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VIGILANCIA EPIDEMIOLÓGICA DEL VIRUS RABIA EN ANIMALES DE VIDA SILVESTRE.
Resumen. En México se cuenta con programas de control y vigilancia del virus de la rabia en
humanos y animales domésticos, así como para el murciélago hematófago, pero no así a los
murciélagos no hematófagos, los cuales pueden desempeñar un papel importante no solo en la
diseminación del virus entre especies, sino que resultan un riesgo potencial de transmisión
incidental al hombre y no menos importante es el impacto económico en animales de producción.
En México se han identificado una gran variedad de especies animales positivos al virus de la rabia,
nuestro grupo de trabajo tenía el propósito de colectar muestras de varias de ellas, sin embargo
dado a las colaboraciones cercanas con la SAGARPA y el Servicio Nacional de Sanidad Inocuidad y
Calidad Agropecuaria del estado de San Luís Potosí, así como las facilidades que proporcionó el
CIIDIR unidad Sinaloa para realizar un monitoreo en un municipio de la entidad, se decidió
enfocarse a la colecta de murciélagos como parte del monitoreo de la rabia paralítica bovina. Así que
en el presente estudio se trabajó con muestras solamente de murciélagos.
Por lo anteriormente expuesto, nuestro grupo de trabajo participan activamente en la creación de
un programa de vigilancia de esta enfermedad en murciélagos de vida silvestre, con el fin de realizar
la caracterización molecular de las variantes del virus que circulan en estos animales, para
establecer un patrón de diseminación del virus interespecies, así como la caracterización de las
secuencias que codifican para el exodominio de la proteína G, la cual esta involucrada en la
interacción virus-célula, con el fin de determinar si existe variabilidad que de lugar a cambios en la
estructura proteínica, con el fin de conocer si este sitio potencialmente antigénico esta involucrado
en la diversidad de hospederos del virus.
Introducción
La rabia es una zoonosis de distribución mundial, con excepción de la mayor parte de Oceanía, en la
que el ser humano es afectado en forma accidental. Es una de las enfermedades más antiguas del
mundo de las que se tienen conocimiento, y en el hombre es mortal a corto plazo pues solamente
sobreviven quienes reciben profilaxis antirrábica adecuada; y desde una perspectiva de salud
pública se estima que entre 45,000 y 60,000 personas mueren de rabia cada año en el mundo. El
virus de la rabia pertenece a la Orden de Mononegarivales, Familia de Rhabdoviridae. Entre los
rhabdovirus que infectan a mamíferos se tienen tres géneros: Vésiculovirus (virus de la estomatitis
vesiculosa, VSV), Lyssavirus (virus de la rabia) y Ephémérovirus (virus de la fiebre efímera bovina).
El genoma del virus de la rabia es RNA de una sola cadena de polaridad negativa, que codifica 5
1
proteínas, Nucleoproteína (N), fosfoproteína (P), proteína de matriz (M), glicoproteína (G) y la
polimerasa (L). Del virus de la rabia se tienen identificados 7 serotipos, en los cuales se ven
involucrados tanto animales domésticos (perros, gatos, roedores) como animales de vida silvestre
(murciélagos hematófagos, insectívoros y frugívoros, así como diferentes tipos de carnívoros) y el
hombre. Estos serotipos han sido identificados en diferentes países alrededor del mundo. En el
Continente Americano el virus de la rabia se mantiene, en condiciones naturales, a través de los
siguientes ciclos: urbano (perro-perro), en vida silvestre en animales terrestres (coyote, zorrillo,
mapache y mangosta, entre otros) y aéreo (en poblaciones de murciélagos hematófagos, no
hematófagos). En México, se tiene evidencia de la presencia de estos ciclos a través del diagnóstico
por laboratorio en algunas de estas especies. En los estudios clínicos epidemiológicos de rabia en el
humano se identifican como especies trasmisoras de estas zoonosis principalmente el perro,
seguido del murciélago, zorrillo y coyote. Sin embargo, en diversos países se ha logrado controlar el
ciclo urbano de la rabia (perro-perro), pero el número de casos de rabia trasmitidos por fauna
silvestre se está incrementando. En América Latina se informaron en la Organización Panamericana
de la Salud 18 casos de rabia en humanos durante el 2006, de estos casos uno se debió a
transmisión debida a murciélago hematófago. Mientras que hubieron 1114 casos reportados de
rabia canina. Es importante resaltar que en la página Web de la OPS no se incluye un reporte de
casos de rabia en animales de vida silvestre. Lo cual confirma el hecho de que no existe un programa
de vigilancia epidemiológica en estos animales que funcionan como reservorios del virus rabia y que
en algún momento pudieran transmitir la rabia a animales domésticos o al humano, como fue el
caso de Brasil en donde se documentó un caso humano de rabia transmitida por un murciélago
