Download Animales transgénicos y clonación

(1)TRANSGÉNESIS
(2)Introducción
La evolución de distintas técnicas en el ámbito de la biología del desarrollo y la biotecnología han
permitido la introducción de material genético exógeno en la línea germinal de distintos animales,
posibilitando transferir cualquier gen clonado, ya sea normal o mutado, a su descendencia.
Asimismo, la obtención de las células madre embrionarias de ratón en 1981, hizo posible el
desarrollo de la técnica de mutación dirigida (gene targeting) mediante la cual genes foráneos
pueden introducirse en regiones específicas del genoma, permitiendo un mayor control sobre su
expresión.
Los animales transgénicos constituyen excelentes modelos para estudiar la función y la regulación
génica, colaborando también en la búsqueda de nuevas estrategias terapéuticas para
enfermedades humanas. Además, en los últimos años ha crecido exponencialmente su utilización
como biorreactores para la producción de proteínas farmacológicas de uso humano.
(2)Animales transgénicos
Un animal transgénico es un organismo al que se le ha introducido ADN en una o varias células de
forma artificial y se ha logrado que, al menos, parte de este ADN se integre a su genoma de
manera permanente. Se busca que este ADN foráneo se integre en las células germinales, de
manera de ser transmitido a su descendencia.
Los transgenes constan, principalmente, de un gen estructural (el cual queremos estudiar) y de
elementos reguladores. El primero de ellos es el que porta la información genética que se
requiere para sintetizar la proteína de interés; mientras que los elementos reguladores
(promotores, secuencias activadoras, etc.) son las secuencias de ADN que determinan dónde,
cuándo y en qué cantidad se expresará el transgen. Se recomienda incorporar, además, un gen
reportero (bajo las órdenes de las mismas secuencias reguladoras) que nos permitirá analizar más
fácilmente la expresión del transgen. Uno de los más utilizados es el gen lacZ, que codifica para la
 galactosidasa y permite la detección rápida del transgen por medio de una coloración azulverdosa de los embriones.
Existen tres métodos principales para la generación de animales transgénicos:
- Microinyección del ADN en pronúcleo.
- Transfección por vectores virales.
- Mutación dirigida por recombinación homóloga en células madre embrionarias (gene
targeting).
(3)1. Microinyección en pronúcleo
Se inyecta una solución conteniendo cientos de copias del transgen en el pronúcleo (PN)
masculino, que al tener mayor tamaño permite una mejor manipulación. El promedio de copias
integradas en el genoma es de 1-50, y se insertan de manera azarosa. Se sabe que el sitio de
integración puede tener un efecto significativo en la expresión del transgen, llevando a una
alteración o inhibición del mismo.
La eficiencia final de la técnica permite obtener un 20-30% de ratones transgénicos del total de
nacidos vivos, que constituyen alrededor del 1% del total de embriones microinyectados
originalmente. Para confirmar qué animales poseen el transgen en su genoma se toma una
pequeña porción de la cola o de la oreja y se realiza un genotipado mediante la técnica de
reacción de la polimerasa (PCR) (Fig.1). Los animales que incorporaron correctamente el transgen
reciben el nombre de “fundadores”, y su descendencia constituirá una línea transgénica. Las
colonias fundadoras son súmamente valoradas por los investigadores ya que su producción
conlleva, al menos, 6 meses de trabajo.
Desventajas de la técnica:
- La técnica de microinyección pronuclear sólo permite agregar material genético, no sustraer ni
reemplazar.
- Entre el 10-20% de los embriones pueden incorporar tardíamente el transgen, constituyendo así
animales mosaico que no necesariamente expresarán el transgen en su línea germinal.
- Debido a que el transgen se inserta al azar está sometido al efecto de posición, es decir, que
puede llegar a caer en una zona de silenciamiento genómico y no expresarse nunca. Además,
puede producir la disrupción de genes importantes para el desarrollo o incluso, la activación de
oncogenes.
Hembra superovulada
Embrión en estadio
de pronúcleo
Pipeta holding
Aislamiento de los ovocitos
fecundados
Inyección de la
solución de ADN en el
pronúcleo masculino
Transferencia de los
embriones inyectados a
hembras pseudopreñadas
Cría
Identificación de la cría transgénica mediante las técnicas de PCR o Southern blot
Fig.1. Esquema que resume el proceso de obtención de animales transgénicos mediante microinyección en
pronúcleo. La cría es analizada por métodos moleculares para confirmar la incorporación del transgen.
