Download Relación entre el transporte de glucosa y lactato en células del

Profesor Patrocinante
Dra. Maite A. Castro
Instituto de Bioquímica y
Microbiología
Facultad de Ciencias
Profesor Copatrocinante
Dra. Ilona I. Concha
Instituto de Bioquímica y
Microbiología
Facultad de Ciencias
Relación entre el transporte de glucosa y
lactato en células del sistema nervioso
Tesis de Grado presentada como parte de
los requisitos para optar al grado de
Licenciado en Bioquímica y Título
Profesional de Bioquímico
MARÍA PAZ MIRÓ PINO
Valdivia – Chile
2011
Dedicado a mis padres y hermanos
por su apoyo incondicional. A mi pareja y
mi hijito precioso, por llenar todo de luz. Y
a mis amigos, por siempre estar a mi lado.
AGRADECIMIENTOS
Quisiera agradecer en primer lugar a la Dra. Maite A. Castro por permitirme
formar parte de su laboratorio, por brindarme apoyo profesional y personal, agradecer
de manera muy especial su dedicación, comprensión y confianza. Además quiero
expresar mi más sincero agradecimiento a la Dra. Ilona I. Concha, por apoyarme en mi
formación como profesional. Sin duda, mencionar a todos quienes han compartido
conmigo esta etapa y que han hecho del laboratorio un lugar agradable para trabajar,
Aníbal Acuña, Felipe Beltrán, Macarena Solís, Magdalena Esparza, Carlos Kramm,
Pablo Moll, Paulina Troncoso, Franz Villarroel, Rodrigo Maldonado, Cristian Torres,
Camila Lopez, Karen Vander Stelt, Karina Cereceda, Antonia Covarrubias, Esteban
Salazar y a todos los integrantes del Instituto de Bioquímica y Microbiología de la
Universidad Austral de Chile.
Además quisiera agradecer a mis padres y hermanos por su apoyo incondicional,
por creer en mí y por brindarme todo su amor. A Luis y a mi pequeño Lucas que han
sido mis pilares fundamentales, gracias por sus sonrisas y por su infinito amor. No
puedo dejar de mencionar a quienes han acompañado mis años de estudios y mi
camino por esta etapa, mis amigos, gracias de todo corazón por haber estado conmigo
en toda circunstancia, por haberme brindado su apoyo, su cariño y por haber creído en
mí. En especial a Noemí Gutiérrez, Cristian Torres, Carolina Salazar, Franz Villarroel,
Coral Elgueta y Aníbal Acuña.
Y finalmente agradecer a las fuentes de financiamiento que han hecho posible el
desarrollo de mi tesis DID-UACh, Fondecyt 11070065 y 1110571.
i
ÍNDICE DE CONTENIDOS
1. RESUMEN
1.1 Summary
1
3
2. INTRODUCCIÓN
2.1 Metabolismo del sistema nervioso central.
5
2.2 Glucosa como principal sustrato cerebral.
5
2.3 Lactato como sustrato energético cerebral.
8
2.4 Modelo de lanzadera de lactato astrocito-neurona.
11
2.5 Vitamina C y el sistema nervioso central.
14
2.5.1 Transporte activo de vitamina C.
16
2.5.2 Transporte facilitado de vitamina C.
17
2.6 Ácido ascórbico como modulador del metabolismo neuronal.
19
2.7 Hipótesis.
21
2.8 Objetivo General.
21
2.9 Objetivos específicos.
21
3. MATERIALES Y MÉTODOS
3.1 Materiales
3.1.1 Reactivos químicos.
3.2 Métodos
22
22
25
3.2.1 Cultivo Celular.
25
3.2.2 Cultivo de la línea celular C6.
25
3.2.3 Cultivo primario de neuronas corticales de ratas.
25
ii
3.2.4 Tratamiento de placas de cultivo con poli-L-lisina.
26
3.2.5 Ensayos de transporte.
26
3.2.6 Inmunofluorescencia en células C6.
27
3.2.7 Extracción de proteínas totales.
28
3.2.8 Separación electroforética de proteínas.
29
3.2.9 Transferencia de proteínas a membrana PVDF.
29
3.2.10 Análisis de Western blot.
30
3.2.11 Ensayos de captación de glucosa fluorescente.
31
3.2.12 Preparación de rebanadas estriatales.
32
3.2.13 Análisis electrofisiológicos.
32
3.3.14 Ensayos de viabilidad celular.
33
4. RESULTADOS
4.1 Análisis de la expresión de transportadores de monocarboxilato en
línea celular C6.
34
4.2 Análisis de la funcionalidad de transportadores de monocarboxilato,
MCTs.
36
4.3 Análisis de la expresión de transportadores de glucosa y
transportadores de ácido ascórbico en línea celular C6.
4.4 Análisis de la funcionalidad de los transportadores de hexosas, GLUTs.
39
39
4.5 Estudio del efecto de ácido ascórbico sobre el transporte de glucosa
en células C6.
41
iii
4.6 Efecto de la inhibición del transporte y de la fosforilación de glucosa sobre la
actividad de transportadores de hexosas y de monocarboxilato.
48
4.7 Efecto del pH extracelular sobre el transporte de DOG y lactato
en células C6.
54
4.8 Explorando el mecanismo del efecto de ácido ascórbico:
Efecto de glutatión sobre la incorporación de DOG y lactato
en células C6.
57
4.9 Explorando el mecanismo del efecto de ácido ascórbico:
Efecto de fosfoascorbato sobre la incorporación de glucosa
en rebanadas de estriado.
5. DISCUSIÓN
59
66
5.1 Las células C6 expresan transportadores de monocarboxilato,
transportadores de glucosa y transportadores de ácido ascórbico
funcionales.
67
5.2 El ácido ascórbico intracelular inhibe el transporte de DOG y
estimula el transporte de lactato solo en células que expresan
GLUT3.
70
5.3 La captación de DOG y lactato se ve afectada por un análogo
metabolizable de glucosa, no así por citocalasina B.
72
5.4 El aumento de la concentración de protones extracelular, logra
estimular el transporte de lactato sin modificar la incorporación
de glucosa.
74
iv
5.5 Glutatión intracelular afecta débilmente la incorporación de
desoxiglucosa.
75
5.6 Fosfoascorbato, un análogo no antioxidante de ácido ascórbico,
es capaz de inhibir el consumo de glucosa en neuronas bajo
actividad sináptica.
6. BIBLIOGRAFÍA
78
82
v
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1: Esquema del acoplamiento metabólico entre
astrocitos y neuronas.
Figura 2: Caracterización de la expresión de MCTs.
13
35
Figura 3: Evaluación del transporte de lactato en células
de glioma de rata C6.
37
Figura 4: Caracterización de la expresión de transportadores
de hexosa y transportadores de ácido ascórbico.
40
Figura 5: Análisis del transporte de análogos de
glucosa en células de glioma de rata C6.