hematófago. A través de años de esfuerzo en USA se ha buscado erradicar la rabia en animales de
vida silvestre a través de programas de vacunación oral empleando cebos con antígeno vacunal, los
cuales se distribuyen en las zonas de interés por vía área; aunque esta estrategia a dado resultados,
ha resultado ser ineficiente por lo que se deberán establecer nuevas estrategias de control en la
diseminación del virus de rabia en animales silvestres. La poca eficiencia se debe entre otras causas
a la baja inmunidad que induce la vacuna bajo estas condiciones, a que algunos animales consumen
una cantidad de alimento que no es suficiente para inmunizarse, o bien, no consumen el cebo
porque no es atractivo o no tienen acceso a este. Otra posibilidad que explicaría la baja protección
en estos animales sería que los anticuerpos generados por la vacunación no confieran protección
debida a alguna mutación en la proteína G, la cual se une al receptor de células del hospedero. En
México la rabia en animales silvestres, constituye una problemática particular, que requiere
métodos de control especializados. En el SIVE (Sistema Nacional de Vigilancia Epidemiológica) se
2
reportaron entre 1996 a Agosto de 2002, 112 casos positivos a rabia; 52 en quirópteros como las
especies Desmodus rotundus, Lasurius cinereus y Tadarida brasiliensis mexicana (46.4%), 26 en
zorrillos (23.2%) de las especies Spilogale putorius y Mephitis mephitis, 7 en zorros (6.2%), 7 en
mapaches (6.2%), 4 en marsupiales (3.6%), 4 en ciervos (3.6%), 3 en tejones (2.7%), 3 en felinos
salvajes (2.7%), 2 en coyotes (1.8%), 2 en agutí (1.8%) 1 en coatí (0.9%) y 1 en ardilla (0.9%). Lo
anterior no obedece a un programa de monitoreo continuo de los animales de vida silvestre sino a la
captura circunstancial cuando estos animales cambian sus hábitos debido a la enfermedad o
durante los programas de captura de murciélagos para el control poblacional en las regiones
ganaderas. Por otra parte, actualmente el diagnóstico de laboratorio se realiza con pruebas de
inmunofluorescencia directa en cerebros de animales capturados. Estas pruebas aunque son
ampliamente aceptadas, los resultados en parte son subjetivos y dependen en gran parte de la
habilidad del técnico para discriminar entre puntos fluorescentes inespecíficos y aquellos debidos a
la presencia del virus. Además, con estas pruebas no se puede determinar el linaje al cual pertenece
el virus, lo cual dificulta establecer su origen. Más recientemente se han desarrollado una serie de
anticuerpos monoclonales que permiten descifrar el linaje del virus de la rabia; esta determinación
también se basa en inmunofluorescencia directa que se obtiene de aplicar todo el panel de
monoclonales a una misma muestra; la positividad se establece a través de la intensidad de
fluorescencia obtenida con cada anticuerpo monoclonal apreciada visualmente por el técnico. Por lo
anteriormente expuesto, nuestro grupo de trabajo junto con otras Instituciones participa
activamente en la creación de un programa de vigilancia de esta enfermedad en animales de vida
silvestre, ya estos animales pueden estar jugando un papel importante no solo en la diseminación
del virus entre especies, sino resultan riesgo potencial de transmisión incidental al hombre, y no
menos importante es el impacto económico en animales de producción. Los resultados obtenidos
durante el año 2007 en este proyecto se encontró que el 7% de los murciélagos no hematófagos
están infectados con viurs rabia, por lo que pueden desempeñar un papel importante en los ciclos
naturales de diseminación de este virus, ya que ambos tipos de murciélagos hematófagos y no
hematófagos cohabitan en las mismas cuevas. En este trabajo se esta llevando a cabo el diseño de
iniciadores que permitan el diagnóstico molecular de los virus rabia que están circulando en
nuestro país; asi como la caracterización molecular de las variantes del virus que circulan por todas
estas especies para establecer un patrón de diseminación interespecies del virus; además, se estudia
las secuencias que codifican para el exodominio de la proteína G del virus, ya que esta proteína está
involucrada en la interacción del virus co la célula; este último estudio permitirá determinar la
variabilidad en la secuencia de aminoácidos que de lugar a cambios en la estructura proteínica y con
3
ello explicar como un virus puede reconocer varios hospederos, así como su virulencia. Otra
hipótesis que surgió durante la elaboración del proyecto 2007, fue que algunas especies de
murciélagos pueden hacer migraciones y llevar el virus de una zona a otra del país, por lo cual es
importante hacer una comparación de las secuencias de los genes N y P, entre virus aislados de
diferentes zonas. Este análisis se complementaría con estudios ecológicos y de población que están
realizando otras instituciones.
