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CURSO DE POSTGRADO
APLICACIÓN DE LOS MARCADORES MOLECULARES
Dr. Oscar Díaz
Director del Programa FITOGEN
Departamento de Acuicultura y Recursos Agroalimentarios
Universidad de Los Lagos
SELECCIÓN ASISTIDA
POR MARCADORES
MOLECULARES
(SAM)
Dr. Oscar Díaz, Programa FITOGEN, ULAGOS
MARKER ASSISTED
SELECTION (MAS)
Dr. Oscar Díaz, Programa FITOGEN, ULAGOS
•
Los fitomejoradores han trabajado durante años en la selección de
plantas basándose en el FENOTIPO.
•
LA EXPRESIÓN DEL FENOTIPO en un ambiente determinado debe
ser evaluada en la progenie de los individuos seleccionados y en el
tiempo, y el tiempo que eso lleva dependerá del intervalo generacional
y del número de descendientes.
Dr. Oscar Díaz, Programa FITOGEN, ULAGOS
• Con sólo observar el fenotipo, el fitomejorador
no puede conocer los genes directamente
involucrados en la expresión de un carácter, su
localización y su función.
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TERMINOLOGÍA SOBRE
SELECCIÓN ASISTIDA POR MARCADORES
• Marker Assisted Selection (MAS)
- Selección asistida por marcadores, en general.
• Gene Assisted Selection (GAS)
- Cuando se refiere a un gen conocido.
• Marker Asissted Breeding (MAB)
- Aplicación de marcadores en fitomejoramiento, en
combinación a mapas de ligamiento y genómica
(Incluye al MAS, MABC, MARS, QWS ó GS)
Dr. Oscar Díaz, Programa FITOGEN, ULAGOS
TERMINOLOGÍA SOBRE
SELECCIÓN ASISTIDA POR MARCADORES
• El término “marcador”, “locus” y “gen” son a
menudo (y equivocadamente) usados de
igual manera.
• Un locus (plural loci) es un lugar específico
en el cromosoma, donde está localizado un
gen.
• Un marcador es usado para identificar o
rastrear un locus (o gen).
• Locus y gen son sinónimos sólo si el locus
corresponde a la secuencia de ese gen.
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¿QUÉ ES MAS?
• Es una valiosa herramienta, que
combina técnicas de mejoramiento
convencional y de biología
molecular.
• En MAS, un marcador genético
(morfológico, bioquímico o de ADN)
es usado para seleccionar
indirectamente individuos portadores
de genes que determinan caracteres
de interés que son difíciles o
costosos de medir.
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USO DE MAS EN FITOMEJORAMIENTO
• El uso de MAS en fitomejoramiento se inició
aprox. en el año 1980, cuando se utilizaron
marcadores isoenzimáticos para acelerar
la introgresión de caracteres monogénicos
desde el germoplasma exótico hacia
variedades de élite.
• Beckmann & Soller (1986) usaron
marcadores RFLPs en el mejoramiento de
variedades, incluyendo los aspectos
relacionados con los retrocruzamientos
asistidos por marcadores moleculares para
el mejoramiento de caracteres cualitativos.
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EL USO DE MAS EN FITOMEJORAMIENTO
• Lande & Thompson (1990) fueron los
primeros en considerar MAS para los
caracteres cuantitativos (Genetics
124(3):743-56).
• Posteriormente, y a la fecha, se han aplicado
MAS en programas de fitomejoramiento y la
optimización de (1) los sistemas de
retrocruzas asistidas por marcadores (MABC,
por su acrónimo inglés, Marker- Assisted
Backcrossing); y (2) las estrategias para la
piramidación de alelos favorables en
esquemas de selección recurrente.
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CARACTERÍSTICAS DE MAS
• Con MAS se puede mejorar (más
eficiente) los factores determinantes
de los Incrementos de los
Rendimientos en un programa de
mejoramiento genético.
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CARACTERÍSTICAS DE MAS
La selección Asistida por Marcadores permite:
 Organizar, mantener e incrementar la
diversidad genética.
 Disminuir el efecto de la interacción
genotipo/ambiente.
 Disminuir el tiempo requerido para completar
los ciclos de selección.
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CARACTERÍSTICAS DE MAS
• Con MAS es posible reducir
el número de
retrocruzamientos para
obtener un 97% o más del
padre recurrente.
• MAS se utilizada para
acumular QTL y realizar
selección a través de la
introgresión de caracteres.
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CARACTERÍSTICAS DE “MAS”
• Los marcadores moleculares en
“MAS” pueden ser de tipo directos
(en el mismo gen) o indirectos (ligado
al gen).