Imagen: Carol Fagundez
(3)2. Infección por retrovirus
Para esta técnica se utilizan, por lo general, embriones en estadio de blastocisto. Se elimina la
zona pelúcida que los rodea y se los coloca en un medio de cultivo con los retrovirus
recombinantes (Fig.2).
Por lo general, el genoma retroviral del virus utilizado como vector tiene replicación defectuosa ya
que sus genes han sido reemplazados por el transgen de interés. Luego de la inyección del
retrovirus, su genoma conteniendo el transgen se transcribe y la copia de ADN doble cadena
resultante se integra al genoma de la célula huésped como un provirus, el cual se comporta como
si fuera un gen propio de la célula huésped. La integración al genoma de la célula infectada
ocurre por un mecanismo preciso que produce la inserción al azar de una única copia del provirus.
Ventajas:
- No requiere la visualización del PN ni la utilización de equipamiento complejo y costoso.
- Es menos invasivo, con lo cual la supervivencia de los embriones transferidos es mayor (70%).
- Mayor eficiencia de la transgénesis (50-100%).
Desventajas:
- Bajos niveles de expresión.
- Generación de animales mosaico a causa de una integración no uniforme del transgen.
- Inserción es al azar.
- La utilización de los retrovirus como vectores está limitada al tamaño del fragmento de ADN a
incorporar (hasta 10kb).
Una variante reciente de esta técnica es la utilización de lentivirus, que presentan la ventaja de
poder infectar células tanto en división como en reposo. En este caso, la inyección se realiza en el
espacio perivitelino de embriones unicelulares.
Medio de cultivo
con virus
Embriones de ratón
sin zona pelúcida
Células productoras de virus
Inserción del ADN
viral en el genoma
de ratón
Implantación en
hembras
pseudopreñadas
Ratón transgénico
Fig.2.
Transgénesis mediada por retrovirus. Los
embriones son cultivados en presencia de los vectores
virales conteniendo el transgen, que luego se incorporará
al genoma.
Imagen: Carol Fagundez
(3)3. Mutagénesis dirigida en células madre embrionarias
Esta técnica permite insertar el transgen o constructo génico en una región específica del
genoma, generando así una mutación dirigida basada en la introducción o eliminación de ADN
en lugares precisos mediante la recombinación homóloga de esas secuencias de ADN foráneas
con los genes propios del individuo.
Una vez diseñado el constructo, éste se incorpora en las células madre embrionarias de ratón
(CMEr). Estas células provienen del macizo celular interno (MCI) de embriones en estadios de
blastocisto, y tienen la capacidad de diferenciarse en todos los tejidos del organismo
(pluripotencia). Las CMEr son sometidas a electroporación para permeabilizar sus membranas
(“hacerles orificios”) y permitir el ingreso del vector de recombinación. Luego, las células son
sometidas a un proceso de selección positiva/negativa (ver apartado 3.1) para determinar cuáles
de ellas han incorporado al vector correctamente. Las células conteniendo el transgen son
inyectadas en blastocistos para que se “mezclen” con sus células y pasen a formar parte de todo
su organismo (incluyendo la línea germinal), dando lugar así a una quimera (organismo que
contiene una población de células procedentes de individuos genéticamente distintos).
Para esta técnica es necesario que la cepa de ratón que da origen a las CME tenga un fondo
genético distinto al de la cepa dadora del blastocisto, esto es, por ejemplo, que las CME deriven
de un animal de pelaje marrón y el blastocisto provenga de ratones de pelaje negro. Así se
podrán indentificar más fácilmente aquellos animales que incorporaron el constructo génico
(quimeras). Cuanto mayor sea el aporte de las CME, mayor será el porcentaje de quimerismo. En
nuestro ejemplo, mayor será la proporción de pelaje marrón.
Una vez obtenidos los animales quimera (F1, filial 1), éstos se retrocruzan con sus parentales (P).
Los animales que descienden de este apareamiento (F2) se cruzan entre sí, obteniendo de esta
manera animales homocigotas para el transgen, que formarán las colonias fundadoras (Fig.3).
Todo este proceso puede llevar alrededor de un año de trabajo.
La técnica de mutagénesis dirigida permite estudiar la función de determinados genes mediante la
creación de animales knock-out o knock-in, como veremos a continuación.