Materiales y Métodos
A)
Obtención de las muestras
Se realizaron monitoreos para la obtención de muestras de diferentes especies de murciélagos
hematófagos y no hematófagos, en diferentes regiones de la Huasteca Potosina y en un municipio
del estado de Sinaloa.
Se hicieron capturas en los ranchos en donde los dueños al observar marcas de mordida o heridas
en su ganado, notificaban el hecho ante el Comité de desarrollo y protección pecuaria del Estado de
Sn. Luís Potosí, y en ambos estados se visitaron cuevas para llevar a cabo el monitoreo.
De manera general, se realizaron monitores nocturnos (programados en base al calendario lunar)
colocando redes de niebla en para capturar murciélagos hematófagos y no hematófagos, esto se
preparó horas antes del anochecer (figura 1a). Ya capturados, se sacaron de las redes (figura 1b), se
colectaron en jaulas, se eutanisaron y se almacenaron a 4ºC para ser transportados hacia el
laboratorio. Se registró la especie y estado físico, así como la georeferenciación de cada sitio
monitoreado.
Las muestras se llevaron al laboratorio de Medicina de Conservación del Instituto Politécnico
Nacional, en donde se realizó el procesamiento de las mismas.
B) Procesamiento de las muestras
El manejo de las muestras se llevó a cabo en el Laboratorio de Medicina de Conservación en una
zona designada exclusivamente para el manejo muestras sospechosas al virus de la rabia.
1. Extracción del cerebro:
El murciélago se colocó en posición ventral dentro de una charola, se hizó una sanitización de la
región craneal con una solución de yodo al 5%. Se realizó de disección del craneo, haciendo un corte
en el cráneo en forma de cruz, para así exponer el cerebro, el cuál se extrajo y se colocó en un
criovial y se identificó con el código correspondiente.
4
a)
b)
Figura 1. Captura de los murciélagos en las zonas de monitoreo. Se muestra en a) Colocación de
redes alrededor de los corrales del ganado o en cuevas unas horas antes de anochecer. b)
murciélago capturado, los ejemplares quedan atrapados en una bolsa que forma de red, lo que limita
sus movimientos.
2. Inmunofluorescencia directa (IFD)
Se realizaron improntas por duplicado de los cerebros de murciélagos en portaobjetos, se secaron al
aire, se fijaron con acetona a -28ºC durante 4h, una vez seca la impronta, se delimitó el área de la
impronta. Se colocó 50μL de una dilución 1:20 del anticuerpo monoclonal anti-rabia conjugado a
isotiocianato de fluoresceína (Laboratorio Baer S.A. de C.V.), se incubó 30 minutos a 37ºC en una
cámara húmeda. Se realizaron 10 lavados con PBS 1X, se dejó secar a temperatura ambiente. Luego
se colocó una gota de glicerol al 90%, se cubrió con un cubreobjetos y se observó en un microscopio
de epifluorescencia a 100X. Se estandarizó la dilución y el volumen de reacción del anticuerpo
monoclonal.
C)
Aislamiento viral en cultivos celulares
Se realizó la estandarización de la infección de un cultivo de células BHK21 (células de riñón
de hámster joven) con un control positivo al virus de la rabia.
Se utilizó una microplaca de 24 pozos con una monocapa celular al 80% de confluencia. A
los pozos se les quitó el medio de mantenimiento y se inocularon con 100μL del control positivo en
cada pozo, se incubó 30 minutos a 37°C. Se adicionaron 900μL de medio de mantenimiento M199 y
se incubaron a 37°C con una tensión del 5% de CO2.
Las células se observaron a diario hasta que se observó efecto citopático.
Al realizar las revisiones diarias, observamos que a las 48 h de inoculación del virus se
presentaba un efecto citopático evidente, en este tiempo realizamos la prueba de IFD en el cultivo
celular con el objetivo de verificar que el efecto producido en las células fue causado por la infección
del virus.
5
Con las muestras positivas a inmunofluorescencia se realizó la infección del cultivo de
células BHK-21 y se observaron diariamente por 96 h.
D)
Análisis de las muestras por técnicas de biología molecular.