42
Figura 6: Caracterización del transporte de DOG en células
expresando o no expresando GLUT3.
44
Figura 7: Efecto del ácido ascórbico intracelular sobre el
transporte de DOG y de lactato en células C6 expresando
o no expresando GLUT3.
46
Figura 8: Efecto de la inhibición de los GLUTs y de la inhibición
del metabolismo de glucosa sobre la incorporación de
DOG en células C6 expresando o no GLUT3.
51
vi
Figura 9: Efecto de la inhibición de los GLUTs y de la inhibición
del metabolismo de glucosa sobre la incorporación de
lactato en células C6 expresando o no GLUT3.
53
Figura 10: Efecto del pH sobre la incorporación
de lactato en células C6.
55
Figura 11: Efecto del pH sobre la incorporación
de DOG en células C6.
56
Figura 12: Efecto glutatión sobre la incorporación de DOG en
células C6 nativas y tratadas con shRNA para bloquear
la expresión de GLUT3.
58
Figura 13: Efecto del ácido ascórbico intracelular en la
restauración de la recuperación de la glucosa
después de la privación de glucosa en la presencia
de 4 CIN.
61
Figura 14: Fosfoascorbato, al igual que ácido ascórbico,
sería capaz de inhibir el consumo de glucosa
en neuronas bajo actividad sináptica glutamatérgica.
64
Figura 15: Esquema del acoplamiento metabólico entre
astrocitos – neuronas y de los componentes claves
en el efecto de ácido ascórbico.
81
vii
ÍNDICE ABREVIATURAS
AA: Ácido ascórbico.
AA-P: Fosfoascorbato
BHE: Barrera hemato-encefálica.
BSA: Albúmina de suero de bovino.
Cito B: Citocalasina B.
DHA: Ácido deshidroascórbico.
DMSO: Dimetilsulfóxido.
DOG: 2-desoxiglucosa.
DTT: 1,4-ditiotreitol.
FBS: Suero fetal de bovino.
GLUT: Transportador facilitativo de hexosas.
MCT: Transportador de monocarboxilatos.
OMG: 3-o-metilglucosa.
SVCT: Transportador de vitamina C y sodio.
SGLT: Co-transportador de sodio y glucosa.
SMCT: Transportador de monocarboxilato acoplado a sodio.
4 CIN: alfa-ciano-4-hidroxicinamato.
PVFD: difluoruro de polivinildeno.
AEBSF: 4-(2-Aminoetil)benzenosulfonil fluorido hidroclorido.
ACSF: Fluído cerebro espinal artificial.
1
1. RESUMEN.
La glucosa es el sustrato metabólico principal para el cerebro. De acuerdo con
ANLSH el consumo de glucosa en las neuronas se produce en condiciones de reposo,
mientras que las neuronas activas muestran una preferencia por el lactato. La clave de
este acoplamiento energético es la activación metabólica que se produce en los
astrocitos por el glutamato. El glutamato es capaz de estimular en los astrocitos el
transporte de glucosa, la glicólisis y por lo tanto la liberación de lactato y ácido
ascórbico. El ácido ascórbico liberado es captado por las neuronas a través de la
expresión del transportador de ácido ascórbico, SVCT2. El aumento de ácido ascórbico
intracelular es capaz de modular el metabolismo neuronal mediante la inhibición de la
captación de glucosa y la estimulación del transporte de lactato en estas células. El
efecto inhibitorio de la captación de glucosa por el ácido ascórbico depende de la
expresión GLUT3. Por lo tanto, el objetivo de este trabajo fue estudiar si el aumento en
el transporte de lactato es una consecuencia del efecto del ácido ascórbico mediado por
la inhibición del transportador GLUT3.
Mediante Western blot e inmunofluorescencia se evaluó la presencia de
transportadores de glucosa, GLUT1 y GLUT3, transportadores de monocarboxilato,
MCT1, MCT2 y MCT4 y de los transportadores de ácido ascórbico SVCT1, SVCT2 en la
línea celular C6 de glioma de rata. Por medio de ensayos funcionales usando
trazadores radioactivos se demostró la funcionalidad de estos transportadores. Para
imitar el efecto del ácido ascórbico en el transporte de glucosa se utilizó citocalasina B
2
(inhibidor de la GLUTs) y 2-desoxiglucosa (DOG, análogo de glucosa transportada por
GLUT y fosforilada por la hexoquinasa). La inhibición del transporte de glucosa por
citocalasina B no afectó el transporte de lactato. En contraste, la inhibición del
transporte y la fosforilación de la glucosa por el DOG fue capaz de estimular el
transporte de lactato. El efecto del DOG en el transporte de lactato depende de la
expresión GLUT3.
Finalmente, se diseñaron experimentos para explorar el mecanismo inhibitorio
del
ácido ascórbico. Para lo cual,
se usó glutatión, que es una molécula con
propiedades antioxidantes similares al ácido ascórbico. Adicionalmente se utilizó
fosfoascorbato cuya estructura molecular es similar a la del ascorbato, pero carece de
capacidad antioxidante. El transporte de glucosa fue moderadamente inhibido por
glutatión. Por el contrario, fosfoascorbato inhibió de utilización de la glucosa en las
células neuronales.
Por lo tanto, el alto nivel intracelular de ácido ascórbico es capaz de modular el
metabolismo neuronal bajo actividad sináptica glutamatérgica sin tener en cuenta sus
propiedades antioxidantes. El efecto del ácido ascórbico se debería a una interacción
directa o indirecta entre el ácido ascórbico, GLUT3, hexoquinasa u otra molécula
implicada en las primeras etapas de la utilización de glucosa.
3
1.1. SUMMARY
Glucose is the main metabolic substrate for brain. According to ANLSH glucose
consumption in neurons occurs under resting conditions, whereas active neurons
display a preference for lactate. The key of this energetic coupling is the metabolic
activation that occurs in astrocytes by glutamate. Glutamate is able to stimulate glucose
transport, glycolysis and both release of lactate and ascorbic acid in astrocytes.
Released ascorbic acid is taken up by neurons through the expression of ascorbic acid
transporter, SVCT2. The increase of intracellular ascorbic acid is able to modulate
neuronal metabolism inhibiting glucose uptake and stimulating lactate transport in these
cells. The inhibitory effect on glucose uptake by ascorbic acid is dependent on GLUT3
expression. Therefore,
the aim of this work was to study if the increase in lactate
transport is a consequence of ascorbic acid-mediated GLUT3 transporter inhibition.
Using Western blot and immunofluorescence the presence of glucose
transporters, GLUT1 and GLUT3, monocarboxylate transporters, MCT1, MCT2 and
MCT4, and ascorbic acid transporter SVCT1, SVCT2 in the cell line of rat glioma C6 was
evaluated. By means of functional assays using radioactive tracers we demonstrated the
functionality of these transporters. To mimic the effect of ascorbic acid on glucose
transport we used cytochalasin B (GLUTs inhibitor) and 2-deoxyglucose (DOG, glucose
analog transported by GLUT and phosphorylated by hexokinase). Inhibition of glucose
transport by cytochalasin B did not affect lactate transport. In contrast, inhibition of
transport and phosphorylation of glucose by DOG was able to stimulate the transport of
4
lactate. The DOG effect on lactate transport was dependent on GLUT3 expression.
