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Revista de la Universidad Industrial de
Santander. Salud
ISSN: 0121-0807
[email protected]
Universidad Industrial de Santander
Colombia
Rodríguez Sanabria, Fernando
Determinación de las Constantes Cinéticas de la Enzima Hipoxantina- Guanina
Fosforribosiltransferasa (HGPRT) en Controles Normales y en una Familia Afectada por el Sindrome
de Lesch-Nyhan
Revista de la Universidad Industrial de Santander. Salud, vol. 38, núm. 2, 2006, pp. 122-127
Universidad Industrial de Santander
Bucaramanga, Colombia
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Salud UIS
Determinación de las Constantes
Cinéticas de la Enzima HipoxantinaGuanina Fosforribosiltransferasa (HGPRT)
en Controles Normales y en una Familia
Afectada por el Sindrome de Lesch-Nyhan
Fernando Rodríguez Sanabria 1
El sindrome de Lesch-Nyhan (SLN) es producido por una deficiencia total de la enzima Hipoxantina-Guanina fosforribosiltransferasa
(HGPRT). Las madres de niños afectados por el SLN son heterocigotas obligadas ya que la enfermedad se hereda de forma recesiva
ligada al cromosoma X. Una de las células utilizadas para determinar la enfermedad es el eritrocito; sin embargo, la determinación de
la condición portadora de las madres con niños afectados no se puede hacer en estas células ya que presentan una actividad que cae
dentro del rango considerado normal.Esto sucede porque el eritrocito deficiente en la enzima HGPRT es destruido antes de que
alcance la circulación sanguínea. Aplicando los principios cinéticos de Lineweaver-Burk y mediante espectrofotometría se
determino la cinética de la (HGPRT) extraída de los eritrocitos de una familia que sufre el Sindrome de Lesch-Nyhan y se compararon
con la cinética de esta enzima utilizando eritrocitos de 10 individuos sanos y normales procesados de igual forma. Los dos sustratos
estudiados fueron la Guanina y el Fosforribosilpirofosfato (PRPP). La Guanina en individuos normales presentó un rango de Vmax
entre 1.7 a 2.8 µmol de GMP/ min/ g Hb. mientras que el rango presentado para la Km fue de 10 a 25 µM. El PRPP en los controles
normales presentó un rango para la Vmax de 2 a 2.7 µmol de GMP/min/g Hb y el rango para la Km fue de 301 a 590 µM. estos valores
corresponden a lo reportado por otros autores. En la familia estudiada la cual tiene dos niños que padecen el síndrome de LeschNyhan, tanto el padre como la hija presentaron cinéticas que caen dentro del rango considerado normal, mientras que la madre
presentó una alteración en la Km para el PRPP ( 1176 µ M ). Cuando se comparó la regresión linear de las pendientes presentadas
por los controles con la presentada por la paciente portadora de la enfermedad se encontró que estadísticamente son muy diferentes,
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diferencia que es ocasionada por el valor elevado de la Km de esta paciente por el sustrato PRPP.Salud
Palabras Clave: Guanina, PRPP, Síndrome de Lesch-Nyhan, Cinética Enzimática, Análisis matemático de Lineweaver-Burk,
HGPRT.
