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NUEVAS MOLÉCULAS EN EL DIAGNÓSTICO Y LA TERAPIA DE LOS CÁNCERES DE PRÓSTATA I MAMA. MODULACIÓN DEL CRECIMIENTO DE TUMORES POR LA QUIMIOQUINA CX3CL1 (FRACTALQUINA) Investigadores principales: Dr.Timothy Thomson Institut de Biologia Molecular de Barcelona CSIC Dr. Pedro L. Fernández Ruiz Hospital Clínic i Provincial de Barcelona Dr. Santos Mañes Brotón Centro Nacional de Biotecnología UAM-CSIC Duración: 3 años 2 1. Resumen Partiendo de datos transcriptómicos, hemos explorado nuevos marcadores moleculares de diagnóstico en cáncer de próstata y de asociación con metástasis ganglionares en cáncer de mama. Asimismo, hemos explorado en modelos celulares y animales el posible papel de la quimioquina CX3CL1 como modulador del crecimiento tumoral en estos dos tipos de neoplasia. En carcinoma de próstata, hemos identificado conjuntos mínimos de genes diagnósticos de esta neoplasia, con muy alta sensibilidad y especificidad, y hemos aplicado este conocimiento al diagnóstico molecular usando material asociado a agujas de biopsias prostáticas, habiendo desarrollado protocolos potencialmente aplicables en la práctica clínica. En carcinoma ductal de mama, hemos identificado genes, rutas bioquímicas y alteraciones cromosómicas que distinguen tumores que metastatizan a ganglios linfáticos de aquellos tumores que no dan lugar a tales metástasis. Estas observaciones pueden servir de base para el uso de marcadores moleculares predictivos del comportamiento metastático de estas neoplasias. Finalmente, hemos explorado el papel de la CX3CL1 en modelos celulares de cáncer de próstata y mama, y en un modelo animal de cáncer de mama. Los datos transcriptómicos iniciales sugerían una pérdida de expresión de esta quimioquina en los dos tipos de tumores, y datos de otros laboratorios sugerían que la misma puede tener actividad antitumoral. En este proyecto, hemos observado que la transformación neoplásica del epitelio mamario se acompaña de una pérdida de expresión de CX3CL1. Por el contrario, en cáncer de próstata la expresión de CX3CL1 no presenta concordancias significativas con el fenotipo transformado. Al contrario de lo esperado, la administración de adenovirus (Ad-CX3CL1) para la expresión exógena de esta quimioquina en ratones hembra FVB- 3 Tg(MMTV-Erbb2), portadores de tumores mamarios indujo la aparición de un mayor número de tumores. In vitro, tanto en células derivadas de cáncer de mama como de cáncer de próstata, la exposición bien a Ad-CX3CL1 o bien a CX3CL1 recombinante indujeron transición epitelio-mesénquima, consistente en pérdida de E-cadherina de superficie y la inducción de la invasividad y migración celulares. Esta propiedad de CX3CL1 puede explicar la observación de mayor incidencia y extensión de tumores en los modelos transgénicos de carcinoma de mama. 2. Resultados 1. Aplicando plataformas de qPCR para la cuantificación simultánea de múltiples transcritos, hemos identificado y validado una nueva signatura diagnóstica para cáncer de próstata, en que 3 genes (TACSTD1, MYO6 y HPN) se encuentran sobreexpresados y cuatro (LAMB3, EPHA2, DST y CSTA) infraexpresados en la mayoría de los tumores estudiados (un total de 80 casos). Aplicando análisis discriminante lineal (LDA) sobre datos de qPCR obtenidos de muestras residuales asociadas a agujas de biopsia prostática, demostramos que éste y otros conjuntos mínimos de genes proporcionan un muy sensible y específico procedimiento que permite discriminar biopsias con o sin glándulas tumorales. 