Finally, we designed experiments to explore the ascorbic acid inhibitory
mechanism. Therefore we use gluthathione wich is a molecule with similar antioxidant
properties to ascorbic acid. Additionaly we used phopho-ascorbate whose molecular
structure is similar to that of ascorbate, but devoid of an antioxidant properties. The
transport of glucose was moderately inhibited by gluthathione. Conversely, phosphoascorbate strongly inhibited glucose utilization in neuronal cells.
Therefore, high intracellular ascorbic acid
level is able to modulate neuronal
metabolism under glutamatergic synaptic activity regardless its antioxidant properties.
Ascorbic acid effect should work through a direct or indirect interaction between ascorbic
acid, GLUT3, hexokinase or another molecule involved in the early steps of glucose
utilization.
5
2. INTRODUCCIÓN
2.1 Metabolismo del sistema nervioso central.
Es sabido que el cerebro es un órgano muy importante dentro del organismo y
aunque constituye sólo el 2% de su masa corporal en un adulto, es responsable de
aproximadamente el 25% del consumo de oxígeno total (Siesjèo, 1978). La mayor parte
de la energía producida en el cerebro es utilizada para la propagación de los
potenciales de acción, para el mantenimiento de los potenciales de membrana (Attwell y
Laughlin, 2001), para el reciclamiento de neurotransmisores, el funcionamiento de los
sistemas de señalización intracelular y el transporte axonal y dendrítico (Ames, 2000).
2.2 Glucosa como principal sustrato cerebral.
La glucosa sirve como fuente energética por excelencia para el sistema nervioso
central (SNC), el cual es un tejido óptimamente equipado para metabolizarla, ya que
expresa sistemas que permiten el ingreso de glucosa a través de la membrana
plasmática y expresa enzimas capaces de metabolizar glucosa en las células
cerebrales. Existen dos sistemas que permiten el ingreso de la glucosa proveniente del
torrente sanguíneo hacia el parénquima cerebral, uno de estos sistemas corresponde a
los transportadores facilitativos de glucosa, GLUTs. Estos transportadores pertenecen a
una familia de proteínas de membrana de 45-55 kDa, de las cuales se han identificado
14 isoformas funcionales, GLUT 1-14 (Joost y Thorens, 2001; Doege et al., 2001;
6
Ibberson et al., 2000; Lisinski et al., 2001; Joost, et al., 2002; Rogers et al., 2002). Los
GLUTs sólo son capaces de translocar a través de la membrana plasmática los Denantiómeros de glucosa a favor de un gradiente químico no dependiente de energía.
Dentro de las isoformas de GLUT más importantes presentes en cerebro
encontramos: GLUT1 que se encuentra ampliamente expresado, siendo responsable
del suplemento basal de glucosa para muchas células (Thorens et al., 1988), a nivel
cerebral se expresa en las células endoteliales de la barrera hematoencefálica (BHE)
(Nualart et al., 1999; Agus et al., 1997) en las células epiteliales de los plexos
coroídeos, en células ependimarias (Nualart et al., 1999; Silva et al., 2005) y también en
neuronas y astrocitos (Aller et al., 1997). Otro transportador importante es GLUT3, un
transportador de glucosa de alta afinidad, siendo el principal transportador de glucosa
en las neuronas del SNC (Maher et al., 1996). Por otro lado, GLUT2 y GLUT4 han sido
descritos en zonas específicas del cerebro como hipotálamo (García et al., 2003) y
cerebelo (Choeiri et al., 2002), respectivamente.
Para el caso de GLUT5 se ha
encontrado que se expresa en el cerebro en desarrollo (Nualart et al., 1999) y GLUT8
se expresa en neuronas excitatorias e inhibitorias del hipocampo (Reagan et al., 2002),
localizándose principalmente en vesículas intracelulares (Ibberson et al., 2000).
El otro sistema de transporte de glucosa, corresponde a un sistema de transporte
activo el cual está a cargo de una familia que incluye co-transportadores de sodio y
glucosa (SGLT) la cual está compuesta por 12 miembros (SGLT1-12) (Wright, 2011) ,
de los cuales se ha demostrado la expresión de 5 de ellos en el ser humano. SGLT1
7
está presente en la barrera hematoencefálica (Elfeber et al., 2005), el mRNA de SGLT2
se encontró en microvesículas aisladas de cerebro de rata (Enerson y Drenes, 2006) y
su funcionalidad fue demostrada más tarde, en la barrera hematoencefálica (Vemula et
al., 2009). A su vez, los mRNA de SGTL1, SGLT3a, SGLT3b han sido encontrados en
cultivos de neuronas hipotalámicas donde estarían contribuyendo a sensar los niveles
de glucosa (O’Malley et al., 2006, Gonzáles et al., 2009) y finalmente SGLT4 y SGLT6
también han sido descritos en cerebro (Wright et al, 2004).
Como mencionamos anteriormente, las células del SNC están capacitadas para
incorporar glucosa, así como también son capaces de metabolizarla, ya que expresan
toda la maquinaria enzimática participante en la glicólisis y el ciclo del ácido cítrico
(Lowry et al., 1964; Golberg et al., 1966). En el cerebro, prácticamente la totalidad de la
glucosa incorporada es oxidada a CO 2 y agua a través de la glicólisis y el ciclo del ácido
cítrico. La relación entre el consumo de O 2 y la producción de CO2 en el cerebro es
cercana a 1, de lo que se desprende que los carbohidratos, y en particular la glucosa,
son sustratos exclusivos del metabolismo oxidativo en el cerebro. Esto último, es
reafirmado por el hecho de que las concentraciones de glucosa intra y extracelular
superan con un amplio margen la Km de 0,04 mM para hexoquinasa (Lowry y
Passonneau, 1964) enzima que marcaría la puerta de entrada para la vía glicolítica.
8
2.3 Lactato como sustrato energético cerebral.
Si bien la glucosa es el principal sustrato metabólico de las células del sistema
nervioso central, éstas también poseen la capacidad de incorporar otros sustratos
metabólicos. La glicólisis, seguida de la fermentación láctica produce dos moléculas de
lactato por cada glucosa degradada. Cuando la tasa glicolítica se ve incrementada,
parte del lactato producido es transportado al espacio extracelular en donde existen
tejidos capaces de incorporar lactato utilizándolo para proveer energía al ser oxidado a
piruvato e incorporarlo al ciclo del ácido cítrico (Baker et al., 1998; Koehler-Stec et al.,
1998). En los últimos años esta idea ha adquirido importancia, apuntando a que las
neuronas serían células que preferentemente consumirían este monocarboxilato
(Bousier-Sore et al., 2007).