The syndrome of Lesch-Nyhan (SLN) is produced by total deficiency of the enzyme Hipoxanthine-Guanine
Phosphoribosyltransferase (HGPRT). The mothers of children affected by the SLN are obliged heterocigotes since the illness is
inherited from a recessive way bound to the chromosome X. One of the utilized cells to diagnostic the illness is the erythrocyte;
however, the determination of the condition carrier of the mothers with affected children cannot make in these cells since they present
an activity that falls inside the normal considered range. This happens because the faulty erythrocyte in the enzyme HGPRT is
destroyed before it reaches the blood stream. Applying the kinetic principles of Lineweaver-Burk and by means of espectrophotometry
I to carry out the kinetic of the HGPRT enzyme extracted of the erythrocytes of a family that it suffers the SLN and they were
compared with the kinetics of this enzyme in erythrocytes of ten individuals health and normal. The two studied substrates were the
Guanine and the phosphorybosylpirophosphate(PRPP). The Guanine in normal individuals presented a range of Vmax among 1.7
at 2.8 µmol GMP/min/gHb, while the range presented for the Km went from 10 to 25 µ M. The PRPP in the normal controls
presented a range for the Vmax from 2 at 2.7µmol GMP/min/gHb and the range for the Km went from 301 to 590 µM. These ranges
are similar to those reported by other authors. In the estudied family which has two children that suffer the SLN , as much the father
as the daughter presented kinetic that fall inside the normal considered range, while the mother presented increased the km for the
PRPP ( the value of Km for the PRPP of the mother of the children affected by the syndrome was of 1176 µ M. When we compared
the pendent the normal controls with the obliged heterocigotes pendent for the PRPP substrate was statisticaly different owing to
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high Km value.Salud
Key Words: Guanine, PRPP, Syndrome of Lesch-Nyhan, Enzymatic Kinetics, Mathematical analysis of Lineweaver-Burk,
HGPRT.
1 Msc en Biología. Profesor Asociado del departamento de ciencias básicas de la sección de Bioquímica. Facultad de Salud de la
universidad Industrial Santander.
Correspondencia: [email protected].
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Salud UIS
HIPOXANTINA-GUANINA FOSFORRIBOSILTRANSFERASA (HGPRT)
INTRODUCCIÓN
La deficiencia de la enzima encargada de la vía de
salvamento de las purinas: Hipoxantina -Guanina
Fosforribosiltransferasa (HGPRT) es causa de tres
síndromes con signos clínicos muy parecidos y que
dependerán de la cantidad de enzima residual en cada
uno. Pacientes con al menos un 8% de la actividad de la
enzima presentan alta producción de ácido úrico,
hiperuricemia, nefrolitiasis y gota. Pacientes con 1.5 a
8% presentan alta producción de ácido úrico y
alteraciones neurológicas extrapiramidales como
coreatetosis ó alteraciones piramidales como espasticidad
o hiperreflexia. Y por último pacientes que presenten
menos del 1.5% de actividad enzimática presentan sobre
producción de ácido úrico, retardo mental, alteraciones
neurológicas graves piramidales y extrapiramidales, y
anormalidades comportamentales que incluyen
autoagresión, este último se conoce como el síndrome
de Lesch-Nyhan (SLN)1,2,9,11,12, 13, 18.
El gen que codifica para la enzima esta en el cromosoma
X , se hereda en forma recesiva, ha sido mapeado en el
locus Xq26-q27 y secuenciado en su totalidad. Hasta el
momento se han encontrado más de 200 mutaciones
responsables del síndrome10, 14.
Mujeres heterocigotas para el SLN muestran un patrón
diverso en la actividad enzimática de la HGPRT en
diferentes células: en eritrocitos se ha reportado que
ellas presentan una actividad normal, esto porque al
parecer la célula roja deficiente en la enzima es destruida
y nunca alcanza la circulación sanguínea; mientras que
en fibroblastos y raíces de cabello se pueden encontrar
células HGPRT - y células HGPRT + esto como
consecuencia de la inactivación al azar de uno de los
dos cromosomas X heredados por estas mujeres
(Hipótesis de Lyon ) aunque se han reportado mujeres
que presentan el fenotipo clasico del síndrome de LeschNyhan3, 15, 16,17,19,20.
En el eritrocito asi como en la mayoria de las células, la
enzima HGPRT se encuentra entre 0.005 y 0.04% de la
proteína celular como una enzima citoplasmática no
glicosilada. En esta célula como lo han reportado
Krenitsky , Papaioannou y McDonald, se determinaron
las constantes cinéticas (Km y Vmax ) para los tres
sustratos de la enzima es decir para la Guanina,
Hipoxantina y el PRPP4, 5, 6, 8.