2. Partiendo de análisis transcriptómicos, hemos inferido la existencia de potenciales alteraciones estructurales cromosómicas asociadas a cáncer de próstata, siendo la más significativa una posible ganancia en cromosoma 17q25.3. Esta inferencia computacional se ha demostrado experimentalmente mediante FISH, encontrándose que más del 60% de carcinomas primarios de próstata presentan ganancia en 17q25.3, siendo así la aberración recurrente más 4 frecuente de las halladas hasta ahora en esta neoplasia. De interés en el estudio de la etiología y progresión de esta neoplasia, también hemos encontrado esta misma ganancia en glándulas con PIN (prostate intraepithelial neoplasia, una lesión premaligna) y en muestras de metástasis ganglionares. 3. Hemos estudiado la relevancia de otras moléculas en cáncer de próstata, entre ellas el receptor pseudoquinasa HER3, para el que hemos demostrado que se sobreexpresa significativamente en carcinoma primario de próstata y es fundamental para la capacidad clonogénica, migratoria e invasiva de células prostáticas, tanto in vitro como in vivo (modelos de xenotrasplante en ratones SCID). 4. Hemos ampliado el estudio de marcadores inicialmente considerados específicos de cáncer de próstata (por ejemplo, AMACR) a otros tipos tumorales, datos que inducen a actuar con la debida cautela a la hora de usar estos marcadores en el diagnóstico de tumores de origen dudoso. 5. Hemos generado y caracterizado un nuevo modelo celular que permite identificar genes y moléculas asociadas a cáncer de próstata hormonorresistente y metastático. Este modelo nos ha permitido observar que la capacidad invasiva de estas células depende de la adopción de un programa genético mesenquimal (transición epiteliomesénquima, EMT) que no es compatible con el mantenimiento de características de cancer stem cells (CSC). En nuestro modelo, estos 2 fenotipos corresponden a programas genéticos alternativos y mutuamente excluyentes. Hemos identificado genes, rutas bioquímicas (por ejemplo, Akt-mTOR) e inhibidores químicos específicos para el fenotipo EMT o bien para el fenotipo CSC, o que participan en ambos fenotipos. Demostramos que varios de los compuestos químicos identificados son potentes inhibidores de la 5 invasividad, la clonogenicidad o la supervivencia de células tumorales prostáticas altamente agresivas. 6. Mediante la generación de perfiles transcriptómicos, hemos identificado genes y rutas bioquímicas que se asocian con carcinomas ductales que metastatizan a ganglios linfáticos, pero no con tumores que no metastatizan. En concreto, hemos observado una activación preferente de las vías TGFb y Wnt y marcadores de EMT en los tumores primarios, pero no en las metástasis. También descubrimos que los tumores primarios (den o no metástasis ganglionar) expresan queratinas de tipo basal (5, 6, 14, 17), mientras que los tumores primarios que se acompañan de metástasis ganglionares y sus metástasis expresan keratina 18, GATA y receptor de estrógenos en mayor medida que los tumores primarios que no se acompañan de metástasis, lo que sugiere que los tumores con tendencia a metastatizar expresan más fuertemente un programa epitelial luminal. 7. El análisis de los datos transcriptómicos ha permitido inferir alteraciones cromosómicas asociadas bien con carcinomas ductales de mama que metastatizan a ganglios linfáticos, bien a tumores que no se acompañan de metástasis. Estas inferencias computacionales se están confirmando mediante FISH. Los datos preliminares indican que la alteración más importante encontrada es una ganancia de gran parte del cromosoma 5 en tumores primarios que metastatizan a ganglios, alteración que se conserva en las metástasis ganglionares correspondientes. Estamos extendiendo estos estudios a un número considerablemente superior de casos. De confirmarse, estas observaciones sugieren que los carcinomas ductales de mama con capacidad para metástasis son biológicamente diferentes a los tumores que no metastatizan, siendo obvia la trascendencia diagnóstica, pronóstica y terapéutica. 