Download nuevas moléculas en el diagnóstico y la terapia de los cánceres de

NUEVAS MOLÉCULAS EN EL DIAGNÓSTICO Y LA
TERAPIA DE LOS CÁNCERES DE PRÓSTATA I
MAMA. MODULACIÓN DEL CRECIMIENTO DE
TUMORES POR LA QUIMIOQUINA CX3CL1
(FRACTALQUINA)
Investigadores principales:
Dr.Timothy Thomson
Institut de Biologia Molecular de Barcelona CSIC
Dr. Pedro L. Fernández Ruiz
Hospital Clínic i Provincial de Barcelona
Dr. Santos Mañes Brotón
Centro Nacional de Biotecnología UAM-CSIC
Duración: 3 años
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1. Resumen
Partiendo de datos transcriptómicos, hemos explorado nuevos
marcadores moleculares de diagnóstico en cáncer de próstata y de
asociación con metástasis ganglionares en cáncer de mama.
Asimismo, hemos explorado en modelos celulares y animales el
posible papel de la quimioquina CX3CL1 como modulador del
crecimiento tumoral en estos dos tipos de neoplasia. En carcinoma de
próstata, hemos identificado conjuntos mínimos de genes
diagnósticos de esta neoplasia, con muy alta sensibilidad y
especificidad, y hemos aplicado este conocimiento al diagnóstico
molecular usando material asociado a agujas de biopsias prostáticas,
habiendo desarrollado protocolos potencialmente aplicables en la
práctica clínica. En carcinoma ductal de mama, hemos identificado
genes, rutas bioquímicas y alteraciones cromosómicas que distinguen
tumores que metastatizan a ganglios linfáticos de aquellos tumores
que no dan lugar a tales metástasis.
Estas observaciones pueden servir de base para el uso de marcadores
moleculares predictivos del comportamiento metastático de estas
neoplasias. Finalmente, hemos explorado el papel de la CX3CL1 en
modelos celulares de cáncer de próstata y mama, y en un modelo
animal de cáncer de mama. Los datos transcriptómicos iniciales
sugerían una pérdida de expresión de esta quimioquina en los dos
tipos de tumores, y datos de otros laboratorios sugerían que la
misma puede tener actividad antitumoral. En este proyecto, hemos
observado que la transformación neoplásica del epitelio mamario se
acompaña de una pérdida de expresión de CX3CL1. Por el contrario,
en cáncer de próstata la expresión de CX3CL1 no presenta
concordancias significativas con el fenotipo transformado. Al contrario
de lo esperado, la administración de adenovirus (Ad-CX3CL1) para la
expresión exógena de esta quimioquina en ratones hembra FVB-
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Tg(MMTV-Erbb2), portadores de tumores mamarios indujo la
aparición de un mayor número de tumores. In vitro, tanto en células
derivadas de cáncer de mama como de cáncer de próstata, la
exposición bien a Ad-CX3CL1 o bien a CX3CL1 recombinante
indujeron transición epitelio-mesénquima, consistente en pérdida de
E-cadherina de superficie y la inducción de la invasividad y migración
celulares. Esta propiedad de CX3CL1 puede explicar la observación de
mayor incidencia y extensión de tumores en los modelos transgénicos
de carcinoma de mama.
2. Resultados
1. Aplicando plataformas de qPCR para la cuantificación simultánea
de múltiples transcritos, hemos identificado y validado una nueva
signatura diagnóstica para cáncer de próstata, en que 3 genes
(TACSTD1, MYO6 y HPN) se encuentran sobreexpresados y cuatro
(LAMB3, EPHA2, DST y CSTA) infraexpresados en la mayoría de los
tumores estudiados (un total de 80 casos). Aplicando análisis
discriminante lineal (LDA) sobre datos de qPCR obtenidos de
muestras residuales asociadas a agujas de biopsia prostática,
demostramos que éste y otros conjuntos mínimos de genes
proporcionan un muy sensible y específico procedimiento que permite
discriminar biopsias con o sin glándulas tumorales.