Y SINDROME DE LESCH-NYHAN
saturantes de los sustratos fosforribosilpirofosfato,
guanina e hipoxantina cuando es determinada en
eritrocitos mientras que muy pocos han estudiado la
cinética de la HGPRT en mujeres portadoras de la
enfermedad7,11,14,17.
Estudiar la cinética de las mujeres que son heterocigotas
es importante ya que se podrían encontrar nuevas
alteraciones originadas por la relación entre la enzima y
sus sustratos lo que permitiría proponer nuevos
mecanismos de acción enzimática.
En el presente trabajo se realizó la cinética de los
integrantes de la familia afectada: la madre, la hermana y
el padre de los niños afectados y los resultados se
compararon con los obtenidos en 10 individuos sanos.
MATERIALES Y MÉTODOS
Material biológico
Eritrocitos:
Tanto de los 10 controles como de los integrantes de la
familia afectada se tomaron de cada uno 5ml de sangre
total con heparina como anticoagulante. Se separo el
plasma y después se sometieron los eritrocitos a un
proceso de lisis por ciclos de choque de temeratura ( 37°C
- nitrógeno líquido ). Posteriormente se procedió a hacer
una dilución 1: 60 del lisado en solución salina 0.154 M y
a la cuantificación de la hemoglobina para luego proceder
a analizar la cinética de la HGPRT ante cambios en la
concentración de Guanina y fosforribosilpirofosfato
(PRPP), los dos sustratos de esta enzima.
MÉTODO
Se cuantifico la hemoglobina utilizando el método
tradicional de la cianometahemoglobina. La
determinación de la actividad de la HGPRT con cada una
de las concentraciones del respectivo sustrato se realizó
por espectrofotometría de la siguiente forma: 50 µL de la
solución de hemolizado se mezclaron con cantidades
ascendentes de cada uno de los sustratos en 500 µL de
un buffer tris de pH 8.5 y el delta de absorbancia se
monitoreó durante 15 minutos a 257 nm. Este delta de
absorbancia correspondiente al GMP producido en la
reacción fue proporcional a la actividad de la enzima.
Reacción química del método:
Guanina como sustrato variable:
Hasta el momento varios trabajos reportados muestran
que los individuos heterocigotos presentan actividad
normal de la enzima HGPRT ante concentraciones
HGPRT
GUANINA + PRPP
GMP + PPi
pH 8.5
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RODRÍGUEZ SANABRIA F.
Salud UIS
50 µL del hemolizado conteniendo la enzima HGPRT se
mezclaron con 500 µL de Buffer Tris de pH 8.5 y con
concentraciones ascendentes de Guanina en tubos
separados (en cada tubo se colocaron 20 µL de guanina
de concentraciones entre 0.1 y 5 mM ); manteniendo
constante la concentración del otro sustrato (en cada
uno de los tubos se colocaron 30 µL de PRPP40 mM ) el
cual se agrego previa incubación de los tubos durante 5
minutos a 35°C. El delta de absorbancia para cada tubo
se monitoreo durante 15 minutos a 257 nm. El GMP
producido en cada tubo es proporcional a la actividad
de la HGPRT. (Figura 1).
Fosforribosilpirofosfato (PRPP) como sustrato variable:
Manteniendo la concentración constante de Guanina (20
µL de concentración (5mM) se procedió a utilizar
concentraciones variables de PRPP ( en cada tubo se
colocaron 30 µL de concentraciones entre 0.1 a 40 mM
de este reactivo ) y se siguió el mismo procedimiento
descrito para la guanina. (Figura 2).
Cálculos:
Los calculos se sacaron como un promedio de los deltas
de absorbancia por minuto ( Abs/min)
Figura 1: Cinética de la enzima HGPRT determinada en
eritrocitos de un control normal por medio del análisis matemático de Lineweaver-Burk. Sustrato Variable (S): PRPP (expresado en mM).
Actividad Específica (V) expresada en µ mol de GMP/min/g
Hb.
El intercepto sobre el eje Y corresponde al inverso de la velocidad máxima (1/Vmax) y el intercepto sobre el eje X corresponde al inverso de la constante de Michaelis (1/Km).