6 8. Hemos analizado la expresión de CX3CL1 en tejido mamario de ratones hembra FVB-Tg(MMTV-Erbb2), antes y después de la aparición de tumores mamarios, en distintos subtipos celulares (epitelio luminal y basal, células mioepiteliales, endoteliales y hematopoyéticas). En el epitelio normal, CX3CL1 se expresa a altos niveles en la población CD24high (células epiteliales luminales), y a bajos niveles en la población CD24low (basales y mioepiteliales), siendo indectectable en células CD45+ (hematopoyéticas) o CD24neg (adipocitos, fibroblastos y miocitos). En las mismas poblaciones aisladas a partir de tumores de ratones hembra FVB-Tg(MMTVErbb2), se encontró que la expresión de CX3CL1 está muy reducida en células CD24high tras adquirir características transformadas, lo que sugiere que la transformación neoplásica induce la pérdida de expresión de CX3CL1 en el epitelio luminal mamario. 9. Mediante un sistema adenoviral estudiamos el efecto del incremento de CX3CL1 en el ambiente tumoral, observando que la inyección de Ad-CX3CL1 se asocia a un mayor número de tumores por animal. In vitro, encontramos que CX3CL1 induce una transición epitelio-mesénquima de células que expresan el receptor CX3CR, con adquisición de una mayor capacidad invasiva. 10. Por otro lado, hemos generado un modelo murino de cáncer de mama esporádico deficitario en CX3CL1 (FVB-Tg[MMTV-Erbb2]CX3CL1-/-). Sorprendentemente, cerca de un 60% de estos animales mueren a las 6-9 semanas de edad, antes de la aparición de tumores mamarios. Análisis preliminares sugieren que la deficiencia de CX3CL1 en este fondo genético (FVB) causa importantes defectos en el sistema límbico, que en otros fondos genéticos (C57BL/6J) no presentan manifestaciones clínicas. Estamos prosiguiendo con estos estudios. 7 11. Finalmente, hemos preparado nanopartículas basadas en óxido férrico de pequeño diámetro (5-50 nm) y propiedades cristalinas y paramagnéticas adecuadas. De las diferentes estrategias probadas, la modificación de la superficie con capas de tipo carboxilato proporcionó los mejores resultados en términos de adsorción/liberación de quimioquinas y biodistribución de las partículas. 3. Relevancia y posibles implicaciones clínicas de los resultados finales obtenidos 1. Las signaturas genéticas diagnósticas de cáncer de próstata identificadas en este proyecto, y la aplicación de los protocolos desarrollados para su análisis partiendo de muestras mínimas, pueden tener una clara aplicación en la práctica clínica, en particular en la ayuda diagnóstica de biopsias por punción, en que hay un número significativo de casos en que el estudio patológico se salda con dudas diagnósticas. 2. La identificación de una nueva ganancia en cromosoma 17q25.3, altamente prevalente en cáncer de próstata, puede también ser de importancia diagnóstica. Además, será importante determinar en el próximo futuro si la aparición de esta anomalía cromosómica, detectada en el 60% de los casos, confiere un comportamiento biológico diferente a los tumores portadores de la misma (curso agresivo o benigno). 3. Además de marcadores diagnóstico, el proyecto ha permitido identificar posibles nuevas dianas terapéuticas en cáncer de próstata, y sobre todo en tumores avanzados (hormonorresistentes y metastáticos). Hasta el momento, los datos más significativos de 8 validación celular y molecular de potenciales dianas terapéuticas se han generado para HER3 y la ruta Akt-mTOR. Esperamos ampliar estos datos a modelos animales, con el objetivo de validar el potencial terapéutico de estas dianas y compuestos. 4. En carcinoma ductal de mama, la identificación de genes y alteraciones cromosómicas específicamente asociados a la capacidad de metastatizar a ganglios puede tener utilidad en la identificación mediante métodos moleculares de estos tumores, lo que mejoraría la toma de decisiones terapéuticas para estos tumores. 