Debido a que el pKa del ácido láctico es 3,86; a pH fisiológico éste se encuentra
completamente disociado lo que conlleva a que no pueda cruzar por sí mismo la
membrana plasmática, entonces se requiere de un sistema de transporte que facilite el
ingreso de lactato a las células. Este hecho explica la expresión de transportadores de
monocarboxilato, MCTs, que catalizan el transporte facilitado de una molécula de
lactato y un protón (Poole y Halestrap, 1993)
.
Los MCTs corresponden a una familia de transportadores presentes en casi
todos los tejidos (Halestrap et al., 2004), de los cuales se han identificado 14
9
secuencias relacionadas a MCT en mamíferos (MCT1-14), habiendo sido demostrada
su funcionalidad (co-transporte de lactato y protones) para MCT1-4 (Halestrap et al.,
1999, Halestrap et al., 2004; Juel et al., 1999). Las isoformas 1-8, 12 y 14 de estos
transportadores han sido descritas a nivel cerebral.
El mRNA de MCT1 ha sido detectado en las células epiteliales de los plexos
coroídeos, células ependimarias y células endoteliales de la BHE (Koehler-Stec et al.,
1998). Además se ha descrito la presencia de MCT1 en prácticamente todos los
astrocitos del SNC (Chiri et al., 2006; Pellerin et al., 2005; Pierre et al., 2005) y en un
grupo reducido de neuronas del hipocampo (Ainscow et al., 2002; Tseng et al., 2003).
MCT2 se encuentra en los pies vasculares de los astrocitos (Broer et al., 1997; Hanu et
al., 2000) y principalmente en las densidades postsinápticas de las neuronas del SNC
(Pellerin et al. , 2005; Pierre et al., 2005; Bergersen et al., 2007). Se ha observado que
la expresión de MCT2 en las células neuronales se incrementa en presencia de algunos
neurotransmisores como es el caso de noradrenalina (Chenal et al., 2007). De acuerdo
a sus características funcionales, se ha observado que MCT1 y MCT2 presentan
valores de Km aparente similares y probablemente ambas participen en la entrada de
lactato a las células (Juel et al., 1999; Broer et al., 1997). Por otro lado MCT3 se
expresaría en plexos coroídeos, ubicándose en las membranas basolaterales de dichas
células (Philp et al., 2001). También MCT4 ha sido descrito en tanicitos y en astrocitos
de diversas áreas cerebrales, donde funcionaría principalmente en la liberación de
lactato al espacio extracelular (Cortéz-Campos et al., 2011; Pellerin et al., 2005;
Bergersen et al., 2007). MCT 5-7, 11 y 14 han sido descritos a nivel cerebral, sin
10
embargo, se desconoce la afinidad por sustrato de estos transportadores (Halestrap et
al., 2004; Price et al, 1998). Por último, MCT8 y MCT10 también han sido descritos en
cerebro (Heuer et al., 2005; Alkemade et al., 2011) , pero al parecer estas isoformas no
tendrían afinidad por lactato (Halestrap et al. , 2004) y preferentemente serían
transportadores de hormonas tiroídeas (Friesema et al., 2003).
Otros
sistemas
de
transporte
de
lactato
son
los
transportadores
de
monocarboxilato dependientes de sodio (SMCTs) (Li et al., 2003, Ganapathy et
al.,2008), de los cuales han sido identificadas dos isoformas (SMCT1 y SMCT2), ambas
expresadas en cerebro, siendo SMCT1 encontrada principalmente en neuronas (Martis
et al., 2006) y SMCT2 en astrocitos (Martin et al., 2007).
Las células cerebrales además de incorporar lactato, son capaces de generarlo
para su exportación. En neuronas ha sido encontrada la isoforma 1 de lactato
deshidrogenasa (LDH, EC 1.1.1.27) encargada de convertir lactato a piruvato, mientras
que en astrocitos se han visto expresadas LDH1 y LDH5 (Bittar et al., 1996), siendo
esta última la que predomina en tejidos que hacen fermentación láctica. De acuerdo a
esto, es posible especular que bajo condiciones de privación de alimento, tanto
neuronas como astrocitos, consumirían lactato u otros monocarboxilatos como piruvato
y cuerpos cetónicos, como fuente de energía, lo cual bajo condiciones normales, con
una permeabilidad de la BHE normal sería el lactato el sustrato metabólico neuronal
preferido (Bouzier-Sore et al., 2003: Brown et al., 2001; Larrabee et al., 1995; Tyson et
al., 2003), siendo las neuronas quienes lo ocupen como combustible energético, tal
11
como ha sido propuesto en el modelo de la lanzadera de lactato astrocito-neurona
(Magistretti et al., 1999).
2.4 Modelo de lanzadera de lactato astrocito-neurona.
La lanzadera de lactato astrocito-neurona (ANLSH) (Pellerin y Magistretti, 1994)
postula que bajo condiciones de reposo las neuronas consumirían glucosa, mientras
que bajo actividad sináptica consumirían preferentemente lactato, el cual sería producto
de la glicólisis y posterior fermentación láctica que tendría lugar en los astrocitos. En
ambos casos, actividad y reposo, el consumo neto global del cerebro estaría sustentado
por la glucosa. Bajo condiciones de actividad sináptica glutamatérgica, el glutamato
estimula la incorporación de glucosa mediada por GLUT1 (Pellerin y Magistretti , 1994;
Loaiza et al., 2003) y la glicólisis en astrocitos, seguida de la liberación de lactato al
espacio extracelular (Pellerin y Magistretti 1994; Demestre et al., 1997). El lactato sería
captado por las neuronas adyacentes, las cuales completarían la degradación del
esqueleto carbonado a CO2 y agua (Magistretti et al., 1999, Izumi et al., 1997; Schurr et
al., 1999; Kasischke et al., 2004). El flujo de lactato entre las células cerebrales es
posible gracias a la presencia de transportadores de monocarboxilato (MCTs) y a la
expresión diferencial de LDH entre neuronas y astrocitos (Figura 1). El glutamato que
es captado por los astrocitos es transformado a glutamina por la presencia de glutamina
sintetasa (EC 6.3.1.2), que sólo se expresa en este tipo celular (Hanu et al., 2000;
Waniewski et al., 1986; McKenna et al., 1996), y liberada hacia el espacio extracelular.
La glutamina es captada por las neuronas y convertida a glutamato por la glutaminasa
12
(EC 3.5.1.2). Este ciclo glutamato-glutamina sucede en una razón 1:1 con el
metabolismo oxidativo neuronal (Sibson et al., 1997; Shen et al., 1999), por lo tanto, el
reciclaje y el mantenimiento de concentraciones no tóxicas del neurotransmisor
excitatorio más importante del SNC son los eventos que gobiernan el acoplamiento
metabólico entre neuronas y astrocitos.