Las CMEr recombinantes son
inyectadas en blastocistos
Los blastocistos inyectados
son transferidos a
hembras pseudopreñadas
Inserción del transgen en las células madre embrionarias
Blastocisto
de ratón
CMEr
Vector introducido
por electroporación
CMEr conteniendo el
vector de recombinación
F1
Selección
positiva/negativa
Ratón wild type
Ratones quimera
Población pura de CMEr
amplificadas
X
F1
P
X
Quimera
hembra
F2
Quimera
macho
Ratones transgénicos
Ratones wild type (sin
el transgen)
Fig.3. Mutagénesis dirigida en células madre. El vector de recombinación es incorporado a las células madre que son
luego inyectadas en embriones en estadio de blastocisto. Estos embriones darán lugar a quimeras que se cruzarán
entre ellas para obtener descendencia 100% transgénica.
Imagen: Carol Fagundez
(4)3.1.Animales knock-out (Ko)
Son aquellos a los que se les ha anulado la función de un gen de interés para poder estudiar su
función.
En la generación de animales Ko, el objetivo es diseñar una mutación que evite la expresión del
gen deseado. Esto puede lograrse de dos formas, 1) insertando un marcador de resistencia a una
droga en un exon crítico para la función del gen, o 2) logrando una deleción.
Lo primero que hay que hacer es aislar el clon genómico del gen de interés. El vector a introducir
en el genoma del animal se debe construir a partir de un clon genómico del mismo fondo
(background) génico que el de las CME a utilizar, ya que esto aumenta la frecuencia de
recombinación homóloga. Existen dos tipos de vectores: 1) vector de reemplazo, en este caso el
vector es linearizado de manera de que sus secuencias permanezcan colineares con las
secuencias blanco (las secuencias que se quieren reemplazar por el vector artificial); 2) vector de
inserción, aquí el vector es linearizado dentro de la región de homología, y la recombinación
homóloga lleva a una duplicación del genoma (Fig. 4).
A) Vector de reemplazo
Vector de
recombinación
1
3
neoR
X
ADN
genómico
Vector
correctamente
insertado
1
1
X
2
3
neoR
3
HSVtk
B) Vector de inserción
Vector de
recombinación
2
4
neoR
X
ADN genómico
Vector
correctamente
1
insertado
2
1
4
3
neoR
4
2
3
4
Fig.4. Vectores de recombinación. A) Vector de reemplazo: la secuencia de un exón es alterada mediante la inserción
de un gen de resistencia a antibiótico (por ej., neomicina) luego de la recombinación homóloga con el vector
linearizado. B) Vector de inserción: el vector se lineariza dentro de la secuencia de homología. La recombinación
homóloga lleva a la linearización del vector y una duplicación parcial de la secuencia genómica.
Imagen: Carol Fagundez
Una de las ventajas que ofrece la utilización de CME es la posibilidad de seleccionar en cultivo
aquellas células que hayan incorporado el vector por recombinación homóloga. Para ello se utiliza
una técnica de selección positiva/negativa, desarrollada por Capecchi y col. El marcador de
selección positiva más comúnmente utilizado es el gen bacteriano de resistencia a la neomicina
(neor), que actúa bajo el control de un promotor. También pueden utilizarse genes que muestran
resistencia a higromicina, puromicina o histidinol. Cuando el cultivo celular es sometido a la
presencia del antibiótico adecuado, todas aquellas células que no hayan incorporado el vector (ya
sea por recombinación homóloga o al azar) morirán. La selección contra la integración al azar del
vector (selección negativa) se logra incorporando por fuera de la región de homología del vector
el gen de la timidina quinasa del virus del herpes simplex (tk-HSV). Las células que incorporan al
vector por recombinación homóloga pierden este gen, mientras que aquellas que lo incorporan al
azar lo mantienen y pueden ser eliminadas adicionando al medio de cultivo un nucleósido análogo
tóxico, como el ganciclovir. Una vez hecho esto, las células se amplifican para aumentar su
número y se someten a posteriores análisis por Southern blot o PCR. En este último caso se utiliza
un primer que se une a la nueva región introducida en el vector (cassette neor), y otro que hibrida
en las secuencias genómicas por fuera del constructo blanco o target .
(4)3.2. Animales knock-in
Como se mencionó anteriomente, la recombinación homóloga no sólo se utiliza para generar
ratones Ko sino que también permite la obtención de animales knock-in, en los cuales puede
introducirse una región codificante de un gen distinto, sustituyendo un gen por otro. El gen
insertado se encontrará bajo la acción del promotor endógeno del gen que ha sido reemplazado.
