilus): tiene actividad de criptasa reversa nt DNA polimerasa (Thermococcus litoralis): Tpo vida util a100ºC (Pirococcus furiosus):tiene un porcentaje bajo de poración errónea de nucleótidos Procedimiento 9 Preparación de la muestra de ADN 9 Preparación de la mezcla de reacción 9 Programa de amplificación 9 Electroforesis de los productos de Preparación de la muestra de ADN Bacteria Genoma bacteriano Aislamiento bacteriano . Espécimen clínico, alimento . Extracción del DNA Método físico -químico Hervir +detergente Tratamiento para eliminar inhibidores Preparación de la mezcla de reacción Par de“primers ” específicos 5 6 A DN Polimeras a termoestable 7 A DN temp lado Buffer p/ ADN Pol. 2 MgCl 2 4 1 dCTP dATP d H2O estéril Preparación de la mezcla de reacción Reactivos Rangos de Concentración recomendados * Buffer dNTP (d-ATP, d-GTP, d-CTP, d-TTP) Cl2Mg “Primers” Taq polimerasa 1X 20-200 µM 0.2-0.4 mM 0.1-0.5 µM 1-5 U DNA Blanco Vol Total 0.05-1 µg 50-100 ml os de concentración de los reactivos en la mezcla de reacción recomendados en la rafía. La concentración de trabajo de cada reactivo se ajusta de acuerdo a la Temper atura ºC Amplificación Variación de temperatura durante un ciclo de PCR Desn atu ra li za ción 95 72 60 30 Exten sión Pega do d e prim ers Desnaturalización La temperatura de desnaturalización recomendada para gurar una completa separación de las cadenas es de 94-95ºC El tiempo va a depender de la secuencia y contenido de G+C Bajas temperaturas Altas temperaturas desnaturalización incompleta inactivación de la enzima Pegado de Primers o “Annealing” pende de la composición de bases, tamaño y entración del “primer” mperatura de pegado de primers o “annealing” (Ta): C)+2(A+T) mperatura generalmente usadas: 55 a 65ºC mperatura de “annealing” astringentes aumentan la cificidad de la reacción jas temperaturas amplificación de fragmentos Polimerización o Extensión se utiliza la Taq la temperatura de extensión ma es 72ºC tiempo de extensión depende de la centración, del tamaño de la secuencia del ADN co. ara períodos largos de extensión es necesario rporar gelatina o seroalbúmina bovina al buffer eacción para estabilizar la enzima. CICLADOR TERMICO Electroforesis de los productos de amplificación Cuba electroforética - ____ + Gel BrEt + Luz UV ____ _ _ _ _ _ Fuente Electroforesis de los productos de amplificación Identificación del producto de amplificación Molécula BrEt Mol. de BrEt intercalada BrEt Identificación del producto de amplificación Factores que influyen en la sensibilidad de la técnica Bajas concentraciones de reactivos Se obtiene bajo rendimiento Temp. de annealing A temp. altas no se pegan los primers Temp. de extensión Se debe seleccionar la óptima para la enzima utilizada Temp. de desnaturalización Si se requieren temp. altas se debe seleccionar una enzima estable a esa temperatura y se recomienda la utilización de cosolventes Impurezas del DNA posibles inhibidores Se requiere la purificación del DNA blanco Primers concentración, dilución y conservación Se deben preparar soluciones estables que no inhiban la