Se realizó la estandarización de la técnica de RT-PCR para la detección del fragmento de 760
pares de bases (nucleótido 66 al 826 correspondiente al gen N) del virus de la rabia, basado en el
protocolo de Loza-Rubio, 2005. Las condiciones se describen en la Tabla 1. Para realizarlo se utilizó
el testigo positivo.
Tabla 1. Condiciones de RT-PCR para la detección de un fragmento de 760pb del virus de la rabia.
50ºC
30 minutos
Para la síntesis de la cadena de cDNA
95ºC
15 minutos
Inactivar la transcriptasa reversa y activar la
DNA taq polimerasa
30 ciclos de:
95ºC
45 segundos
50ºC
30 segundos
70ºC
30 segundos
72ºC
10 minutos
Mantener a 4°C
Para el alargamiento final
Durante tiempo indefinido
Los iniciadores utilizados para la reacción de RT-PCR fueron (Loza-Rubio, 2005):
SuEli+ 5’ CGT GGA CCA ATA TGA GTA CA 3’
SuEli- 5’CAG GCT CGA ACA TTC TTC TTA 3’
Se tomaron 10μL del producto de reacción y se colocaron en un gel de agarosa al 1.8%
utilizando TEB 1X como regulador de corrimiento. El gel se tiño con una solución de bromuro de
etidio a una concentración de 0.5μg/mL.
Se analizó una muestra de murciélago hematófago, la cual resulto positiva a IFD, esta
muestra fue proporcionada por la SAGARPA. Al correr la muestra en el gel de electroforesis
observamos la banda esperada de 760pb, lo que nos confirma la presencia del virus en esta muestra.
Se realizó la prueba de RT-PCR para la detección del gen N a los sobrenadantes colectados
del cultivo de células infectadas con las muestras positivas a IFD.
E) Diseño de iniciadores para la amplificación por RT-PCR de la región del exodominio de la
proteína G
Se diseñaron iniciadores degenerados dirigidos a la región del exodomino de la
proteína G (glicoproteína). Se realizó la búsqueda en la base de datos del NCBI de las secuencias
6
reportadas de la proteína G del virus de la rabia y solo se seleccionaron las que han sido registradas
en el continente Americano. Con las secuencias de aminoácidos se realizó la predicción de la región
del exodominio de la proteína mediante el programa Anteprot. Por otro lado con las secuencias de
bases se localizaron los marcos de lectura abierta con el programa ORF finder. Se obtuvieron los
marcos de lectura abierta con los correspondientes aminoácidos y localizamos los aminoácidos que
habíamos obtenido de la predicción. Ubicamos la secuencia de bases que codifica esos aminoácidos
(que corresponden a la región del exodominio). Se hizo el alineamiento múltiple de secuencias de
bases utilizando el programa Clustal W del European Bioinformaatic Institute. Con el programa
Bioedit se seleccionó las porciones con mayor similitud entre las secuencias. Se calculó la Tm, la
formación de dímeros o heterodímeros, empleando las funciones para este fin de la página IDTDNA. El fragmento esperado para los iniciadores diseñados es de 727pb. Se realizaron alícuotas de
45 µl de la mezcla de reacción en cada tubo para PCR con 5 µl del RNA molde.
Se realizó la estandarización de la técnica de RT-PCR para la detección del fragmento de 727
pares de bases (nucleótido 523 al 1250 correspondiente al exodominio del gen G) del virus de la
rabia, basado en el diseño de iniciadores antes mencionado. El par de iniciadores se muestran en la
tabla 3 y las condiciones de RT-PCR se describen en la Tabla 4. Para realizarlo se utilizó el testigo
positivo.
Transcripción reversa y reacción en cadena de la polimerasa.
Se utilizaron los reactivos del kit One-step RT-PCR, se preparó la mezcla de reacción en un tubo
Eppendorf de 1.5 mL, cada 50 μl de mezcla de reacción contiene:
Reactivo
Regulador de reacción
Mezcla de dNTP`s
Iniciador RvG523 ó RvG1230
Iniciador RvG859 ó RvG1125
Mezcla de enzimas
Inhibidor de RNA asas
H2O libre de RNAasas
RNA molde
Total
Dilución de trabajo
5X
10 mM c/u
15 µM
15 µM
-----
Volumen
10 µl
2 µl
1.5 µl
1.5 µl
2 µl
0.8 µl
26.8 µl
5 µl
50 µl
Concentración final
1X
0.4 mM
0.45 µM
0.45 µM
2U
0.5 U
-0.1
U: unidades
También realizó la estandarización de la técnica de RT-PCR anidado para la detección del fragmento
de 285 pares de bases (nucleótido 859 al 1144 correspondiente al exodominio del gen G) del virus
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de la rabia, basado en el diseño de iniciadores antes mencionados. El par de iniciadores se muestran
en la tabla 5 y las condiciones de RT-PCR se describen en la Tabla 6. Para realizarlo se utilizó el
testigo positivo.