(4)3.3. Knockouts condicionales
La aparición de las recombinasas sitio-específicas a principios de los años ´90 permitió la creación
de animales knockout en forma condicionada a un tejido (Ko condicional-tisular), o a un momento
específico del desarrollo (Ko condicional-temporal). En el Ko convencional, el gen de interés
permance inactivo en todos los tejidos del cuerpo y a lo largo de toda su vida. En ocasiones, la
inactivación de un gen determinado en ciertos momentos del desarrollo puede ser letal o tener
efectos severos sobre el animal, lo que impide un análisis detallado del fenotipo resultante.
El sistema Cre-loxP permite la obtención de ratones Ko condicionales, que no expresarán el gen
de interés en ciertas partes de su organismo y/o en determinado momento de su vida. Esta
técnica implica el uso de una recombinasa sitio-específica llamada Cre (proveniente del fago P1)
que reconoce y se une a unas secuencias llamadas loxP, de 34 pares de bases (pb) de longitud.
La recombinasa Cre tiene la habilidad de escindir cualquier secuencia que se encuentre entre dos
sitios loxP que presenten la misma orientación. Como resultado, un sitio loxP permanece dentro
del genoma y el otro queda en el fragmento circular escindido (Fig. 5A).
Existen dos tipos de knockouts condicionales:

Ko dirigidos (condicionado en el espacio): en este caso se utilizan dos tipos de
ratones transgénicos y se trabaja sobre su descendencia. Por un lado, se generan ratones
que expresen la enzima Cre bajo la acción de algún promotor del tejido de interés; y por
otro, se producen ratones que contengan la región genómica a ser inactivada flanqueada
por sitios loxP. Ambos tipos de ratones se cruzan entre sí obteniendo una progenie
doblemente transgénica, la cual tendrá una copia no funcional del gen de interés en todas
aquellas células donde Cre se expresó lo suficiente (Fig. 5B).

Ko inducibles (condicionado en el tiempo): en ocasiones se busca anular un producto
génico en algún momento de la vida del animal. Una manera de lograr esto es mediante
un sistema Cre-loxP en el cual la recombinasa pueda controlarse a nivel transcripcional o
post-transcripcional utilizando una sustancia inductora que puede administrarse en el agua
o la comida. La actividad enzimática de Cre puede ser regulada, por ejemplo, por
tamoxifeno. En un knockout condicional inducible por tamoxifeno el ratón expresa
normalmente el gen "marcado" pero al recibir tamoxifeno el gen se escinde y se genera un
ratón knockout.
B
A
Promotor
loxP
Gen de interés
Sitio loxP
Cre
Sitio loxP
Gen de interés
Promotor
loxP
Gen de interés
Promotor tejido
específico
Cre activa
Enzima Cre
Promotor
X
Cre inactiva
+
TEJIDO
ESPECÍFICO
OTROS TIPOS
CELULARES
Fig.5. A) Sistema de recombinación Cre-loxP. En presencia de la recombinasa Cre, se escinde el gen de interés que se
encuentra ubicado entre dos sitios loxP. B) Ko-condicional tejido-específico. El gen se escinde únicamente en aquellos
tejidos en los cuales la enzima Cre se activa bajo la acción de un promotor específico.
Imagen: Carol Fagundez
(4)3.4. Animales knockdown
Son animales transgénicos a los que se les ha introducido una construcción formada por un
promotor (que puede ser inducible con un fármaco) y un ARN short hairpin (shRNA) o un ARN de
interferencia (siARN) correspondiente al gen cuya expresión queremos bloquear.
Este método se está comenzando a utilizar como una alternativa para suprimir la expresión de
genes y estudiar sus funciones. Es posible generar modelos in vivo con animales transgénicos que
produzcan ARNs intracelulares de doble cadena (ARNdc) mediante la formación de horquillas por
complementariedad. Estos ARNdc serán escindidos por la enzima dicer produciendo fragmentos
más pequeños de siARN que se unirán a un complejo llamado RISC. De esta manera, el conjunto
RISC-siARN reconocerá a los ARN mensajeros (ARNm) complementarios a las secuencias del
siARN, degradándolo. El resultado final es un animal transgénico en el que se consigue suprimir la
función del gen deseado.
Los shARN se suelen preferir por sobre los siARN ya que parecen ser inductores de interferencia
más potentes.
