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Cómo hackear un embrión Las posibilidades de la producción in vitro de embriones Nélida Rodríguez Osorio PDU Genómica y Bioinformática Universidad de la República de Uruguay Salto ¿Te gustaría que las vacas produjeran leche chocolatada? http://www.lawlz.org/lawlz/tag/cow ¿Te gustaría que las ovejas tuviesen muchos colores? www.pinterest.com ¿Sería posible hacer estos “cambios” en un animal adulto? O ¿será más fácil hacerlos en un embrión? Los cambios se hacen en embriones tempranos Embrión de 30 días Embrión de 55 días Embrión de 3 días Embrión de 1 día Para hackear embriones, es necesario: 1. Obtenerlos 2. Transformarlos “hackearlos” 3. Conocer sus necesidades para mantenerlos con vida fuera del vientre 4. Evaluarlos 5. Transferirlos al vientre de una hembra receptora Embrión de 1 día Embrión de 3 días Embrión de 6 días 1.¿Cómo obtener los embriones? Ovarios post-mortem MIV Ovocitos inmaduros Aspiración folicular Maduración in vitro Ovocitos maduros Listos para fertilización 1.¿Cómo obtener los embriones? Espermatozoides Ovocitos maduros FIV Fertilización in vitro Cigoto = embrión unicelular 2. ¿Cómo transformar los embriones? Hacer la modificación en el cigoto Cuando el embrión se divida todas las células tendrán la modificación 1980s Transgénesis por inyección pronuclear 1990s Transgénesis en células somáticas y clonación 2000s Transgénesis con vectores virales Métodos difíciles, ineficientes, costosos y con muchos efectos secundarios indeseados 2. ¿Cómo transformar los embriones? Transgénesis por inyección pronuclear Roslin Institute, Escocia Ovejas que producen 1- antitripsina humana en su leche. Se extrae de la leche y se usa para tratamiento de la fibrosis quística Roslin Institute, Escocia Gallinas que producen interferón humano en la clara de huevo 2. ¿Cómo transformar los embriones? Transgénesis en células somáticas y clonación Harvard University, University of Missouri, USA Cerdos que producen enzima que transforma Omega 6 en Omega 3 INTA, Universidad de San Martín, Argentina Rosita ISA, ternera que produce lisozima y lactoferrina humanas en su leche Germán Kaiser, Nicolás Mucci y Adrián Mutto 2. ¿Cómo transformar los embriones? Transgénesis con vectores virales Aprobado para consumo por FDA, Nov. 19 2015 AquaBounty Massachusetts, USA Salmón atlántico, con gen de Salmón chinook que activa la hormona de crecimiento aun en temperaturas muy bajas Con permiso de comercialización Yorktown Technologies, Austin, USA GloFish. Pez cebra fluorescente para propósitos hornamentales. 2. ¿Cómo transformar los embriones? Transgénesis con vectores virales Instituto de Reproducción Animal Uruguay (Irauy) Instituto Pasteur Montevideo. Uruguay Ovejas con el gen de fluorescencia de la medusa Aequorea victoria Efectos indeseados de la manipulación embrionaria •Muertes embrionarias y fetales •Malformaciones de todos los órganos •Hemorragias encefálicas Lee et al. 2004 Ternero control Ternero transgéinico y clonado 14 Efectos indeseados de la manipulación embrionaria Crecimiento anormal Fetos control (1 y 2). Fetos clonados (3 y 4) con mayor peso y talla Macroglosia (5) Malformación auricular (6) Chen et al., 2013 15 Efectos indeseados de la manipulación embrionaria Partos difíciles por el gran tamaño fetal Nagai et al., 2012 16 2. ¿Cómo transformar los embriones? Hacer la modificación en el cigoto Cuando el embrión se divida todas las células tendrán la modificación 1980s Transgénesis por inyección pronuclear 1990s Transgénesis en células somáticas y clonación 2000s Transgénesis con vectores virales Métodos difíciles, ineficientes, costosos y con muchos efectos secundarios indeseados Edición génica con ZFNs y TALENs 2010 2. ¿Cómo transformar los embriones? Edición genómica con ZFN y TALENs Roslin Institute, Escocia Cerdos con gen de jabalí africano que genera resistencia al virus de la peste porcina africana University of California Davis, USA Terneras de raza Holando sin cuernos 2. ¿Cómo transformar los embriones? Hacer la modificación en el cigoto Cuando el embrión se divida todas las células tendrán la modificación 1980s Transgénesis por inyección pronuclear 1990s Transgénesis en células somáticas y clonación 2000s Transgénesis con vectores virales Métodos difíciles, ineficientes, costosos y con muchos efectos secundarios indeseados Edición génica con ZFNs y TALENs 2010 Edición genómica con CRISPR/Cas 2013 2. ¿Cómo transformar los embriones? Edición genómica con CRISPR/Cas 2013 CRISPR = Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats Cas = CRISPR associated protein Proteínas de defensa bacteriana contra los virus Se puede usar este mecanismo para cortar y editar DNA en cualquier especie Bhaya et al., 2011 2. ¿Cómo transformar los embriones? Edición genómica con CRISPR/Cas 2013 CRISPR/Cas uniéndose a DNA complementario a su plantilla de RNA. Si las secuencias coinciden Con la introducción de DNA se produce un corte adicional, se repara el corte 2. ¿Cómo transformar los embriones? Edición genómica con CRISPR/Cas Northwest Agricultural & Forestry University, China Vacas resistentes a Micobacterium tuberculosis University of Missouri Columbia, USA Roslin Institute, Escocia Cerdos con resistencia al virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino PRRS 2. ¿Cómo transformar los embriones? Edición genómica con CRISPR/Cas Northwest Agricultural & Forestry University, China Cabras que producen pelos más largos y en mayor cantidad (cashimira) Institut Pasteur de Montevideo, Instituto de Reproducción Animal, Uruguay Center for Research in Transplantation and Immunology, Nantes, Franca Ovejas con silenciamiento del gen de la miostatina (“doble musculatura”) 3. ¿Cómo mantener los embriones con vida fuera del vientre? Incubadoras con control de: Temperatura Humedad Concentración de CO2 Concentración de O2 Medios de cultivo con: Fuente energética apropiada – piruvato Aminoácidos esenciales Control de pH 3. ¿Cómo mantener los embriones con vida fuera del vientre? Adicionar al medio antibióticos que eviten la contaminación pero que no afecten a los embriones Renovar el medio siempre que sea necesario Cultivar los embriones en grupos, debido a que liberan factores estimulantes 4. ¿Cómo evaluar los embriones? Evaluar la morfología La etapa del desarrollo Se pueden sexar los embriones y hacer evaluaciones genéticas Para determinar si la “transformación” fue exitosa se usan marcadores. 5. ¿Cómo transferir los embriones a hembras receptoras? El embrión se monta en una pajuela similar a las usadas para inseminación artificial Embrión Burbuja de aire Sello El embrión se transfiere a una hembra con ciclo estral sincronizado Medio Burbuja de aire Medio Medio Tapón de algodón Justificación Valoración bioética Conservación de la diversidad genética Continuar la investigación ¿Debemos hackear embriones?