reacción. Conservar a –20C. Enzima polimerasa Fragmentos largos o complejos requieren de la estabilización de la enzima para que mantenga la actividad. Nucleótidos Evitar concentraciones altas que inhiben a la actores que influyen en la especificidad de la técnica Altas concentraciones de reactivos Baja temperatura de annealing Baja temperatura de extensión on altas concentraciones de nucleótidos Se producen productos inespecíficos Estandarización Ajustar temperatura de pegado de primers Ajustar la concentración de cada uno de los componentes de la reacción manteniendo constante la de los demás reactivos Tener en cuenta que la reacción es muy sensible a la concentración de Cl2Mg y a Estandarización Cl2Mg 1,25 mM 1 mM 1,5 mM Estandarización pecificidad Prueba con cepas de referencia Prueba con cepas autóctonas de igual especie Prueba con cepas de otras especies Inconvenientes de la reacción 9Contaminación cruzada entre especímenes 9Contaminación de un cultivo a un espécimen 9Contaminación por el producto amplificado Laboratorio de PCR Areas de Trabajo 9 Reactivos y preparación de la mezcla 9 Espécimen, cultivo y extracción de DNA 9 Amplificación 9 Detección de productos de amplificación Laboratorio para PCR Preparación de Reactivos Antecámara Preparación de Muestras Area de Amplificación Antecámara Antecámara Pasillo Análisis de Productos Laboratorio de PCR Area de reactivos 9 Preparación de una mezcla general 9 Agregar la enzima en último lugar 9 Tips con filtros y pipetas para reactivos 9 Centrifugar previamente los reactivos 9 Cerrar cada tubo después de su uso Area de reactivos Laboratorio de PCR Area de preparación de la muestra Extracción de DNA 9Utilizar pipetas para DNA 9Precaución de no producir aerosoles 9Ajustar las tapas de los tubos de PCR Area de preparación de la muestra Extracción de DNA Descontaminación Hipoclorito de sodio 10% Superficies inertes Luz UV 254-300nm 10 minutos Tipos de PCR aplicadas al diagnóstico 9 Multiplex- PCR Identificación de diferentes fragmentos en una misma reacción 9Nested-PCR Dos rounds de amplificación ltiplex-PCR stx1 / stx2 / rfb O157 p p p ncias , D. R.; Johnson, W. M.; Lior, H.; Tyler, S. D. and Rozee K. R.. Rapid and specific n of verotoxin genes in Escherichia coli by the polimerase chain reaction. J. Clin. ol.1990, 28:540-5. ltiplex-PCR stx1 / stx2 / rfb O157 Secuencia del primer (5’-3’) Primer Stx1a GAAGAGTCCGTGGGATTACG Stx1b AGCGATGCAGCTATTAATAA Stx2a TTAACCACACCCCACCGGGCAGT Stx2b GCTCTGGATGCATCTCTGGT O157F CGGACATCCATGTGATATGG O157R TTGCCTATGTACAGCTAATCC Cepas de referencia Tamaño del fragmento de amplificación (pb) 130 346 259 Control E. coli EDL933, O157:H7 Stx1/Stx2 Positivo E. coli ATCC 25922 sin factores de virulencia Negativo ltiplex-PCR stx1 / stx2 / rfb O157 Reactivo ffer Concentración de trabajo del reactivo Concentración del reactivo en la mezcla Volumen del reactivo en la mezcla para una determinación (µl) 10X 1X 5 zcla dNTP 2,5 mM 0,1 mM 2 Mg 25 mM 1,5 mM 3 mer stx1a 0,1 nmol/µl 2 pmol/µl 1 mer stx1b 0,1 nmol/µl 2 pmol/µl 1 mer stx2a 0,1 nmol/µl 0,4 pmol/µl 0,2 mer stx2b 0,1 