Tabla 2. Combinación de iniciadores para amplificar la región del exodominio de la proteína G.
Combinación 1 *
Nombre
Secuencia 5'--3'
Tm
Posición en Tamaño
(°C)
el gen
esperado del
amplificado
(pb)
RvG523
ACYAACCAYGATTACACCATYTGG
56.2
523-537
727
RvG1230 AAARTCYTCHGCYTCRTCMCC
56.9
1230-1250
Tabla 3. Condiciones de RT-PCR para amplificar un fragmento de 727pb correspondiente a la región
del exodominio de la proteína G.
Temperatura Tiempo
Proceso
50 º C
30 minutos
Síntesis de la cadena de cDNA
99 ºC
15 minutos
Activar la taq DNA polimerasa.
40 ciclos
94 ºC
30 segundos
56.5 ºC
30 segundos
72 ºC
1min 20seg
Amplificación
72 ºC
7 minutos
Extensión final
4 ºC
indefinidamente Conservación después de la amplificación
Tabla 4. Combinación de iniciadores para amplificar una región interna del exodominio de la
proteína G.
Combinación 2 Tm (°C) Posición en el Tamaño del
Nombre Secuencia 5'--3'
gen
amplificado
esperado (pb)
RvG859
CAYTRGAGTCCATCATGACHACC
55.7
859-882
285
RvG1125 AGRGAYGAYTGCATCTCHGG
56.2
1125-1144
8
Tabla 5. Condiciones de RT-PCR para amplificar un fragmento de 285pb correspondiente a una
región interna del exodominio de la proteína G.
Temperatura Tiempo
Proceso
50 º C
30 minutos
Síntesis de la cadena de cDNA
99 ºC
15 minutos
Activar la taq DNA polimerasa.
40 ciclos
94 ºC
30 segundos
55.9 ºC
30 segundos
72 ºC
60 segundos
Amplificación
72 ºC
7 minutos
Extensión final
4 ºC
indefinidamente Conservación después de la amplificación
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DESCRIPCIÓN DE RESULTADOS
Meta 1
Recolección de muestras de murciélagos hematófagos y no
hematófagos en las regiones de México de mayor frecuencia de
rabia bovina. (Meta 2007 y 2008 concluida)
A) Obtención de las muestras
Se realizó la captura de murciélagos hematófagos y no hematófagos en 8 sitios de la región Huasteca
Potosina, México. Se capturaron un total de 222 murciélagos, 113 hematófagos y 109 no
hematófagos. En la tabla 7 se enlistan las regiones monitoreadas, el número de muestras obtenidas
y las especies capturadas en cada una de ellas.
Tabla 6. Sitios de monitoreo de murciélagos hematófagos y no hematófagos en la región de la
Huasteca Potosina, México.
MUNICIPIO
Talnajas
Guadalcazar
San Ciro de Acosta
NÚMERO DE
EJEMPLARES
CAPTURADOS
25
3
2
8
1
2
9
37
9
34
1
8
4
4
2
10
Tanquintián
Río Verde
Ejido Alvaro Obregón
Aquismón
Rancho “El Cafetal”
42
Rancho “La joya del
Sabino”
21
Total : 8 sitios
222 muestras
ESPECIES
CAPTURADAS
Desmodus rotundus
Diphylla ecaudata
Mormoops sp
Anoura sp
Enchistenes sp
Pteronotus sp
Leptonycteris sp
Artibeus sp
Desmodus rotundus
Mormoopos sp
Desmodus rotundus
Natalus sp
Anoura sp
Promops sp
Desmodus rotundus
Desmodus rotundus
Desmodus rotundus
10 especies
10
También se colectaron 33 muestras en una cueva localizada en el sitio llamado Arroyo
pelón, Municipio de Guasave,; Localidad Cerro cabezón Edo. Sinaloa, como se observa en la tabla 8.
Los datos de GPS del sitio mencionado son: N: 25°,33´, 57.5´´ W: 108°, 50´, 58.1; Altitud: 38msnm.