Sin embargo, un aumento de la actividad glicolítica inhibe la oxidación de lactato,
por consiguiente la activación de la glicólisis produce un aumento de la concentración
de piruvato y protones acompañada de la disminución de la razón NAD +/NADH, lo que
desplazaría el equilibrio y favorecería la catálisis desde piruvato a lactato.
Por
consiguiente, la utilización de lactato por las neuronas sólo sería posible si el consumo
de glucosa, ya sea a nivel del transporte o de los primeros pasos de metabolismo,
estuvieran inhibidos. En este contexto, en nuestro laboratorio hemos descrito que la
forma reducida de la vitamina C, ácido ascórbico, participa activamente modulando el
metabolismo neuronal entre periodos de reposo y actividad (Castro et al., 2009). En
otras palabras, bajo condiciones de actividad sináptica el ácido ascórbico inhibe la
utilización de glucosa (Castro et al., 2007) y estimula la captación de lactato (Castro et
al., 2008), tal como se muestra en la Figura 1. Dicha modulación hemos visto que es
dependiente de la expresión de GLUT3.
13
Figura 1. Esquema del acoplamiento metabólico entre astrocitos y neuronas. Bajo
actividad sináptica glutamatérgica el exceso de glutamato es removido principalmente
por acción de astrocitos. El glutamato al ingresar a los astrocitos produce un aumento
en la incorporación de glucosa y un aumento en la liberación de ácido ascórbico y
lactato hacia el medio extracelular. Las neuronas son capaces de incorporar ácido
ascórbico gracias a la expresión de SVCT2. El ácido ascórbico intracelular, inhibe la
incorporación de glucosa y promueve el transporte de lactato en células que expresan
GLUT3. Asc: ácido ascórbico. Gluc: glucosa. GSH: glutatión reducido. GSSH: glutatión
oxidado. HK: hexoquinasa. Glu: glutamato. Asc+: deshidroascórbico.
14
2.5 Vitamina C y el sistema nervioso central.
La vitamina C es una molécula de seis átomos de carbono, con un peso
molecular de 176,13 g/mol. Tiene la particularidad de poseer dos grupos ionizables con
valores de pKa de 4,2 y 11,8, lo que hace que a pH fisiológico se encuentre
monoionizada dándole alta hidrosolubilidad.
Esta vitamina es sintetizada en la forma de ácido ascórbico por una variedad de
organismos del reino animal y vegetal. En la mayoría de los mamíferos, dicha síntesis
ocurre principalmente en el hígado, a diferencia de los humanos, otros primates y el
cuye quienes son incapaces de sintetizar este compuesto. Esto debido a la deficiencia
de la enzima L-gulono-γ-lactona oxidasa (GLO) que cataliza la oxidación de L-gulono-γlactona a ácido L-ascórbico con la formación de peróxido de hidrógeno (Kiuchi et al.,
1982; Grunewald et al., 1993). El ácido ascórbico es un importante cofactor enzimático
(Grunewald, 1993; Padh, 1990) y un poderoso agente antioxidante, siendo esta última
cualidad la que le otorga el rol neuroprotector. El ácido ascórbico es capaz de afectar la
neurotransmisión a través de varios mecanismos: bloqueando la unión de algunos
neurotransmisores a sus receptores específicos (Majewska et al., 1999a ; Majewska et
al., 1999b), modulando los sistemas de liberación y recaptación de neurotransmisores
(Levine et al., 1985a) o participando como cofactor en la síntesis de los mismos
(Paterson et al. , 1989; Levine et al., 1985b). Se sabe que los niveles cerebrales
extracelulares de ácido ascórbico sufren una rápida elevación en respuesta a la
actividad cerebral (O'Neill et al. , 1984; Boutelle et al., 1989) y además, existe una
15
amplia evidencia que sugiere que el eflujo de ácido ascórbico hacia el espacio
extracelular en el SNC se encuentra fuertemente relacionado con la actividad de
neuronas glutamatérgicas (O'Neill et al., 1984; Yusa et al., 2001). Las células
astrocíticas jugarían un importante papel en dicho eflujo, liberando ácido ascórbico al
espacio extracelular en respuesta a la captación de glutamato (Wilson et al., 2000).
La absorción de vitamina C se realiza a nivel intestinal por los enterocitos, los
cuales son capaces de captar tanto la forma reducida o ácido ascórbico, como su forma
oxidada llamada ácido deshidroascórbico. La forma oxidada puede ser reciclada a su
forma reducida por distintos mecanismos enzimáticos dentro de la célula, dependientes
(Himmelreich et al., 1998; Ishikawa et al., 1998; Park y Levine, 1996) o independientes
(Guaiquil et al., 1997; May et al., 1998; Savini et al., 2000) de glutatión.
En el cerebro, el ácido ascórbico se acumula principalmente en la corteza, el
núcleo accumbens, el hipotálamo, el hipocampo y los plexos coroideos (Grunewald et
al., 1993; Milby et al., 1982; Spector et al., 1973 ). Las concentraciones de ácido
ascórbico cerebral alcanzan un promedio de 2-3 mM, casi 10 órdenes de magnitud
mayores a las concentraciones plasmáticas, las cuales fluctúan entre 40-60 µM (Rice et
al, 2000, Spector y Lorenzo, 1973). Las concentraciones extracelulares cerebrales de
ácido ascórbico son aproximadamente 0,3 mM, mientras que la concentración
intracelular se encuentra cercana a 10 mM para neuronas y 1 mM para células gliales
(Rice et al.,1998). Puesto que el ácido ascórbico no puede ser sintetizado dentro del
cerebro de ninguna especie, los altos niveles cerebrales de ácido ascórbico se deben a
16
la expresión de mecanismos específicos de captación en las células del SNC. Para ello
existen dos mecanismos que favorecen el transporte de ambas formas redox:
transporte de ácido ascórbico a cargo de los transportadores de sodio y vitamina C,
SVCTs, y transporte facilitativo de ácido deshidroascórbico a cargo de transportadores
de hexosas, GLUTs.
2.5.1 Transporte activo de vitamina C.
Corresponde a un sistema de transporte activado por gradiente electroquímico
de sodio, que transporta vitamina C reducida, ácido ascórbico. Estos transportadores
presentan dependencia de temperatura y son fuertemente dependientes de la gradiente
de Na+, permitiendo así solo la entrada de ascorbato a la célula. Hasta la fecha, han
sido clonadas dos isoformas de los transportadores de ácido ascórbico y sodio, SVCT1
y SVCT2 (Faaland et al., 1998; Daruwala et al., 1999; Tsukaguchi et al., 1999), los
cuales poseen similar secuencia aminoacídica pero difieren en su distribución en
tejidos. SVCT1 se expresa principalmente en tejidos epiteliales tales como intestino
delgado, riñones, hígado, ovarios y próstata (Rice et al., 2000; Tsukaguchi et al., 1999).