2. Partiendo de análisis transcriptómicos, hemos inferido la existencia
de potenciales alteraciones estructurales cromosómicas asociadas a
cáncer de próstata, siendo la más significativa una posible ganancia
en cromosoma 17q25.3. Esta inferencia computacional se ha
demostrado experimentalmente mediante FISH, encontrándose que
más del 60% de carcinomas primarios de próstata presentan
ganancia en 17q25.3, siendo así la aberración recurrente más
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frecuente de las halladas hasta ahora en esta neoplasia. De interés
en el estudio de la etiología y progresión de esta neoplasia, también
hemos encontrado esta misma ganancia en glándulas con PIN
(prostate intraepithelial neoplasia, una lesión premaligna) y en
muestras de metástasis ganglionares.
3. Hemos estudiado la relevancia de otras moléculas en cáncer de
próstata, entre ellas el receptor pseudoquinasa HER3, para el que
hemos demostrado que se sobreexpresa significativamente en
carcinoma primario de próstata y es fundamental para la capacidad
clonogénica, migratoria e invasiva de células prostáticas, tanto in
vitro como in vivo (modelos de xenotrasplante en ratones SCID).
4. Hemos ampliado el estudio de marcadores inicialmente
considerados específicos de cáncer de próstata (por ejemplo, AMACR)
a otros tipos tumorales, datos que inducen a actuar con la debida
cautela a la hora de usar estos marcadores en el diagnóstico de
tumores de origen dudoso.
5. Hemos generado y caracterizado un nuevo modelo celular que
permite identificar genes y moléculas asociadas a cáncer de próstata
hormonorresistente y metastático. Este modelo nos ha permitido
observar que la capacidad invasiva de estas células depende de la
adopción de un programa genético mesenquimal (transición epiteliomesénquima, EMT) que no es compatible con el mantenimiento de
características de cancer stem cells (CSC). En nuestro modelo, estos
2 fenotipos corresponden a programas genéticos alternativos y
mutuamente excluyentes. Hemos identificado genes, rutas
bioquímicas (por ejemplo, Akt-mTOR) e inhibidores químicos
específicos para el fenotipo EMT o bien para el fenotipo CSC, o que
participan en ambos fenotipos. Demostramos que varios de los
compuestos químicos identificados son potentes inhibidores de la
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invasividad, la clonogenicidad o la supervivencia de células tumorales
prostáticas altamente agresivas.
6. Mediante la generación de perfiles transcriptómicos, hemos
identificado genes y rutas bioquímicas que se asocian con carcinomas
ductales que metastatizan a ganglios linfáticos, pero no con tumores
que no metastatizan. En concreto, hemos observado una activación
preferente de las vías TGFb y Wnt y marcadores de EMT en los
tumores primarios, pero no en las metástasis. También descubrimos
que los tumores primarios (den o no metástasis ganglionar) expresan
queratinas de tipo basal (5, 6, 14, 17), mientras que los tumores
primarios que se acompañan de metástasis ganglionares y sus
metástasis expresan keratina 18, GATA y receptor de estrógenos en
mayor medida que los tumores primarios que no se acompañan de
metástasis, lo que sugiere que los tumores con tendencia a
metastatizar expresan más fuertemente un programa epitelial
luminal.
7. El análisis de los datos transcriptómicos ha permitido inferir
alteraciones cromosómicas asociadas bien con carcinomas ductales
de mama que metastatizan a ganglios linfáticos, bien a tumores que
no se acompañan de metástasis. Estas inferencias computacionales
se están confirmando mediante FISH. Los datos preliminares indican
que la alteración más importante encontrada es una ganancia de gran
parte del cromosoma 5 en tumores primarios que metastatizan a
ganglios, alteración que se conserva en las metástasis ganglionares
correspondientes. Estamos extendiendo estos estudios a un número
considerablemente superior de casos. De confirmarse, estas
observaciones sugieren que los carcinomas ductales de mama con
capacidad para metástasis son biológicamente diferentes a los
tumores que no metastatizan, siendo obvia la trascendencia
diagnóstica, pronóstica y terapéutica.
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8. Hemos analizado la expresión de CX3CL1 en tejido mamario de
ratones hembra FVB-Tg(MMTV-Erbb2), antes y después de la
aparición de tumores mamarios, en distintos subtipos celulares
(epitelio luminal y basal, células mioepiteliales, endoteliales y
hematopoyéticas). En el epitelio normal, CX3CL1 se expresa a altos
niveles en la población CD24high (células epiteliales luminales), y a
bajos niveles en la población CD24low (basales y mioepiteliales),
siendo indectectable en células CD45+ (hematopoyéticas) o CD24neg
(adipocitos, fibroblastos y miocitos). En las mismas poblaciones
aisladas a partir de tumores de ratones hembra FVB-Tg(MMTVErbb2), se encontró que la expresión de CX3CL1 está muy reducida
en células CD24high tras adquirir características transformadas, lo que
sugiere que la transformación neoplásica induce la pérdida de
expresión de CX3CL1 en el epitelio luminal mamario.