nmol/µl 0,4 pmol/µl 0,2 mer O157F 0,1 nmol/µl 0,6 pmol/µl 0,3 mer O157R 0,1 nmol/µl 0,6 pmol/µl 0,3 q polimerasa 5 U/µl 0,02 U/µl 0,2 mplado 2 O ddd 34.8 ultiplex-PCR stx1 / stx2 / rfb O157 Programa de amplificación Paso Nº Etapa Temperatura ºC Tiempo 1 Desnaturalización 94 5 min 2 Desnaturalización 94 30 seg 3 Pegado de primers ó Annealing 58 30 seg 4 Extensión 72 30 seg 5 Extensión 72 2 min Va al paso Nº Nº veces 2 29 PCR Enterohemolisina IMER SECUENCIA DEL OLIGONUCLEOTIDO (5’-3’) TAMAÑO FRAGMENTO lyA1 GGTGCAGCAGAAAAAGTTGTAG 1551 lyA4 TCTCGCCTGATAGTGTTTGGTA cia PCR Enterohemolisina Cepas de referencia Control E. coli E32511 Positivo E. coli ATCC 25922 sin factores de virulencia Negativo Reactivo Buffer Concentración de trabajo del reactivo Concentración del reactivo en la mezcla Volumen del reactivo en la mezcla para una determinación (µl) 10X 1X 5 Mezcla dNTP 2,5 mM 0,1 mM 2 Cl2Mg 25 mM 1,5 mM 3 Primer hlyA1 0,1 nmol/µl 0,4 pmol/µl 0,2 Primer hlyA4 0,1 nmol/µl 0,4 pmol/µl 0,2 5 U/µl 0,03 U/µl 0,2 Taq polimerasa Templado 2 H2O ddd 37,4 PCR Enterohemolisina Programa de amplificación Paso Nº Etapa Temperatura ºC Tiempo 1 Desnaturalización 94 5 min 2 Desnaturalización 94 30 seg 3 Pegado de primers ó annealing 58 90 seg 4 Extensión 72 90 seg 5 Extensión 72 3min 6 Pausa 4 Va al paso Nº Nº veces 2 29 R Factor eae SECUENCIA DEL OLIGONUCLEOTIDO (5’-3’) TAMAÑO FRAGMENTO pb K1 CCCGAATTCGGCACAAGCATAAGC 864 K2 CCGGATCCGTCTCGCCAGTATTCG MER cia R Factor eae Cepas de referencia Control E. coli 2348/69 (EPEC) Positivo E. coli E32511 (STEC) Positivo E. coli ATCC 25922 sin factores de virulencia Negativo Reactivo Buffer Concentración de trabajo del reactivo Concentración del reactivo en la mezcla Volumen del reactivo en la mezcla para una determinación (µl) 10X 1X 5 Mezcla dNTP 2,5 mM 0,1 Mm 2 Cl2Mg 25 mM 1 mM 2 Primer SK1 0,1 nmol/ul 0,4 pmol/ul 0,2 Primer SK2 0,1 nmol/ul 0,4 pmol/ul 0,2 5 U/ul 0,02 U/ul 0,2 Taq polimerasa Templado 2 PCR Factor eae Programa de amplificación Paso Nº Etapa Temperatura ºC Tiempo 1 Desnaturalización 94 5 min 2 Desnaturalización 94 30 seg 3 Pegado de primers ó annealing 54 1 min 4 Extensión 72 2 min 5 Extensión 72 2 min Va al paso Nº Nº veces 2 29 R fliC H7 MER SECUENCIA DEL OLIGONUCLEOTIDO (5’-3’) H7-F GCGCTGTCGAGTTCTATCGAGC H7-R CAACGGTGACTTTATCGCCATTCC cia TAMAÑO FRAGMENTO Pb 625 PCR fliC H7 Cepas de referencia Control E. coli EDL933, O157:H7 Positivo E. coli ATCC 25922 sin factores de virulencia Negativo Reactivo Buffer Concentración de trabajo del reactivo Concentración del reactivo en la mezcla Volumen del reactivo en la mezcla para una determinación (µl) 10X 1X 5 Mezcla dNTP 2,5 mM 0,15 mM 3 Cl2Mg 25 mM 1,5 mM 3 Primer FLICH7-F 0,1 nmol/µl 0,6 pmol/µl 0,3 Primer FLICH7-R 0,1 nmol/µl 0,6 pmol/µl 0,3 5 U/µl 0,02 U/µl 0,2 Taq polimerasa Templado 2 PCR fliC H7 Programa de amplificación Paso Nº Etapa Temperatura ºC Tiempo 1 Desnaturalización 94 1 min 2 Desnaturalización 94 15 seg 3 Pegado de primers ó annealing 60 15 seg 4 Extensión 72 75 seg 5 Extensión 72 5 min 6 Pausa 4 Va al paso Nº Nº veces 2 34 Muchas gracias!!!!!!!