Vmax = 2,05 µmol de GMP/min/gHb.
Km = 312 µ M.
∆ Abs / min x 999.2 *
Actividad Específica =
g/L de Hemoglobina en cada prueba
* Corresponde al coeficiente de absorción molar del GMP
Actividad total de la enzima en U/L = Abs/min X 999.2
La cinética de la enzima en estudio mostró un
comportamiento Micheliano con una reacción inicial de
primer orden y luego una reacción de orden cero que
dibujó una hipérbole de acuerdo al análisis matemático
de Michaelis y Menten para los dos sustratos ( Gráficas
no mostradas). Posteriormente los datos de Velocidad
contra sustrato fueron convertidos y analizados según
los parametros de Lineweaver - Burk que convierte la
hipérbole Micheliana en un recta; esto con el fin de darle
una mayor exactitud a los datos de las diferentes
constantes. (Figura 1).
La tabla 1 resume los resultados de Km y Vmax para los
10 controles normales los cuales presentaron para el
sustrato Guanina un rango de Vmax entre 1.7 y 2.8 µmol
de GMP/min/gHb y un rango de valores de Km entre 10
y 25 µM. y para el sustrato PRPP valores de Vmax entre
2 y 2.7 µ mol de GMP/min/gHb y valores de Km entre 301
y 590 µM. Nótese que no hay distinción de sexo ni de
edad ya que la actividad de esta enzima no es afectada
por estos dos factores.
124
Figura 2. Cinética de la enzima HGPRT de la paciente
heterocigota obligada realizada utilizando eritrocitos como fuente de la enzima. Las constantes de Vmax y Km para el PRPP
como sustrato variable se obtuvieron utilizando el análisis matemático de Lineweaver- Burk. La Actividad Específica (V) de
la enzima estudiada esta dada en terminos de µmol de GMP/
min/ g Hb, el sustrato (S) esta expresado en mM.
El intercepto en el eje Y corresponde al inverso de la velocidad
máxima y el intercepto con el eje X corresponde al inverso de
la constante de Michaelis. El método esta descrito en el texto.
Vmax = 2.56 µ mol de GMP/min/gHb.
Km = 1176 µM.
Salud UIS
HIPOXANTINA-GUANINA FOSFORRIBOSILTRANSFERASA (HGPRT)
Y SINDROME DE LESCH-NYHAN
Tabla 1: Constantes Cinéticas ( Vmax y Km )de la enzima HGPRT determinadas en 10 controles normales obtenidas por medio
del análisis de Lineweaver - Burk para los sustratos Guanina y PRPP.
Control normal
Guanina
PRPP
V max µmol
V max µmol
GMP/min/hHb
Km µM
GMP/min/gHb
Km µM
1
1.7
10
2.0
301
2
2.05
11.3
2.05
307
3
1.9
14.3
2.3
384
4
2.08
13.15
2.05
312
5
2.2
13.3
2.46
359
6
2.4
18.9
2.5
482
7
2.45
13.2
2.53
550
8
2.6
21.1
2.53
553
9
2.66
25
2.56
590
10
2.8
24.3
2.7
432
Rango de
1.7 – 2.8 µmol
referencia
GMP/min/hHb
2.0 – 2.7 µmol
10 – 25 µM
La Tabla 2 resume las constantes cinéticas de la familia
en estudio. Esta familia tiene dos niños que sufren el
síndrome de Lesch-Nyhan.
GMP/min/hHb
301 - 590 µM
CONCLUSIONES
-El rango de referencia obtenido para los controles
normales en células rojas y para los sustratos Guanina y
PRPP están de acuerdo con los reportados por otros
autores10,14, 17.
La figura 2 muestra el análisis de Lineweaver-Burk para
los datos de la cinética de la madre de los niños que
padecen el síndrome de Lesch-Nyhan, para el sustrato
(PRPP) y lo que puede observarse allí es que la Km para
el sustrato PRPP es un poco más del doble comparada
con la presentada por los controles. Por otro lado la
cinética presentada por la hija de la mujer portadora ( en
la tabla 2 identificada por DA) mostró valores de Km y
Vmax que están dentro de los valores considerados
normales tanto para la Guanina como para el PRPP.