Tabla 7. Sitios de monitoreo de murciélagos no hematófagos en el estado de Sinaloa, México
MUNICIPIO
NÚMERO
DE ESPECIES
EJEMPLARES
CAPTURADAS
CAPTURADOS
Cueva 1
Arroyo pelón,
Municipio
de 32
Balantiopteryx alicata
Guasave
Localidad
Cerro 1
Pteronotus davyi
cabezón
Edo. Sinaloa
Total : 2 sitios
33 muestras
2 especies
Meta 2
Procesamiento
de
muestras
para
los
estudios
de
inmunofluorescencia directa por microscopia de epifluorescencia
(meta 2007 y 2008 concluida)
B) Procesamiento de las muestras por IFD
Se realizó la prueba de inmunofluorescencia directa a 113 muestras de murciélagos hematófagos y
142 no hematófagos. Se realizó la observación de la fluorecencia en un microscopio de
epifluorescencia y se descartaron falsos positivos debidos a cristales por la observación en
contraste de fases. Además se hizo el registro fotográfico que las muestras positivas.
Los resultados mostraron que el 4% de las muestras fueron positivas al virus de la rabia. De los
murciélagos hematófagos el 1.7% (2) fueron positivas y de los de no hematófagos el 5.7% (ocho).
Las 10 muestras positivas pertenecen a 6 especies de las 12 capturadas, como se puede observar en
la tabla 8.
La presencia del virus de la rabia se evidencia por la presencia flourescencia verde manzana, como
se muestra en las fotografías.
Todas las muestras se observaron en contraste de fases para descartar la presencia de cristales, que
pudieran dar fluorescencia inespecífica.
11
Tabla 8. Municipios con murciélagos positivos a IFD
MUNICIPIO
ESPECIE
Hematófago
Cueva
Nacimiento
Municipio
Tanajas
(25)Desmodus
el rotundus
IF
+
(3)
Diphylla
0
ecaudata
Río Verde
Álvaro Obregón
Aquismón
“El cafetal”
“La joya”
Cueva 1
Arroyo pelón,
Municipio
de
Guasave
Localidad
Cerro
cabezón
Edo. Sinaloa
(9)Desmodus
rotundus
(1)Desmodus
rotundus
(2)Desmodus
rotundus
(10)Desmodus
rotundus
(42)Desmodus
rotundus
(21)Desmodus
rotundus
IF
+
(2) Mormoops sp
0
(8) Anoura sp
0
(1) Enchistenes sp
1
(2) Pteronutus sp
0
(9)Leptonycteris sp
2
(37) Artibeus sp
3
(34) Mormoops sp
0
(8) Natalus sp
1
(4) Anoura sp
0
(4) Promops sp
0
1
Las
Túnel Ejido: El
fraile (colinda con
los
Edos. Tamaulipas
y vo. León)
Municipio:
Guadalcazar
Ejido
Rancho
Nuevo
Municipio Sn. Ciro
de Acosta
Tanquintián
No Hematófago
ÍNDICE DE POSITIVIDAD
Hemató- No
fago
Hematófago
1
0
1/28
6/59
1/9
0/34
0/1
1/12
0/4
0
0/2
0
0/10
0/42
0/21
(32) Balantiopteryx
alicata
0
(1)
davyi
1/33
Pteronotus
1
12
cristal
IF +
a) Enchistenes sp
c) Leptonycteris sp
cristal
IF +
b) Contraste de fases
d) Leptonycteris sp
Figura 5. Inmunufluorescencia positiva en muestras de cerebros de murciélagos no hematófagos. a)
Impronta de cerebro en donde se observa la inmunofluorescencia positiva marcada en color verde
(visto en epifluorescencia) y la presencia de un cristal. En (b) microfotografía en contraste de fases
de (a) donde se muestra el cristal. En (c,d) Otras muestras de murciélagos positivas. 100X
13
a) Artibeus sp
c) Artibeus sp
b) Artibeus sp
d) Natalus sp
Figura 6. Inmunufluorescencia positiva en muestras de cerebros de murciélagos no hematófagos. Se
observa la inmunofluorescencia positiva marcada en color verde (visto en epifluorescencia) a 100X.
14
a) Desmodus rotundus
b) Desmodus rotundus
Figura 7. Inmunufluorescencia positiva en muestras de cerebros de murciélagos hematófagos.
Improntas en donde se observa la inmunofluorescencia positiva marcada en color verde (visto en
epifluorescencia) a 100X.
Pteronotus davyi
Figura 8. Inmunufluorescencia positiva en muestra de cerebro de murciélago no hematófago
procedente del municipio de Guasave, Sinaloa. Impronta en donde se observa la
inmunofluorescencia positiva marcada en color verde (visto en epifluorescencia) a 100X.