5. Nuestras observaciones indican que la pérdida de expresión de CX3CL1 no es un fenómeno general en cáncer de mama o cáncer de próstata, como habíamos predicho al inicio de este proyecto. Aun así, hemos identificado un modelo animal (FVB-Tg[MMTV-Erbb2]) en que CX3CL1 pierde su expresión en tumores. De nuevo en contraste con nuestras hipótesis iniciales, encontramos que el tratamiento con CX3CL1 exacerba la extensión de los tumores in vivo, induciendo in vitro una transición epitelio-mesénquima tanto en células de mama como de próstata. Nuestros resultados aconsejan cautela en el uso de CX3CL1 como agente antitumoral, como sugieren otros estudios (Guo et al., 2003. Int J Cancer 103:212; Lavergne et al., 2003. Cancer Res 63:7468; Zeng et al., 2007. Cancer Res 67:2331; Iga et al., 2007. Vaccine 25:4554). 6. Este proyecto nos ha permitido adquirir experiencia en el desarrollo de nanopartículas magnéticas para la administración de drogas, con resultados preliminares que indican que estas partículas llegan a los tumores, concentrando en ellos los compuestos que se les asocian. Aunque se requiere más evidencia preclínica, el proyecto ha permitido establecer sistemas para el desarrollo de estas partículas para tratamientos antitumorales. 9 4. Publicaciones - Bermudo R, Abia D, Ferrer B, Nayach I, Benguria A, Zaballos A, del Rey J, Lozano JJ, Miró R, Campo E, Martínez-Alonso C, Ortiz AR, Fernández PL, Thomson TM. Co-regulation analysis of closely linked genes identifies a highly recurrent gain on chromosome 17q25.3 in prostate cancer. BMC Cancer 2008; 8:315 - M. Soler, F. Mancini, O. Meca-Cortés, L. Sánchez-Cid, N. Rubio, S. López-Fernández, J. J. Lozano, J. Blanco, P. L. Fernández, and T. M. Thomson. HER3 is required for the maintenance of neuregulin–dependent and independent attributes of malignant progression in prostate cancer cells. Int J Cancer 2009; 125:2565-75. - Celià T, Meca-Cortés O, Martínez de la Paz A, Rubio N, Arnal A, Sánchez-Cid L, Estarás C, Lozano JJ, Martínez-Balbás M, Molà J, Vilella R, Gomis R, Fernández PL, Blanco J, Thomson TM. Mesenchymal reprogramming driven by interaction between clonal tumor subpopulations (en preparación). - Morente M, Fernández PL, de Álava E. Biobanking: old activity or young discipline? Semin Diagnost Pathol 2008; 25:317-22. - Mozos A, Sole M, Miquel R,Petit P, Nadal A,Fernandez PL. Usefulness and limitations of Alpha-Methylacyl-CoA Racemase expression in the hepatobiliary system and pancreas: a wide tissue microarray analysis of normal and neoplastic epithelia. Anal Quant Cytol (en prensa) 10 - Bermudo R, Abia D, Mozos A, García E, Alcaraz A, Ortiz AR, Thomson TM, Fernández PL. Haystack in a needle: recycling biopsy needles for sensitive molecular diagnosis of prostate cancer (en preparación). - Mejías R, Costo R, Roca AG, Arias CF, Veintemillas-Verdaguer S, González-Carreño T, del Puerto Morales M, Serna CJ, Mañes S, Barber DF. Cytokine adsorption/release on uniform magnetic nanoparticles for localized drug delivery. J Control Release. 2008; 130:168-174. - Mira E, Leon B, Barber DF, Jimenez-Baranda S, Goya I, Almonacid L, Marquez G, Zaballos A, Martınez-A. C, Stein JV, Ardavin C, Mañes S. Statins Induce Regulatory T Cell Recruitment via a CCL1 Dependent Pathway. J Immunol, 2008; 181:3524-3534. - Mira E, Mañes S. Immunomodulatory and anti-inflammatory activities of statins. Endocr. Metab. Immune Disord Drug Targets. 2009; 9:237-247. - Mejias R, Pérez-Yagüe S, Roca AG, Pérez N, Villanueva A, Cañete M, Mañes S, Ruiz-Cabello J, Benito M, Labarta A, Batlle X, VeintemillasVerdaguer S, Puerto-Morales M, Barber DF, Serna CJ. Liver and brain imaging through dimercaptosuccinic acid-coated iron oxide nanoparticles. Nanomedicine. 2010 (en prensa). 11 - Caffarel MM, Andradas C, Mira E, Cerutti C, Flores JM, García-Real I, Mañes S, Guzmán M, Sánchez C. Antitumoral effect of cannabinoids in a genetic model of breast cancer (sometido para su publicación). - Tardáguila M, Mira E, González-Martín A, Lira SA, Mateo F, Garcia S, Thomson TM, Mañes S. CX3CL1 induces epithelial-to-mesenchymal transition in vitro and enhances local tumor invasiveness in vivo (en preparación). 12