Por su parte, SVCT2 se expresa en tejido ocular, endocrino y cerebral. La presencia del
mRNA codificante para SVCT2 ha sido descrita en neuronas glutamatérgicas y
GABAérgicas (Castro et al., 2001; Tsukaguchi et al., 1999), en células gliales del
hipotálamo (García et al., 2005) y en plexos coroídeos (Tsukaguchi et al, 1999; Caprile
et al., 2009). Los valores de Km descritos para SVCT1 fluctúan entre 100-300 µM
17
(Wang et al., 1999, 2000) y para SVCT2 varían entre 20-100 µM (Duruwala et al., 1999;
Castro et al., 2001).
Por consiguiente, la vitamina C es capaz de concentrarse y compartimentalizarse
altamente en el sistema nervioso central, gracias a la expresión y distribución de
mecanismos específicos de transporte en este tejido.
2.5.2 Transporte facilitado de vitamina C.
Otro de los sistemas de transporte responsable de la adquisición de vitamina C
son los transportadores de glucosa, GLUTs. Estos son los encargados de transportar la
vitamina C en su forma oxidada, ácido deshidroascórbico. Este mecanismo se realiza a
favor de un gradiente de concentración lo cual involucraría que la célula cuente con el
mecanismo para reducir el ácido deshidroascórbico a ácido ascórbico para su
acumulación (Vera et al., 1993). Se ha descrito que las isoformas GLUT1-GLUT4 son
capaces de reconocer como sustrato alternativo al estado oxidado de la vitamina C,
presentando un mecanismo de transporte bi-direccional de baja afinidad, con una Km 14 mM, el cual es inhibido por glucosa y también por citocalasina B (Vera et al., 1993;
Vera et al., 1995; Rumsey et al., 1997; Angulo et al., 1998; Nualart et al., 2003), un
clásico inhibidor de GLUTs (Bloch et al., 1973; Taverna et al., 1973). Es importante
destacar, que para que se haga efectivo el transporte de vitamina C mediado por
transportadores de glucosa, es necesario que este compuesto sea oxidado localmente
(Himmelreich et al., 1998; Nualart et al., 2003; Agus et al., 1999; Vera et al., 1998),
18
puesto que prácticamente el 100% de la vitamina C en el organismo se encuentra como
ácido ascórbico (Schorah et al., 1996).
Los GLUTs son capaces de transportar ácido ascórbico hacia el exterior de la
célula, mientras que los SVCTs lo hacen hacia el interior de la célula. Se han descrito
probables rutas para la salida del ácido ascórbico de las células, de los cuales destacan
los canales de aniones sensibles a volumen (Fürst et al., 2002), que han sido
encontrados en astrocitos (Wilson et al., 2000; Siushansian et al., 1996) y otros tipos
celulares (Upston et al., 1999; Davis et al., 2006 a y b; May et al., 2006). Otra
posibilidad para la salida de ácido ascórbico de la célula es un intercambiador
glutamato-ascorbato, del cual se tiene evidencia que deja salir
14
C-ácido ascórbico de
células previamente cargadas, y que han sido tratadas con ácido ascórbico extracelular
(Finns y John, 1980; Kathami et al., 1986). A su vez ha tomado fuerza en los últimos
años, la evidencia de hemicanales formados por conexinas, los cuales han mostrado un
flujo bidireccional de ácido ascórbico (Ahmad y Evans, 2002; Ramundo-Orlando et al.,
2005) de manera transcelular (Berthoud y Beber, 2009, Portugal et al, 2009). Por último
se ha observado que en vesículas secretoras liberadas por la glándula adrenal existe
una alta concentración de ácido ascórbico, que depende intrínsecamente de la
regulación por Ca+2 (Daniels et al., 1982 y 1983; Deliberto et al., 1983). En neuronas
(Neher y Sakaba, 2008) y astrocitos, (Evanko et al., 2004; Montana, 2006) la exocitosis
de neurotransmisores y gliotransmisores está regulado por Ca +2, lo que a su vez implica
que el ácido ascórbico también pueda ser liberado por exocitosis.
19
2.6 Ácido ascórbico como modulador del metabolismo neuronal.
Según datos recientes de nuestro laboratorio, el ácido ascórbico funcionaría
como una especie de switch metabólico, inhibiendo el consumo de glucosa durante
episodios de actividad sináptica glutamatérgica (Castro et al., 2007), y estimulando la
captación de lactato en cultivos neuronales (Castro et al., 2008). En experimentos
realizados en rodajas de hipocampo de ratas adultas hemos observado que ácido
ascórbico es capaz de modular la habilidad de glucosa de servir como fuente energética
para sustentar la actividad sináptica (Castro et al., 2007). La privación de glucosa
produce una lenta depresión en la respuesta post sináptica de neuronas de la región de
CA1 del hipocampo (Castro et al., 2007, Izumi et al., 1997). Después del periodo de
privación, la respuesta sináptica se recupera rápidamente solo cuando se mantiene
inhibida la incorporación de ácido ascorbico. Por lo tanto, el flujo de ácido ascórbico
desde células gliales hacia células neuronales, gatillado por la actividad sináptica
glutamatérgica, inhibe la utilización de glucosa y por tanto, la capacidad de este azúcar
de proveer energía. Dicha energía, necesaria para sustentar la propagación del impulso
nervioso, sería suplida a través de la producción de ATP mitocondrial a partir de la
oxidación de carbonos provenientes de monocarboxilatos, lactato y/o piruvato,
producidos endógenamente en el tejido cerebral.
El mecanismo mediante el cual ácido ascórbico sería capaz de inhibir el
consumo de glucosa aún no ha sido descrito. Datos de nuestro laboratorio muestran
que el ácido ascórbico intracelular es capaz de inhibir la incorporación de desoxiglucosa
20
(DOG), un análogo de glucosa fosforilable por hexoquinasa y transportado por los
GLUTs, en células que expresan el transportador de glucosa GLUT3 (Castro et al.,
2007, Castro et al., 2008, Beltrán et al., 2011). Del mismo modo, ácido ascórbico
intracelular es capaz de estimular el transporte de lactato solo en células que expresan
GLUT3 (Castro et al., 2008). Por lo tanto, es posible especular que la estimulación de la
incorporación de lactato puede ser una consecuencia de la inhibición de GLUT3
producida por ácido ascórbico.
21
2.7 HIPÓTESIS
El aumento en la incorporación de lactato es una consecuencia de la inhibición
del transportador de glucosa GLUT3 mediada por ácido ascórbico.
2.8 OBJETIVO GENERAL
Determinar si el aumento en la incorporación de lactato producto del efecto del
ácido ascórbico es dependiente de la inhibición del transportador GLUT3.
2.9 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1. Establecer modelos de estudios que expresen transportadores de glucosa,
monocarboxilato y ácido ascórbico funcionales.
2. Determinar si la estimulación del transporte de lactato mediada por ácido ascórbico,
es mediada por la inhibición de GLUTs, específicamente GLUT3, o por la inhibición de
la fosforilación de glucosa por hexoquinasa.
