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APLICACIONES PCR
Aplicaciones de la PCR
- Clonar un gen (molde ADN o ARN)
- Secuencia conocida
- Genes homólogos en especies próximas (primers degenerados)
- Información de secuencia proteica (primers degenerados)
- Rastreos de genotecas en pools
- PCR inversa para clonar gen completo
- Herramienta en construcciones plasmídicas
- Análisis de recombinantes y eventos infrecuentes en el ADN
- Mutagénesis in vitro
- Corte y ligación de fragmentos de ADN in vitro
- Construcción de genes sintéticos o fragmentos in vitro
- Conocer la CDS de un gen, localizar los intrones, (RT-PCR)
- Detectar expresión de un gen, semicuantitativo, (RT-PCR)
- Real Time, PCR cuantiativa, (RT-PCR)
- Clonar extremos 5’ y 3’ de un transcrito: RACE, (RT-PCR)
- Diagnóstico e identificación
- Tipado, clasificación, taxonomía (RAPDs, AFLPs, SSRs, SNPs, etc)
- Aplicaciones forenses
RT-PCR
- Esencialmente es una reacción de síntesis de cDNA más una PCR con primers
específicos para amplificar un fragmento a partir de un ARN mensajero
- Tres tipos de primer para síntesis de cDNA
- Oligo dT: síntesis de cDNA inespecífica, el primer antisentido puede ser el
poli-T u otro específico
- Primer específico: el primer antisentido puede ser el mismo que el de la
reacción de síntesis de cDNA u otro situado más hacia 5’ del transcrito
- Hexanucleótidos al azar: se obtienen diversos fragmentos de distinto
tamaño en la reacción de la primera heba de cDNA
- Suelen obtenerse fragmentos de cDNA del transcrito, quedando fuera el extremo 5’ y
a menudo el 3’. Para amplificar el cDNA hasta los extremos 5’ y 3’ del transcrito se
utiliza la técnica RACE.
RT-PCR
5’ y 3’-RACE
RACE: Rapid amplification of
cDNA ends
Nos permite conocer el sitio de inicio
de la transcripción de un gen y las
secuencias 5’UTR y 3’UTR
PCR en tiempo real
- Es una RT-PCR en la cual no se detecta cuanto cDNA se acumula al final, sino que se va
midiendo de continuo para determinar en que ciclo de la PCR se alcanza un valor umbral.
Cuanto antes se alcance (número de ciclos más bajo) mayor será la concentración inicial
del ARNm. Por comparación con un control (gen de expresión constitutiva) pueden
determinarse las diferencias
de expresión de un gen en diferentes
tejidos, condiciones, poblaciones, etc.
CT: Threshold cycle. Ciclo en el cual
un incremento significativo de Rn es
detectado por primera vez
Rn+: Intensidad emisión en reacciones
Rn-: Intensidad emisión en controles
sin molde
Rn: Rn+ - Rn-
PCR en tiempo real
La cantidad de DNA se detecta mediante una sonda específica que hibrida
con los fragmentos de DNA que se van amplificando y que lleva incorporado
un fluorocromo en su extremo 5’. En cada ciclo de amplificación la sonda
emite fluorescencia cuando es desprendida por la polimerasa, la cual es
detectada mediante láser por el termociclador. Este sistema detecta
específicamente la amplificación de un determinado gen.
También puede utilizarse SYBR green, que se une inespecíficamente a
cualquier DNA que se esté amplificando
PCR en tiempo real
Detección y clonación de productos de PCR
El resultado de una PCR se visualiza en geles de agarosa o poliacrilamida dependiendo
del tipo de experimento y el número de bandas esperado
Para comprobar si se ha amplificado el fragmento correcto hay varios métodos: Digestión
mediante enzimas de restricción, secuenciación, hibridación, nueva PCR con otros
primers interiores.
Clonación de fragmentos de ADN amplificados por PCR
- Ligación de extremos
romos cuando se usa
Pfu o Pwo.
Clonación de fragmentos de ADN amplificados por PCR
- La utilización de primers con una secuencia
diana para una enzima de restricción en su
extremo 5’ se usa como sistema de clonación
eficiente de productos de PCR. Tiene además
otras aplicaciones en técnicas de ingeniería
genética, construcción de plásmidos, etc.
Corte y ligación de fragmentos: PCR recombinante
Corte y ligación de fragmentos: PCR recombinante
- En este ejemplo se eliminan mediante PCR los intrones de un gen (I-1 y I-2)
- La parte 5’ de los primers 1 y 6 contiene sitios de corte para enzimas de restricción para
facilitar su clonación
- La parte 5’ de los primers 2, 3, 4 y 5 contiene secuencias pertenecientes al exón del otro
lado del intrón correspondiente.
- Se amplifican primero los fragmentos 1-2, 3-4 y 5-6 por separado
- Se mezclan los productos 1-2 y 3-4 y amplificando con los primers 1 y 4 se obtiene el
fragmento 1-4
- El producto final, 1-6, se obtiene mezclando 1-4 y 5-6 y amplificando con primers 1 y 6
- Clonación
mediante PCR
- Primers degenerados, diseñados a partir de:
- Genes homólogos de otras especies
- Secuencia aminoacídica obtenida a partir de la proteína
Si con la secuencia aminoacídica se ha logrado identificar en las bases de
datos de que proteína se trata, se hacen búsquedas para encontrar
secuencias de genes y proteínas homólogas y se alinean para localizar
regiones conservadas.
- Clonación
mediante PCR. Primers degenerados
- Clonación
mediante PCR. Primers degenerados
CCN GCN GAR TTY GTN ATH GTN AAY CCN AAY AAR
GGN CGN CTY AAR CAN TAD CAN TTR GGN TTR TTY
P
A
E
F
V
I
V
N
P
N
K
GGC
GGC
GGC
GGA
GGA
GGT
GGT
GGT
GGT
GGA
GGT
CAA
CAA
CAA
CGA
CGA
CGA
CGA
GCA
CGA
CCA
ATA
CTC
CTC
CTC
CTT
CTT
CTT
CTT
CTT
CTC
CTC
CTT
GAC
GAC
GAC
GAA
GAA
GAA
GAA
GAA
GAA
GAA
AAG
AAT
AAT
GAT
CAA
CAA
CAA
CAA
CAA
CAA
AGT
GTG
TAT
TAT
TAT
CAC
CAC
CAC
CAC
CAC
CAA
CAC
TAA
CAT
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CAA
CAA
CAA
CAA
CAA
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CAC
CAC
CAC
TTG
TTG
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TTA
TTA
TTA
TTA
TTA
TTA
TTA
TTG
GGC
GGC
GGT
GGT
GGT
GGT
GGT
GGT
GGT
GGA
GGC
TTG
TTG
GTT
TTG
TTG
TTG
TTG
TTG
TTG
TTG
TTG
TTC
TTC
TTC
TAA
TAA
TAA
TAA
TAA
TTT
TTC
GCT
GGA CGA CTT AAA CAA TAT CAA TTA GGT TTG TTA
T
C
G
T
A
T
G
C
C
C
C
A
5’-AT AAC AAA TTC AGC AGG-3’
C
T
C
5’-AC TAT AAC AAA TTC AGC-3’
A
C
Ara
Ara
Bra
Lat
-Pisum
-Lens_cul
-Lens
-Euph
Cic
Gly
Ara
- Clonación
mediante PCR. Primers degenerados
Nested PCR
- PCR
inversa
- Para clonar por PCR las
regiones adyacentes a
una región previamente
clonada y secuenciada