9. Mediante un sistema adenoviral estudiamos el efecto del
incremento de CX3CL1 en el ambiente tumoral, observando que la
inyección de Ad-CX3CL1 se asocia a un mayor número de tumores
por animal. In vitro, encontramos que CX3CL1 induce una transición
epitelio-mesénquima de células que expresan el receptor CX3CR, con
adquisición de una mayor capacidad invasiva.
10. Por otro lado, hemos generado un modelo murino de cáncer de
mama esporádico deficitario en CX3CL1 (FVB-Tg[MMTV-Erbb2]CX3CL1-/-). Sorprendentemente, cerca de un 60% de estos
animales mueren a las 6-9 semanas de edad, antes de la aparición de
tumores mamarios. Análisis preliminares sugieren que la deficiencia
de CX3CL1 en este fondo genético (FVB) causa importantes defectos
en el sistema límbico, que en otros fondos genéticos (C57BL/6J) no
presentan manifestaciones clínicas. Estamos prosiguiendo con estos
estudios.
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11. Finalmente, hemos preparado nanopartículas basadas en óxido
férrico de pequeño diámetro (5-50 nm) y propiedades cristalinas y
paramagnéticas adecuadas. De las diferentes estrategias probadas, la
modificación de la superficie con capas de tipo carboxilato
proporcionó los mejores resultados en términos de
adsorción/liberación de quimioquinas y biodistribución de las
partículas.
3. Relevancia y posibles implicaciones clínicas de los
resultados finales obtenidos
1. Las signaturas genéticas diagnósticas de cáncer de próstata
identificadas en este proyecto, y la aplicación de los protocolos
desarrollados para su análisis partiendo de muestras mínimas,
pueden tener una clara aplicación en la práctica clínica, en particular
en la ayuda diagnóstica de biopsias por punción, en que hay un
número significativo de casos en que el estudio patológico se salda
con dudas diagnósticas.
2. La identificación de una nueva ganancia en cromosoma 17q25.3,
altamente prevalente en cáncer de próstata, puede también ser de
importancia diagnóstica. Además, será importante determinar en el
próximo futuro si la aparición de esta anomalía cromosómica,
detectada en el 60% de los casos, confiere un comportamiento
biológico diferente a los tumores portadores de la misma (curso
agresivo o benigno).
3. Además de marcadores diagnóstico, el proyecto ha permitido
identificar posibles nuevas dianas terapéuticas en cáncer de próstata,
y sobre todo en tumores avanzados (hormonorresistentes y
metastáticos). Hasta el momento, los datos más significativos de
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validación celular y molecular de potenciales dianas terapéuticas se
han generado para HER3 y la ruta Akt-mTOR. Esperamos ampliar
estos datos a modelos animales, con el objetivo de validar el
potencial terapéutico de estas dianas y compuestos.
4. En carcinoma ductal de mama, la identificación de genes y
alteraciones cromosómicas específicamente asociados a la capacidad
de metastatizar a ganglios puede tener utilidad en la identificación
mediante métodos moleculares de estos tumores, lo que mejoraría la
toma de decisiones terapéuticas para estos tumores.
5. Nuestras observaciones indican que la pérdida de expresión de
CX3CL1 no es un fenómeno general en cáncer de mama o cáncer de
próstata, como habíamos predicho al inicio de este proyecto. Aun así,
hemos identificado un modelo animal (FVB-Tg[MMTV-Erbb2]) en que
CX3CL1 pierde su expresión en tumores. De nuevo en contraste con
nuestras hipótesis iniciales, encontramos que el tratamiento con
CX3CL1 exacerba la extensión de los tumores in vivo, induciendo in
vitro una transición epitelio-mesénquima tanto en células de mama
como de próstata. Nuestros resultados aconsejan cautela en el uso de
CX3CL1 como agente antitumoral, como sugieren otros estudios (Guo
et al., 2003. Int J Cancer 103:212; Lavergne et al., 2003. Cancer Res
63:7468; Zeng et al., 2007. Cancer Res 67:2331; Iga et al., 2007.