(2)Aplicaciones de los animales transgénicos
Los animales trasgénicos permiten el estudio de la regulación génica y la función de los genes, así
como la generación de modelos de muchas enfermedades que afectan a los seres humanos y que
pueden ser reproducidas en el ratón, por ejemplo, introduciendo la mutación responsable o
alterando el gen en cuestión. Una gran ventaja de los animales transgénicos es que el organismo
intacto aporta una visión más completa y fisiológica que los experimentos in vitro.
Los animales transgénicos han sido empleados en estudios de inmunología, oncología e incluso
mostraron ser de aplicación en terapia génica. Uno de los usos actuales más comunes de los
animales transgénicos es su empleo como biorreactores para obtener un producto biológico. La
insulina, los inhibidores de proteasas y los factores de coagulación son difíciles de elaborar y
suelen presentar gran demanda por parte de la población. Debido a rechazos inmunológicos, las
proteínas humanas son generalmente mejor toleradas que las de origen animal. En ocasiones, las
personas pueden rechazar, incluso, ciertos productos de genes humanos sintetizados en bacterias.
Entonces, ¿cómo se pueden obtener grandes cantidades de proteínas humanas para satisfacer la
demanda existente? Una de las formas más factibles es la creación de ganado transgénico
(bovino, caprino u ovino) que contenga los genes humanos que codifican para proteínas de
interés. Estos animales transgénicos son capaces de expresar genes en su tejido mamario,
secretando así la proteína en su leche. Para ello, el constructo génico incorporado al animal debe
poseer elementos reguladores que dirijan la expresión de las proteínas recombinantes al tejido
deseado, en este caso, la glándula mamaria. Una vez logrado esto, la proteína es purificada y
posteriormente, comercializada para su uso. Algunos ejemplos de ello son la hormona de
crecimiento humana, la antitrombina III y la albúmina humana.
(1)CLONACIÓN
(2)Introducción
La palabra clonación da a entender, básicamente, la producción de copias genéticas, pudiendo
ser estas “copias genéticas” hebras de ADN, células en cultivo y organismos enteros. Así, el
término clonación se utiliza en distintas áreas, por ejemplo:
Clonación Molecular: Se realiza para obtener una población de moléculas idénticas a partir de una
molécula o de una mezcla de moléculas de ADN. Para ello, se aísla primero la molécula de interés
y se la introduce en una célula a través de un vector. Luego de la reproducción de la célula y de la
molécula de ADN foránea, se obtiene una población genéticamente homogénea denominada clon.
Cada célula de un clon posee múltiples copias de las moléculas recombinantes. Mediante el cultivo
del clon se obtienen suficientes cantidades de ADN recombinante, el cual puede extraerse de las
células y emplearse para distintos propósitos.
Clonación Celular: Radica en obtener un grupo de células a partir de una sola, de manera que
todas ellas sean un clon de la primera. Durante este proceso una única célula es separada del
resto del grupo y cultivada para originar una nueva colonia, pero en este caso, de muchas células
idénticas.
Clonación terapéutica: Tiene como objeto crear una fuente de células de un linaje determinado
con idéntico material genético al del paciente a tratar. Para ello se toma el núcleo de la célula del
paciente y se lo transfiere a un ovocito enucleado, el cual es activado mediante métodos químicos
o pulsos eléctricos para que inicie su división y así obtener un embrión en estadio de blastocisto, a
partir del cual se derivarán células madre embrionarias autólogas para el tratamiento del paciente.
Clonación de organismos: Consiste en obtener un nuevo organismo con las misma información
genética que una célula existente. En la naturaleza pueden encontrarse organismos que se
reproducen vía asexual, originando así, clones de sí mismos. Actualmente existen métodos
mediante los cuales se pueden clonar organismos de manera artificial, como veremos a
continuación.