15
Meta 3
Aislamiento de los virus rabia a partir de los cerebros positivos
por
inmunofluorescencia, para
la formación
de
un cepario que
permita estudios posteriores. (meta 2007 y 2008 concluidas)
A) Aislamiento viral en cultivos celulares.
Se realizó la estandarización de la infección de un cultivo de células BHK-21 con un control
positivo al virus de la rabia (cepa LP2061) proporcionado por la colaboración con SENASICASAGARPA.
Al realizar el seguimiento del efecto citopático en las células, se observó el cambio de la morfología
celular a las 48h, las células presentaron arredondamiento y agregación, finalmente lisis celular a
las 72h, como se ve en la figura 9.
Se llevo a cabo la lisis total de las células por congelación y se recuperaron los
sobrenadantes. Se hizo una segunda infección celular y se observaron los mismos efectos
citopáticos. También se recuperaron los sobrenadantes y se le realizó la prueba de RT-PCR para la
confirmación de la presencia del virus.
Además se realizó la prueba de IFD para verificar que el efecto citopático se debía a la
presencia del virus de la rabia. Se observaron los corpúsculos de Negri, que son indicativos de la
presencia del virus, como se muestra en la figura 10. Con ellos verificamos que el efecto citopático
producido en las células fue causado por la infección del virus.
Las muestras positivas a IFD fueron utilizadas para realizar la infección de células BHK-21,
estos cultivos fueron incubados hasta por 96 h y se observó que hubo efecto citopático poco
evidente. La muestra positiva que fue colectada en el estado de Sinaloa, no fue inoculada en cultivo
de células, sino que fue procesada directamente por RT-PCR.
B) Aislamiento en ratones neonatos de los virus de las muestras positivas. Como un recurso
adicional para obtener virus en cantidades mayores que nos permitieran los estudios de Biología
molecular que se comprometieron en este proyecto, se realizaron extractos virales de los cerebros
de los murciélagos y se inocularon por via intracraneal en ratones BALB/ c neonatos. Al cabo de
algunos días los ratones manifestaron las reacciones características de la rabia; los tiempos de
aparecieron de esta signología fue diferente y se debió entre otras causas a la carga viral en cada
muestra, y posiblemente al tipo de virus rabia que se encontraba en cada muestra; sin embargo, esto
último es lo que esta bajo estudio en el proyecto, ya que el trabajo continuará según los recursos
económicos que vayamos obteniendo.
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a) Testigo de células BHK
b) Testigo positivo 24H
c)Testigo positivo 48H
d) Testigo positivo 72H
Figura 9. Células BHK21 infectadas con el virus de la rabia. a) Células sin infección, se observa una
monocapa uniforme con morfología celular normal. b) Células con 24 horas de infección, se observa
arredondamiento celular. c) Células con 48 horas de infección, se observa arredondamiento celular
en toda la monocapa. d) células con 72 horas de infección, se observa células redondas y perdida de
la monocapa.
Figura 10. Células BHK21 con IFD positiva a rabia . Fotografías de células BHK-21 en donde se
muestra la presencia de corpusculos después de 48 h de infección.
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Meta 4.
Identificación por PCR de virus rabia en muestras de cerebros de
murcielagos. Así como de los cultivos celulares. (meta 2008
concluida)
Meta 5
Secuenciación de los genes N amplificados en las diferentes
muestras de murciélagos hematófagos y no hematófagos, para
determinar la correlación en el ciclo de transmisión del virus en
las cuevas donde cohabitan.(meta 2008 en proceso)
Meta 6
Secuenciación de la proteína G de los virus aislados; y análisis
de las secuencias.(meta 2008 en proceso)
C) Análisis de las muestras por técnicas de Biología Molecular.
Se realizó la estandarización de la prueba de RT-PCR con el Kit comercial One step RT-PCR, para
la detección de un fragmento de 760pb, correspondiente al gen N. Se establecieron las condiciones
de la reacción y los productos de reacción se corrieron en un gel de azarosa al 1.8% (figura 11),
como se mencionó en materiales y métodos.
M+ T+ T+
2 3 4
T-
PM 100pb
6
8
Fragmento
de 760pb
Figura 11. Fotografía de un gel de agarosa para la detección de un fragmento de 760pb del gen N del
virus de la rabia. Carril 2: muestra positiva, Carril 3 y 4: testigo positivo, Carril 6: testigo negativo,
Carril 8: marcador de peso molecular.
La muestra positiva corresponde a un murciélago hematófago colectado en la localidad El
varal, Municipio de Tamasopo, estado de San Luís Potosí y proporcionada por la SAGARPA.