3. Determinar el efecto de la estimulación del transporte de lactato sobre la
incorporación de análogos de glucosa.
4. Determinar si la naturaleza del mecanismo de inhibición del efecto del ácido
ascórbico es mediada por su poder antioxidante.
22
3. MATERIALES Y MÉTODOS
3.1 MATERIALES
3.1.2 REACTIVOS QUÍMICOS
De Sigma Chemical Co. (USA) se obtuvieron los siguientes reactivos: poli-L-lisina
(>350kDa), D-(+)-glucosa, citocalasina B (cito B), 2- desoxiglucosa (DOG), o –
Metilglucosa (OMG), L- ácido ascórbico, azul de tripan, Azúl de Coomassie G-250,
Histochoice, L-ácido ascórbico, Tritón x-100, rojo fenol, fosfoascorbato, ester de
glutatión , alfa-ciano-4-hidroxicinamato (4 CIN).
De Merck & Co, Inc. (Alemania) se obtuvieron los siguientes reactivos: cloruro de
mercurio II, ácido clorhídrico, cloruro de potasio, alcohol metílico, alcohol etílico, fosfato
diácido de sodio, fosfato dihidrógeno de potasio, hidróxido de sodio, acrilamida,
bisacrilamida, alcohol isopropílico.
De Winkler Ltda., se adquirió albúmina de suero bovino (BSA), carbonato de sodio,
cloruro de sodio, cloruro de calcio, cloruro de magnesio, glicina, Tris, dodecilsulfato de
sodio (SDS), reactivo de Bradford, tampón de carga 2X.
De Gibco – BRL Laboratories Life Technologies, Inc. (USA): Se adquirió tripsinaEDTA, L-glutamina, penicilina/estreptomicina/fungi-zona, OPTIMEM-I.
23
De Hyclone (USA), se adquirió Dubelcco’s Eagle modificado enriquecido con F-12
(DMEM F-12) y suero fetal bovino (FBS).
De Santa Cruz Biothecnology (USA) se obtuvo, anti-GLUT1 (sc-7903), anti-β actina
(sc-81178). De Abcam (USA), se obtuvo anti-GLUT3 (Ab 15311). De INVITROGEN
Corporation
(USA)
se
obtuvo
TO-PRO-3,
2-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-
il)amino)-2-desoxiglucosa (2-NBDG) (N13195), 6-(N-7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4il)amino)-6-desoxiglucosa (6-NBDG) (N23106).
De DAKO (USA) se obtuvo medio de montaje para fluorescencia.
De Pierce Biotechnology, Inc (USA) (Thermo scientific), se adquirieron anticuerpos
secundarios conjugados con peroxidasa, anti-IgG de ratón, anti-IgG de cabra y anti-IgG
de conejo, reactivo ECL para quimioluminiscencia y cóctel de inhibidores de proteasas
100X.
De MBI Fermentas (USA), fue adquirido el estándar de peso molecular preteñido para
geles de poliacrilamida-SDS.
De BioWORLD (USA), se adquirió TEMED. De Calbiochem EMD chemicals Inc., se
obtuvo Tween-20 y β-mercaptoetanol.
24
De American Radiolabeled Chemicals, Inc. (USA) se obtuvo el análogo radiactivo
{1,2-3H}-Desoxi-D-glucosa (3H-DOG).
De Perkin Elmer (USA) se obtuvo el análogo radiactivo ácido láctico sal de sodio,
14
C-
lactato.
De National Diagnostics (USA) Ecoscint, se adquirió el líquido de centelleo y viales
para radiactividad.
Finalmente los equipos utilizados fueron los siguientes: pHmetro WTW Inolab
pH720, Balanza precisa AND GR-200, cámara de Neubauer VWR, Gabinete de cultivo
Nuaire™ class II UN-425-600-E, Incubador Nuaire™ DH Autoflow, Baño termorregulado
Memmert, Centrífuga SIGMA 2-16PK, Centrífuga SIGMA 1-14, Contador de Centelleo
Perkin Elmer Tri-Carb 2910 TR, Microscopio confocal OLYMPUS FLUOVIEW FV100,
Microscopio invertido OLYMPUS CKX41, Fuente de poder Bio-Rad Power Pac™ basic,
agitador magnético IKA RH basic 2, Sonicador Ultrasonic Homogenizer 4710 Cole
Parmer instruments Co, Espectrofotómetro Thermo Scientific Evolution 60, Sistema de
electroforesis Mini proteanR Tri-Carb 1600 TR, Freezer -80°C Foma Scientific Biofreezer 8425, Freezer -20°C Consul, Refrigeradores Fensa y Whirlpool, NANODROP.
25
3.2 MÉTODOS
3.2.1 CULTIVOS CELULARES.
En todos los casos las células fueron cultivadas en incubador a 37º C y en un
ambiente 5% de CO2.
3.2.2 CULTIVO DE LA LINEA CELULAR C6.
La línea celular C6, (ATCC®-CCL 107 ™) fue cultivada en medio DMEM-F12
suplementado con 10% de FBS, penicilina 50 U/ml, estreptomicina 50 mg/ml, fungizona
50 ng/ml y L-glutamina 2 mM. Para su uso las células mantenidas a un 70% de
confluencia fueron lavadas con tampón fosfato 0,1 M (PBS, pH7,4, 320 mOsm) y
tratadas con tripsina-EDTA 0.25% (p/v) para luego ser sembradas a una densidad de 34 x 105 células/cm2 para los respectivos experimentos.
3.2.3 CULTIVO PRIMARIO DE NEURONAS CORTICALES DE RATA.
Las neuronas corticales fueron obtenidas desde embriones de ratones Wistar de
17 días de gestación. Las hembras fueron anestesiadas usando cloroformo y los
embriones fueron removidos y luego decapitados. Se removió el procencéfalo y la
corteza fue disecada. Luego de esto el tejido fue digerido con 0,12% de tripsina en PBS
0,1 M (pH 7,4; 320 mOsm) y disgregado mecánicamente con una pipeta Pasteur. Las
células fueron sembradas en una cantidad aproximada a 3x10 6 células/cm2 en placas
que fueron previamente tratadas con poli-l-lisina. Después de transcurridos 20 minutos,
se retiraron las células no adheridas y se reemplazó el medio por medio Neurobasal
26
suplementado con B-27, penicillina 50 U/ml, estreptomicina 50 mg/ml, amfotericina B
50 ng/ml y L-glutamina 2 mM. Las células neuronales fueron utilizadas luego de 5 días
de cultivo in vitro.
3.2.4 TRATAMIENTO DE PLACAS DE CULTIVO CON POLI-L-LISINA.
Las respectivas placas de cultivo fueron tratadas con una solución 0,01% de poliL-lisina (peso molecular > 350 kDa) durante 20 minutos en estufa a 37ºC y luego fueron
lavadas 3 veces por periodos de 10 minutos con agua estéril.