• Con “MAS”, se acelera la eficiencia
del proceso de mejoramiento, ya que
es posible “seguir la huella” de la
presencia de genes útiles en cada
generación. Esto no excluye, sin
embargo, la necesidad de hacer
evaluaciones en el campo.
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MARCADORES MOLECULARES COMO HERRAMIENTAS EN “MAS”
• Se aplica, principalmente, para
caracteres simples por conversión
linear (retrocruzas más rápidas).
• Transferencia de fragmentos
genómico múltiples (pocos QTLs).
• Formación de pirámides genéticas.
• Selección y manipulación de alelos
recesivos.
• Selección temprana.
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REQUERIMIENTOS PARA REALIZAR MAS
1. CONFIABILIDAD: El marcador debe
cosegregar o estar muy cercano al carácter
deseado.
2. CALIDAD Y CANTIDAD DEL ADN: Algunas
técnicas de marcadores requieren de
grandes cantidades y buena calidad del
ADN.
3. PROCEDIMIENTO TÉCNICO: La técnica de
caracterización debería tener alta
reproducibilidad entre laboratorios.
4. COSTOS: Debería ser económico y
amigable.
5. NIVELES DE POLIMORFISMO: Debería ser
polimórfico.
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CARACTERÍSTICAS DE UN BUEN MARCADOR PARA “MAS”
EN PROGRAMAS DE FITOMEJORAMIENTO
- Ser altamente polimórfico (dentro y entre especies).
- Tener herencia mendeliana, no epistática.
- Insensible a los efectos ambientales.
- Ser capaz de diferenciar individuos heterocigotos de
homocigotos (Co-dominante).
- De rápida identificación y simple análisis.
- De detección en los estadios tempranos del desarrollo
de la planta (seedling stage).
- Poder seleccionar caracteres de baja heredabilidad.
- Piramidar (combinar) genes.
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ETAPAS PRINCIPALES DEL “MAS”
• Los individuos son
muestreados y se
procede a la extracción
del ADN del material
foliar (1 y 2).
• El ADN obtenido es
utilizado como molde
para realizar el proceso
de amplificación por
PCR del marcador
elegido (3).
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ETAPAS PRINCIPALES DEL “MAS”
• Los fragmentos
obtenidos para cada
individuo son resueltos
mediante electroforesis
(4).
• Los resultados son
leídos e interpretados
para decidir la selección
de los individuos que
presenten el alelo de
interés (5).
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MEJORAMIENTO ASISTIDO POR MARCADORES
1
2
3
4
5
CROMOSOMAS
Primer
Locus A/a ligado al
marcador M/m
Extracción de ADN
A
PCR analisis:
Primers para el
locus “M/m”
a
1
2
3
4
5
M
m
Alelo m
Análisis por ADN:
Presencia de “M” y “m”
Alelo M
Genotipos
mm
Mm MM
mm
Genotipo de
interés (aa)
MM
Selección de las plantas
que sólo llevan “m”
1
2
3
4
5
-> Homocigotas m/m
-> Plantas con genotipo “aa”
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MEJORAMIENTO ASISTIDO POR MARCADORES
Allelo/caracter deseado (1)
(1)
(1) (1)
(1)
(1) (1)
(1)
(1)
(1)
La selección se basa en la presencia del marcador molecular seleccionados
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FITOMEJORAMIENTO CONVENCIONAL
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FITOMEJORAMIENTO CONVENCIONAL – Método Pedigree
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Aplicación
de MM
MAS
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MARCADOR MOLECULAR LIGADO A GENES MAYORES EN GIRASOL
Con los marcadores ligados a genes mayores (e.g., resistencia a enfermedades),
se puede estudiar su ubicación en el genoma y definir programas de selección o
trabajos de ingeniería genética.
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MEJORAMIENTO ASISTIDO POR MARCADORES PUEDE REDUCIR EL
TIEMPO DEL PROCESO DE MEJORAMIENTO
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COSTO – BENEFICIO (METODO DE SELECCIÓN)
(CONVENCIONAL VERSUS MAS)
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DNA FINGERPRINTING
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DNA FINGERPRINTING
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DNA FINGERPRINTING
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UN EJEMPLO DE MAS CON MAIZ DULCE
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CONFIABILIDAD DEL MARCADOR
El marcador debería estar muy cercano al gen(es) de interés. Esto
se consigue a través de:
1. Mapeo de las descendencias (F2, BC1, o
similares) que segreguen para el gen de
interés:
– Se construye un mapa de marcadores y
se estudia la co-segregación de los genes
con el carácter de interés.