(2)Un poco de historia
Los primeros intentos de clonación en animales se realizaron en anfibios. En 1952, Briggs y King
realizaron el primer experimento de transferencia nuclear de la historia. Utilizando ejemplares de
Rana pipiens, tomaron el núcleo de una célula de embrión en estadio de blástula y lo colocaron en
un ovocito al cual le habían extirpado previamente su núcleo. Un número significativo de estos
ovocitos enucleados llegaban a desarrollarse en embriones e incluso en renacuajos, con una
eficiencia del 40%. Esta constituyó la primera demostración de que era posible tomar el núcleo de
una célula somática y trasplantarlo a un ovocito enucleado obteniendo un desarrollo posterior. A
esta técnica se la conoce actualmente como trasplante nuclear de células somáticas (SCNT,
somatic cell nuclear transfer). Briggs y King continuaron realizando el mismo tipo de experimentos
pero, esta vez, los núcleos provenían de embriones en estadios más avanzados. Los resultados
obtenidos mostraban que, cuanto más avanzado en edad era el embrión del cual obtenían el
núcleo celular, menor era la tasa de supervivencia de los embriones trasplantados, ya que
aumentaban las anormalidades del desarrollo. Los investigadores concluyeron que según avanzan
el desarrollo y la diferenciación celular, se produce una pérdida o inactivación irreversible de los
genes. En los años ´60, experimentos realizados por Gurdon y col. en la rana Xenopus laevis
reforzaron las conclusiones de Briggs y King: la habilidad de los núcleos trasplantados para
promover un desarrollo normal disminuye a medida que el desarrollo progresa. Sin embargo, para
estos autores sí fue posible obtener, en algunos casos, un desarrollo normal a partir de núcleos de
células diferenciadas, logrando ranas adultas fértiles a partir de células intestinales de larvas;
aunque no fue posible obtener organismos adultos a partir del núcleo de células adultas de
anfibios.
Históricamente, la principal dificultad para lograr la SCNT en mamíferos ha sido el pequeño
tamaño del ovocito. Por lo tanto, se hizo necesario el desarrollo de técnicas de micromanipulación
que permitieran eliminar el núcleo del ovocito y fusionarlo a una célula somática. Estas técnicas se
desarrollaron entre los años ´60 y ´70. En 1981, Illmense y Hope anunciaron en la revista Cell la
clonación de ratones mediante la técnica de SCNT. Estos investigadores reportaron el nacimiento
de 3 ratones a partir de la transferencia del núcleo de una célula del MCI de un blastocisto a un
ovocito enucleado. Sin embargo, estos resultados nunca pudieron ser reproducidos por otros
laboratorios, y luego de varias investigaciones se descubrió que estos experimentos eran un
fraude. Tuvieron que pasar 16 años más para que el primer mamífero clonado a partir de células
adultas viera la luz, y no fue precisamente un ratón, como muchos esperaban…
En 1997, el embriólogo Ian Wilmut sorprendió al mundo con el anuncio de la clonación de una
oveja a partir del núcleo de una célula somática perteneciente a una oveja hembra adulta. El
grupo dirigido por Wilmut tomó células de la glándula mamaria de una oveja de 6 años de edad y
las cultivó, estableciendo una línea celular. Luego, los investigadores obtuvieron ovocitos a partir
de ovejas de una raza diferente y les removieron sus núcleos. La fusión del núcleo de la célula
donante y el ovocito enucleado se logró mediante la aplicación de un pulso eléctrico que
desestabilizó las membranas, permitiendo su unión. Este pulso sirvió, al mismo tiempo, para
iniciar la división del ovocito hasta producir un embrión. Los embriones que sobrevivieron fueron
transferidos, posteriormente, a una oveja receptiva (madre sustituta). De los 277 ovocitos
utilizados originalmente, solo uno sobrevivió: Dolly. El éxito de esta metodología se debió a la
coordinación de los ciclos de replicación del ADN y los de producción de ARNm en las dos células
participantes. En la clonación se busca que durante las primeras divisiones del embrión en
desarrollo se expresen únicamente las proteínas codificadas por el ARNm presente en el
citoplasma del óvulo. Esto permite una reprogramación de la expresión genética del núcleo
diferenciado. La reversión de la diferenciación (desdiferenciación) se logra mediante la interacción
con las maquinarias moleculares presentes en el ovocito receptor.
La clonación ha sido posible también en vacas, conejos, ratones, cabras, cerdos y hasta en gatos.
Sin embargo, hay ciertos factores a tener en cuenta. Por un lado, existen reportes de que algunos
clones han desarrollado enfermedades debilitantes a medida que maduraban; y por otro, el
fenotipo (expresión del genotipo) de los animales clonados a veces no es exactamente el mismo
que el de los animales de los cuales derivó el núcleo. Existe una variabilidad debida a un
acontecimiento cromosómico al azar y a los efectos del ambiente. Así, Wilmut observó que cuatro
ovejas que habían sido clonadas a partir de núcleos de un mismo embrión eran genéticamente
idénticas entre sí pero presentaban tamaños y temperamentos diferentes, mostrando que los
genes de los animales no determinan cada uno de los detalles de su físico y/o personalidad.