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También realizó el RT-PCR para la amplificación de un fragmento de
correspondiente a la región del exodominio de la proteína G.
727 pb
Para la estandarización de esta prueba se utilizó el Kit comercial One step RT-PCR. Se
establecieron las condiciones de la reacción y los productos de reacción se corrieron en un gel de
agarosa al 1.8% (figura 12), como se mencionó en los métodos. El fragmento esperado es de 727pb.
PM 100pb
2
Trx
4
T+
5
T6
Fragmento
de 727pb
Figura 12. Fotografía de un gel de agarosa al 1.8% para la detección de un fragmento de 727pb del
exodominio del gen G del virus de la rabia. Carril 2: marcador de peso molecular; Carril 4: testigo de
reacción; Carril 5: testigo positivo; Carril 6: testigo negativo.
Además se realizó la estandarización de la prueba de RT-PCR anidado para la detección de
un fragmento interno de 285pb de la región del exodominio del gen G del virus Rabia. Se
establecieron las condiciones de la reacción y los productos de reacción se corrieron en un gel de
agarosa al 1.8% (Figura 13), como se mencionó en los métodos.
PM 100pb
1
Trx
3
T+
4
T5
Fragmento
de 285pb
19
Figura 13. Fotografía de un gel de agarosa al 1.8% para la detección de un fragmento de 285pb del
exodominio del gen G del virus de la rabia. Carril 1: marcador de peso molecular; Carril 3: testigo de
reacción; Carril 4: testigo positivo; Carril 5: testigo negativo.
La muestra positiva a inmunofluorescencia identificada como IPN Sin-33, que correspondia
a un ejemplar macho de la Familia Mormoopidae, de la especie Pteronotus davyi, se le realizó la
prueba de RT-PCR para la detección de un fragmento de 760pb correspondiente al gen N del virus
de la rabia, como se puede observar en las figura14 y 15. Así como el RT-PCR para la detección del
fragmento de 727pb correspondiente a la región del exodominio de la proteína G, como se ve en la
figura 15.
100pb Trx T+
1
2 3
T- Sin33
4
5
Fragmento
de 760pb
Figura 14. Prueba de RT-PCR para el gen N para la muestra del ejemplar Pteronotus davyi. Carril 1:
marcador de peso molecular, Carril 2: testigo de reacción, Carril 3: testigo positivo, Carril 4: testigo
negativo, Carril 5: muestra positiva identificada como Sin-33.
T- T+N SinN T+G SinG
1 2
3
4 5
Fragmento
de 760pb
100pb
8
Fragmento
de 727pb
Figura 15. Prueba de RT-PCR para el gen N y G para la muestra del ejemplar Pteronotus davyi. Carril
1: testigo negativo, Carril 2: testigo positivo para el gen N, Carril 3: muestra IPN-Sin33 gen N, Carril
4: testigo positivo para el gen G, Carril 5: muestra Sin-33 gen G, Carril 8: marcador de peso
molecular.
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Los amplificados de los genes N y G que se lograron obtener a partir de la muestra positiva de un
murciélago de Sinaloa, se envió a secuenciación a la compañía MacrogenUSA.
oreder number : 080908FN_028
date of order : 09/08/2008
User ID : gaby
name : Nayelly Gabriela Jiménez Sanchez
Type : PCR/non-purified DNA
order in detail : PCR Purification only
Sequencing
4
sample(s)
4
rxn(s)
preferred sample storage : 1 month(s)
PO number :
attention : Jose Leopoldo Aguilar Faisal
CONCLUSIONES
•
Se realizó la estandarización de la prueba de Inmunufluorescencia Directa; con la
que se encontró que de las 253 muestras de los murciélagos, el 4% (10) resultaron
positivos al virus de la rabia; en los murciélagos no hematofagos se encontró una
mayor prevalencia.
•
Se observó efecto citopático en el cultivo de células BHK21 a las 48 horas de ser
inoculas con virus de la rabia de la cepa LP1249, en las que se identifico por
Inmunufluorescencia Directa este virus, por lo cual se empleará para hacer el
aislamiento del virus de rabia en las muestras positivas.
•
Se realizó la estandarización de las pruebas de RT-PCR para la del gen N y G del
virus de la rabia en murciélagos; así como de PCR anidado para el fragmento de
285pb para el exodominio de la proteína G.
•
En la localidad de Cerro cabezón del municipio de Guasave, se encontró un ejemplar
positivo al virus de rabia de la especie Pteronotus davyi, identificado por ID y por RTPCR del gen N.
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