-Trabajos previamente reportados muestran que a
condiciones saturantes de los sustratos Guanina y PRPP
aquellos individuos heterocigotos no se pueden
distinguir de los individuos normales cuando se utilizan
los eritrocitos como fuente enzimática, esto porque
presentan una actividad de la HGPRT que esta dentro de
los rangos establecidos para las personas normales.
Tabla 2. Constantes cinéticas de la enzima HGPRT de eritrocitos de la Familia estudiada, obtenidas por medio del análisis de
Lineweaver- Burk .
Miembro de la Familia
GUANINA
Vmax µmol
GMP/min/gHb
PRPP
Km µM
Vmax µmol
GMP/min/gHb
Km µM
Padre
2.01
15.4
2.0
390
Madre (Heterocigota)
1.72
12
2.56
1176
2.3
17.8
2
550
Paciente E.A.
-
-
-
-
Paciente F.A.
-
-
-
-
ciente D.A. (Hermana de
niños con el síndrome, y
posible heterocigoto)
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RODRÍGUEZ SANABRIA F.
Salud UIS
-Los valores de la cinética para los dos sustratos de la
enzima HGPRT presentados por la hija de la paciente
portadora de la enfermedad permitirían pensar que es
una persona con una actividad normal de la enzima y
que posiblemente no sea portadora de la enfermedad;
condición que deberá ser corroborada con un estudio
molecular posterior.
- Por otra parte los estudios cinéticos realizados a la
paciente heterocigota muestran una pendiente muy
diferente a la de los controles como se puede observar
en la figura 4 ocasionada por el valor alto presentado en
la Km para el sustrato PRPP lo que podría estar indicando
una inhibición cruzada causada por el otro sustrato, es
decir, que la Guanina en esta paciente ocasiona algún
tipo de alteración estructural en la proteína que disminuye
la afinidad de la enzima por el PRPP cuando este sustrato
se utiliza en concentraciones cercanas al valor de Km.
Esta alteración no se puede observar cuando ambos
sustratos se utilizan a concentraciones elevadas.
Un trabajo anterior7 ha reportado este tipo de inhibición
explicado sobre un modelo de unión secuencial; de tal
forma que en condiciones normales cuando se utilizan
concentraciones saturantes de los dos sustratos lo que
sucede es la unión de los dos sustratos en el orden en
que se describen a continuación:
Figura 3. Comparación de la pendiente presentada por los
controles normales y la de la paciente portadora del síndrome
de Lesch-Nyhan ante diferentes concentraciones del sustrato
Guanina.
Y lo que propongo que podría estar sucediendo en la
mujer portadora de la enfermedad a quien nos referimos
en esta publicación es que a concentraciones saturantes
de Guanina pero utilizando concentraciones bajas de
PRPP (esto se hace para obtener las costantes de Km y
Vmax del PRPP, figura 2) es la Guanina la que se esta
uniendo primero a la enzima lo que causa una disminución
de la afinidad de la enzima por el PRPP que solo termina
en la medida en que se aumenta la concentración del
PRPP usado.
Trabajos a nivel molecular (secuenciar la proteína ó el
gen que codifica para la enzima) podrían dar luces sobre
la alteración propuesta en esta publicación.
Figura 4. Comparación de la pendiente presentada por los controles normales y la de la paciente portadora del síndrome de Lesch
Nyhan ante diferentes concentraciones del sustrato Fosforribosil pirofosfato. Regresión lineal para la paciente: 1/PRPP= 0.391
+ (459,38 x 1/S) mientras que para los controles es 1/PRPP= 0.436 + (60.59 x 1/S).
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PRPP
E ---
Salud UIS
HIPOXANTINA-GUANINA FOSFORRIBOSILTRANSFERASA (HGPRT)
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