Dolly es importante porque fue el primer mamífero clonado. Nació el 5 de Julio de 1996 pero se
hizo público 7 meses después en 1997. Tuvo corderos de manera natural. El 14 de febrero del
2003 fue sacrificada por inyección letal debido a que padecía artritis y cáncer pulmonar. Se
practicó autopsia al cadáver para averiguar si el origen clónico de Dolly era la causa de sus
enfermedades pero no se encontró nada más por lo que se disecó y actualmente está en
exhibición en el Museo Nacional de Escocia.
Generación de “Dolly” por la técnica de SCNT
(2) Los Telómeros y la Impronta: ¿Y ahora qué hago contigo?
Entre las posibles respuestas de la muerte temprana de Dolly están: 1) El tamaño de los
telómeros. Las terminaciones de los cromosomas se llaman telómeros los cuales consisten de
secuencias de repetidos en tándem de un número dado de nucleótidos que no codifican
información útil. Con cada replicación éstos se acortan y cuando comienzan a perderse porciones
de ADN que codifican genes biológicamente importantes, lo cual parece ser, una señal para la
célula de que debe dejar de dividirse y morir. Es cierto que Dolly tenía telómeros cortos al morir
pero no todos los animales clonados que han muerto los tenían cortos también. De hecho, los
tenían más largos, lo cual puede llevar a procesos de carcinogénesis pues las células no mueren
volviéndose “inmortales”. La célula cuyo núcleo fue utilizado para clonarla provenía de un cultivo
de tejido de glándula mamaria de una oveja de seis años que ya había muerto. La variedad Finn
Dorset vive 12 años. Lo anterior parece confirmar que Dolly tenía la “edad genética” de la oveja
donadora. 2) La impronta. Cuando un óvulo es fecundado elementos presentes en su citoplasma
“programan” los genes del nuevo cigoto para que se expresen ordenadamente en tiempo y
espacio. En la clonación artificial por transferencia nuclear, el óvulo recibe un núcleo diploide ya
diferenciado al que más que “programar” debe desdiferenciar. Se cree que la muerte prematura
de los animales clonados se debe a una mala impronta.
(3)Beneficios potenciales
La eficiencia de los experimentos de transferencia nuclear en mamíferos es bastante baja. Menos
del 1% de las transferencias nucleares a partir de células adultas o diferenciadas resultan en una
descendencia relativamente normal. A pesar de ello, la técnica de SNCT sería muy útil ya que
haría posible la puesta en marcha de la clonación reproductiva (en animales) y terapéutica. La
clonación reproductiva, esto es, la producción de animales adultos mediante SNCT, tiene valor
potencial para la crianza de animales, la preservación de reservas o stocks genéticamente raros y
también, para la producción de stocks genéticamente idénticos para investigación (por ej.,
colonias de ratones con alguna extraña mutación). Por otro lado, la clonación terapéutica, que
es la producción de células de reemplazo mediante SCNT, podría tener muchos beneficios
potenciales para los humanos. Esta técnica haría posible la obtención de células donantes de la
misma constitución genética del receptor, lo que eliminaría la necesidad de terapias
inmunosupresoras. A partir de embriones obtenidos por SCNT se derivarían células madre
embrionarias que servirían de reservorio para el paciente.
La clonación de animales es importante para algunos investigadores que estudian las relaciones
entre núcleo y citoplasma durante la fecundación o que estudian el proceso de envejecimiento y
la pérdida de totipotencialidad (capacidad de formar todas las células del organismo, incluso un
nuevo ser) que parece acompañar a éste. Sin embargo, la clonación de mamíferos es de especial
interés en la creación de proteínas farmacéuticas. Como se mencionó anteriormente, existen
proteínas de elaboración compleja que son requeridas en grandes volúmenes. Para estos casos se
está apostando cada vez más a la creación de animales transgénicos que expresen el producto de
interés. Aún así, la cantidad de animales producidos no logra satisfacer la demanda poblacional de
tales productos proteicos. La clonación se vislumbra así, como una posible solución que permitiría
a las compañías farmacéuticas lograr copias de estos animales transgénicos, los cuales
producirían grandes cantidades de proteínas humanas en su leche para ser luego purificadas y
comercializadas.