– La localización del gen(es) en el mapa
supondrá la identificación de marcadores
en su proximidad.
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CONFIABILIDAD DEL MARCADOR
– Es deseable que la distancia entre marcador y el gen (o
QTL) sea < 5cM).
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CONFIABILIDAD DEL MARCADOR
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CONFIABILIDAD DEL MARCADOR
Prunus mume
2. Uso de mezclas de ADN en poblaciones
segregantes.
– Se usa el método “Bulked Segregant
Analysis (BSA)”
– Se obtiene una población (F2, BC1) que
segregue para el gen de interés.
– Se realiza el fenotipado y la selección de
dos grupos de plantas con fenotipos
alternativos.
– Se extrae el ADN y se mezcla entre los
individuos con el mismo fenotipo.
J. Zhang et al. (2015). DNA Research 1-9
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CONFIABILIDAD DEL MARCADOR
– Las dos mezclas de ADN se usan entonces para obtener
el mayor número posible de marcadores (AFLP y RAPD)
en busca de diferencias entre los patrones de bandas de
las dos mezclas.
– Se asume que estas diferencias pueden corresponder a
fragmentos de ADN próximos al gen de interés.
– Se aíslan estos fragmentos y se elaboran marcadores
polimórficos cuya segregación se estudia en la población.
– Aquellos marcadores suficientemente próximos al gen de
interés se usan en MAS.
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MARKER-ASSITED PYRAMIDING (MAP)
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DESARROLLO DE MARCADORES PARA LA
RESISTENCIA A ENFERMEDADES
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PIRIMIDACIÓN DE GENES
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PIRIMIDACIÓN DE MULTIPLES GENES EN UNA VARIEDAD
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PIRIMIDACIÓN ASISTIDA POR MARCADORES
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EJEMPLOS DE MAS PARA LA PIRAMIDACIÓN DE GENES DE IMPORTANCIA
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EJEMPLOS DE MAS PARA LA PIRAMIDACIÓN DE GENES DE IMPORTANCIA
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MAS
• En MAS se requieren en
muchos casos mapas de
ligamiento (marcadores
asociados con caracteres de
interés).
• En algunos variedades
existen mapas de ligamiento
(arroz, maiz, trigo, otros),
pero otros es limitado
(casava, otros).
Dr. Oscar Díaz, Programa FITOGEN, ULAGOS
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POTENCIAL DE “MAS” EN CRUZAMIENTOS CON DIFERENTES
NIVELES DE DIVERSIDAD GENÉTICA
Dr. Oscar Díaz, Programa FITOGEN, ULAGOS
EJEMPLOS DE MAS EN PROGRAMAS DE FITOMEJORAMIENTO
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APLICACIÓN DE MARCADORES CODOMINANTES Y DOMINANTES
DURANTE EL CICLO DE MEJORAMIENTO EN HABAS
• Existen diferentes formas de introducir
MAS a diferentes esquemas de
cruzamiento (Figura).
• Un mejorador podría considerar iniciar
la selección por MAS en diferentes
etapas para obtener los mejores
beneficios (costo-beneficio).
• Podría ser a inicios del programa del
programa cuando usa el método
pedigree o al final cuando “Mass
Selection”.
• En el caso de las generaciones
tempranas, la eliminación de plantas sin
los genes de interés evitará gastos
innecesarios.
Dr. Oscar Díaz, Programa FITOGEN, ULAGOS
APLICACIÓN DE MARCADORES CODOMINANTES Y DOMINANTES
DURANTE EL CICLO DE MEJORAMIENTO EN HABAS
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GENES DE RESISTENCIA MAPEADOS EN TOMATE
Aunque el Mejoramiento
Convencional ha tenido un
impacto significativo
durante mucho tiempo para
transferir resistencia a
enfermedades en tomate,
ha requerido mucho tiempo
en cruzamientos y
retrocruzamientos, en
selección de progiene que
sea resistente.
Hoy se necesitan nuevos
metodos de aceleren el
proceso (sintomas sólo en
estado adulto – mutación
de la población).
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GENES DE RESISTENCIA MAPEADOS EN TOMATE
Dr. Oscar Díaz, Programa FITOGEN, ULAGOS
Dr. Oscar Díaz, Programa FITOGEN, ULAGOS
RESUMEN DE VARIOS METODOS DE SELECCIÓN USANDO MAS
Dr. Oscar Díaz, Programa FITOGEN, ULAGOS