Vaccine 25:4554).
6. Este proyecto nos ha permitido adquirir experiencia en el
desarrollo de nanopartículas magnéticas para la administración de
drogas, con resultados preliminares que indican que estas partículas
llegan a los tumores, concentrando en ellos los compuestos que se
les asocian. Aunque se requiere más evidencia preclínica, el proyecto
ha permitido establecer sistemas para el desarrollo de estas
partículas para tratamientos antitumorales.
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4. Publicaciones
- Bermudo R, Abia D, Ferrer B, Nayach I, Benguria A, Zaballos A, del
Rey J, Lozano JJ, Miró R, Campo E, Martínez-Alonso C, Ortiz AR,
Fernández PL, Thomson TM.
Co-regulation analysis of closely linked genes identifies a highly
recurrent gain on chromosome 17q25.3 in prostate cancer.
BMC Cancer 2008; 8:315
- M. Soler, F. Mancini, O. Meca-Cortés, L. Sánchez-Cid, N. Rubio, S.
López-Fernández, J. J. Lozano, J. Blanco, P. L. Fernández, and T. M.
Thomson.
HER3 is required for the maintenance of neuregulin–dependent and independent attributes of malignant progression in prostate cancer
cells.
Int J Cancer 2009; 125:2565-75.
- Celià T, Meca-Cortés O, Martínez de la Paz A, Rubio N, Arnal A,
Sánchez-Cid L, Estarás C, Lozano JJ, Martínez-Balbás M, Molà J,
Vilella R, Gomis R, Fernández PL, Blanco J, Thomson TM.
Mesenchymal reprogramming driven by interaction between clonal
tumor subpopulations (en preparación).
- Morente M, Fernández PL, de Álava E.
Biobanking: old activity or young discipline?
Semin Diagnost Pathol 2008; 25:317-22.
- Mozos A, Sole M, Miquel R,Petit P, Nadal A,Fernandez PL.
Usefulness and limitations of Alpha-Methylacyl-CoA Racemase
expression in the hepatobiliary system and pancreas: a wide tissue
microarray analysis of normal and neoplastic epithelia.
Anal Quant Cytol (en prensa)
10
- Bermudo R, Abia D, Mozos A, García E, Alcaraz A, Ortiz AR,
Thomson TM, Fernández PL.
Haystack in a needle: recycling biopsy needles for sensitive molecular
diagnosis of prostate cancer (en preparación).
- Mejías R, Costo R, Roca AG, Arias CF, Veintemillas-Verdaguer S,
González-Carreño T, del Puerto Morales M, Serna CJ, Mañes S, Barber
DF.
Cytokine adsorption/release on uniform magnetic nanoparticles for
localized drug delivery.
J Control Release. 2008; 130:168-174.
- Mira E, Leon B, Barber DF, Jimenez-Baranda S, Goya I, Almonacid
L, Marquez G, Zaballos A, Martınez-A. C, Stein JV, Ardavin C, Mañes
S.
Statins Induce Regulatory T Cell Recruitment via a CCL1 Dependent
Pathway.
J Immunol, 2008; 181:3524-3534.
- Mira E, Mañes S.
Immunomodulatory and anti-inflammatory activities of statins.
Endocr. Metab.
Immune Disord Drug Targets. 2009; 9:237-247.
- Mejias R, Pérez-Yagüe S, Roca AG, Pérez N, Villanueva A, Cañete M,
Mañes S, Ruiz-Cabello J, Benito M, Labarta A, Batlle X, VeintemillasVerdaguer S, Puerto-Morales M, Barber DF, Serna CJ.
Liver and brain imaging through dimercaptosuccinic acid-coated iron
oxide nanoparticles.
Nanomedicine. 2010 (en prensa).
11
- Caffarel MM, Andradas C, Mira E, Cerutti C, Flores JM, García-Real I,
Mañes S, Guzmán M, Sánchez C.
Antitumoral effect of cannabinoids in a genetic model of breast cancer
(sometido para su publicación).
- Tardáguila M, Mira E, González-Martín A, Lira SA, Mateo F, Garcia S,
Thomson TM, Mañes S.
CX3CL1 induces epithelial-to-mesenchymal transition in vitro and
enhances local tumor invasiveness in vivo (en preparación).
12