Uso Potencial de la Clonación Artificial
a. Abastecimiento de alimentos con plantas y animales genéticamente manipulados o no. Existen
compañías como PPL Therapeutic (“Dolly”), Infigen, Geron o Prolina que financian la clonación
para hacer posible la industrialización de organismos clonados que genere ganancias. Un
laboratorio para clonar seres vivos cuesta más de $50 MDD en equipo y expertos. Actualmente
existen 30 especies de mamíferos que ya es posible clonar (lo que costó un promedio de $10
MDD por cada uno). Movimientos como Greenpeace se oponen a que se “patente” la vida.
Algunas de las especies clonadas son: ratones, ovejas, mono macaco, vacas, gatos, cerdos y
caballos.
b. Salvamento de especies en peligro de extinción o ya extintas cuyo ADN se conserve completo y
en buenas condiciones. La primera especie en peligro ya clonada es la oveja de Cerdeña.
c. Clonación Terapéutica de Tejidos. Por ejemplo de células sanguíneas para tratar enfermedades
como la leucemia, células nerviosas para remediar enfermedades neurológicas como el Mal de
Parkinson y el Alzheimer, células pancreáticas para que se produzca insulina y remediar la
diabetes, células de piel para curar fístulas, cáncer de piel y quemaduras extensas, células de
músculo cardiaco para curar infartos y células óseas para fracturas o pérdidas extensas de hueso.
El Dr. John McDonald de la Spinal Cord Injury Unit de la Washington Univ. School of Medicine
(Missouri) condujo experimentos en 64 ratas a las que cercenó la médula dejándolas paralíticas y
después inyectó un millón de células troncales tratadas con ácido retinóico en la herida para que
se convirtieran en células productoras de mielina y se restableciera la conducción de estímulos
desde y hacia el cerebro. Las ratas volvieron a caminar 6 semanas después con un gran
porcentaje de éxito lo que abre una esperanza viable para los pacientes hemipléjicos,
cuadrapléjicos o paralíticos.
d. Clonación Terapéutica de Órganos. En México hay 18,000 personas en condición terminal. De
ellas, 4,500 se encuentran en lista de espera para donación de órganos. Si se desea más
información puede visitarse: Ahora bien, no todos los implantes alogénicos funcionan aunque el
donador sea un familiar: padre, madre o hermano. En ocasiones se requieren implantes
específicos para evitar el rechazo inmunológico. Córneas para ciegos, riñones para pacientes
diabéticos, hipertensos o con enfermedad de riñón poliquístico; válvulas, arterias coronarias, aorta
o corazones completos para personas con infarto (1ª. causa de muerte en México). La clonación
de órganos propios haría posible esto.
(1)BIBLIOGRAFÍA CONSULTADA
1. BENAVIDES F., GUÉNET J.L. Manual de Genética de Roedores de Laboratorio. Cap. VIII. Editorial
Universidad de Alcalá de Henares. 1ª ed. (2003). España
2. CAVAGNARI B. Animales transgénicos: usos y limitaciones en la medicina del siglo XXI. Archivos
Argentinos de Pediatría (2010).108 (4):343-349
3. CAVAGNARI B. Generación de animales transgénicos. Regulación de la expresión génica.
Archivos Argentinos de Pediatría (2010).108 (5):438-444
4. CURTIS H., BARNES S., SCHNEK A., MASSARINI A. Biología. Cap.14. Editorial Panamericada. 7ª
ed. (2008). España
5. GILBERT S. Biología del Desarrollo. Cap.4. Editorial Panamericana. 7ª ed. (2003). Uruguay
6. GURDON J.B., BYRNE J.A. The first Century of nuclear transplantation. PNAS (2003). 100
(14):8048-8052.
7. MÜLLER U. Ten years of targeting: targeted Mouse mutants, from vector design to phenotype
análisis. Mechanisms of Development (1999). 82:3-21
8. MULLINS L., MULLINS J. Transgenic approaches to modification of cell and tissue function.
Current Opinion in Cell Biology (1991). 3:192-198
9. NAGY A., GERTSENSTEIN M., VINTERSTEN K., BEHRINGER R. Manipulating the Mouse Embryo.
Cap.7. Editorial Cold Spring Harbour Laboratory Press. 3ª ed. (2003). Estados Unidos
10. ROSSANT J. Gene disruption in mammals. Current Opinion in Genetics and Development
(1991). 1:236-240