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AMPLIFICACIÓN DEL DNA. TÉCNICA DE LA PCR Contenidos Reacción en cadena de la polimerasa (PCR): principio, fases, procedimiento. Componentes: DNA, enzima, nucleótidos, primers, cofactores. Instrumental. Rendimiento de la reacción. Valoración de productos de PCR. Limitaciones de la técnica, precauciones. Aplicaciones: búsqueda de delecciones, generación de sondas, caracterización de mutaciones puntuales por PCR/secuenciación, amplificación de RNA (RT-PCR), multiplex PCR, PCR anidada, PCR in situ. Resumen La Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), es una técnica de amplificación selectiva de un fragmento de DNA que aumenta el número de copias de una secuencia definida con la finalidad de su estudio y caracterización. La PCR utiliza en el tubo de ensayo los principios básicos que sigue el DNA en su replicación celular. En la PCR mediante altas temperaturas se desnaturaliza el DNA liberando las monocadenas de forma separada. Dos cebadores oligonucleotídicos complementarios a las secuencias situadas en los extremos del fragmento de DNA a amplificar se utilizan como primers de una DNA polimerasa replicadora. Dos secuencias diferentes son utilizadas como cebadores o primers: sense, complementario de una cadena al inicio de la cadena diana a amplificar, y antisense, complementario de la otra cadena en la región final de la secuencia diana. Los ingredientes necesarios para llevar a cabo la reacción son: · DNA utilizado como molde o matriz: ha de estarlibre de RNA y proteínas y en una cantidad aproximada de 0,1-1µg. · Taq polimerasa: enzima replicadora del DNA que es termoresistente. · Nucleótidos: desoxinucleótidos que han de estar en concentraciones equilibradas. · Primers: oligodesoxinucleótidos sintéticos de 15 a 30 nucleótidos con Tm similares. · Tampón: proporciona la concentración de sales y el medio adecuado para llevar a cabo la reacción. Los tubos con los reactivos se someten a una serie de 25-40 ciclos de replicación, de temperaturas preestablecidas, en un termociclador : · 0,5-1 min a 94-96ºC para desnaturalizar el DNA · 1 min a una temperatura 5º inferior a la Tm de los primers (40-60ºC) para la hibridación de los primers · 1-2 min a 72ºC en que la polimerasa replica el DNA y elonga la nueva cadena sobre los primers. En cada ciclo se duplican las copias del DNA diana de forma que la amplificación sigue un modelo exponencial (para n ciclos se obtienen 2n copias). En la práctica el rendimiento de la reacción suele estar alrededor del 80%. La técnica presenta algunas limitaciones. Entre los diferentes problemas que pueden aparecer al utilizar la técnica la contaminación tiene especial relevancia así como los errores de replicación cometidos por la Taq polimerasa. La aparición de amplificaciones inespecíficas puede complicar la interpretación de los resultados. La técnica de PCR es ampliamente utilizada y tiene aplicación en campos tan diversos como diagnóstico genético, identificación biológica, medicina forense etc. Algunas de las nuevas estrategias en PCR más utilizadas en la actualidad son: RT-PCR, MULTIPLEX-PCR, PCR-ANIDADA. Webs o o o o o o http://www.highveld.com/pcr.html http://info.med.yale.edu/genetics/ward/tavi/PCR.html http://bioinformatics.weizmann.ac.il/mb/bioguide/pcr/contents.html http://206.53.227.20/prod_inf/manuals/pcr_man/start.html http://www.alkami.com/index.htm http://www.nwfsc.noaa.gov/protocols.html