3.2.5 ENSAYOS DE TRANSPORTE
Para estos ensayos, las células fueron sembradas en placas de cultivo celular de
12 pocillos tratadas previamente con poli-L-lisina, a una densidad promedio de 3-4x10 5
células por pocillo. Previo a cada ensayo se seleccionaron bajo microscopio solo
aquellos pocillos con densidad celular uniforme. Adicionalmente, se determinó el
número promedio de células por pocillo utilizando cámara de Neubauer. Posteriormente
las células fueron lavadas con tampón de incubación (Hepes 15 mM, NaCl 135 mM, KCl
5 mM, CaCl2 1,8 mM, MgCl2 0,8 mM, pH 7,4) e incubadas en la misma solución durante
15 minutos con el fin de permitir el equilibrio entre el espacio intracelular y extracelular.
Los ensayos de incorporación fueron realizados en un volumen final de 500 µl de
tampón de incubación con {1,2-3H}-Desoxi-D-glucosa (3H-DOG) 0,2-0,5 µCi/ 3H-DOG 0,5
mM, D-3-O- {metil- 3H} – glucosa (3H-OMG) 0,2-0,5 µCi/ (3H-OMG) 0,5 mM o 14C-L-ácido
láctico 0,1 µCi/L-ácido láctico 0,1 mM. La reacción fue detenida por adición de solución
stopper, seguido de 3 lavados con la misma solución. Luego de esto, a las células se
27
les adicionó 200 µl de tampón de lisis (TRIS-HCl 10 mM pH 8,0, SDS 0.2%), el lisado
celular se llevó a viales con 2 ml de líquido de centelleo biodegradable y éstos viales
fueron sometidos a un contador de centelleo líquido. Los ensayos de incorporación de
ácido ascórbico fueron realizados en presencia de DTT 0,1-1 mM y aquellos en los
cuales se observa el efecto de inhibición por ácido ascórbico se preincubaron las
células con ácido ascórbico durante 60 min a 37ºC (ácido ascórbico intracelular). Por
otra parte, aquellos ensayos en los cuales se utilizó inhibidor se preincubaron las
células con citocalasina B (inhibior del transportadores de glucosa) durante 15 minutos
previos al ensayo. Además las células que recibieron tratamiento con DOG no marcado
radiactivo, fueron preincubadas por 15 minutos a 37°C. Todos los ensayos utilizando
análogos radiactivos fueron desarrollados bajo el amparo de las medidas de
bioseguridad del “Manual de normas de Bioseguridad” de CONICYT de 2008. Los
residuos generados fueron almacenados en bodegas especiales para ello en
instalaciones del PAAC (Proyecto de Administración Ambiental Corporativo), de
acuerdo al Manual de Procedimiento para el Manejo de Residuos de la Universidad
Austral de Chile.
3.2.6 INMUNOFLUORESCENCIA EN CÉLULAS C6.
Las células fueron cultivadas sobre covers de vidrios esterilizados y tratados con
poli-L-lisina. Estas células fueron lavadas con PBS 0,1 M (pH 7,4; 320 mOsm) y fijadas
posteriormente con Histochoice. Se permeabilizaron las membranas celulares con una
solución de Tritón X-100 al 0,3% en PBS 0,1 M con el fin de facilitar el ingreso de los
anticuerpos. Luego se bloquearon las muestras con solución de bloqueo (BSA 1% en
28
PBS 0,1 M) por 1 hora a temperatura ambiente y se incubaron los diferentes
anticuerpos a sus diluciones correspondientes en una cámara húmeda a 4°C durante
toda la noche. Luego de ello, las preparaciones fueron lavadas para continuar con la
incubación del anticuerpo secundario, en este caso fueron ocupados anti-IgG de cabra
y anti-IgG de conejo conjugados con Alexa 488 en una dilución de 1:300 en solución de
bloqueo por 2 hrs a temperatura ambiente. Para las tinciones nucleares, se ocupó
ioduro de propidio o TOPRO-3 a una dilución de 1,7 µg/ml o 1:3000, respectivamente.
Se montaron los covers sobre un portaobjeto nuevo usando medio de montaje para
fluorescencia DAKO y las muestras fueron visualizadas en un microscopio confocal
invertido.
3.2.7 EXTRACCIÓN DE PROTEÍNAS TOTALES
Las células de cultivo fueron lavadas con PBS 0,1 M (pH 7,4 ; 320 mOsm) para
luego ser expuestas a una solución de tripsina-EDTA 0,25% a 37°C, con el fin de soltar
las células desde la placa de cultivo. La suspensión celular fue llevada a un tubo de
centrífuga de 15 ml estéril, siendo centrifugadas a 621 x g por 3 minutos, luego fueron
lavadas con PBS 0,1 M y se centrifugaron nuevamente para ser resuspendidas en
RIPA (sacarosa 300 mM, DTT 3 mM, EDTA 1 mM, pH 7,4) conteniendo un cóctel de
inhibidores de proteasas (AEBSF 1 mM, aprotinina 800 nM, bestatina 50 µM, E64 15
µM, leupeptina 20 µM, pepstatina A 10 µM, EDTA 5 mM). Luego, se transfirieron a un
tubo Eppendorf, donde fueron sonicadas 3 veces de manera suave por 10 segundos a
4°C hasta disgregar completamente. Los homogeneizados fueron centrifugados a
14000 x g por 10 minutos a 4°C, siendo recuperado el sobrenadante
para
29
posteriormente ser cuantificado mediante el método de Bradford. Estos extractos
proteicos fueron utilizados para realizar ensayos de Western Blot.
3.2.8 SEPARACIÓN ELECTROFORÉTICA DE PROTEÍNAS
Los extractos proteicos fueron separados electroforéticamente en un gel de
poliacrilamida al 10%. Los geles separadores y espaciadores fueron preparados en
base a una solución de bisacrilamida 30:0,8%. El gel separador se preparó con una
concentración de poliacrilamida de 10% conteniendo: Tris 375 mM (pH 8,8); SDS 0,1%,
persulfato de amonio 0,04% y TEMED 0,03%. Así mismo el gel espaciador se preparó
con una concentración final de 3,8% de poliacrilamida incluyendo Tris 125 mM (pH6,8);
SDS 0,1%, persulfato de amonio 0,01% y TEMED 0,04%. Se tomaron 50-80 µg de
proteínas a las cuales se les agregó tampón de carga 5X Winkler (Tris 100 mM, 2mercaptoetanol 2%, SDS 4%, glicerol 20%, azul de bromofenol 0,2%, pH 6,8%). Luego
de esto, las muestras se cargaron en el gel previamente preparado, realizándose la
electroforesis a 90 V por 2 horas en tampón de corrida (Tris 25 mM, glicina 190 mM,
SDS 0,1%, pH 8,3). Una vez finalizada la electroforesis las proteínas fueron transferidas
a una membrana de PVDF.
3.2.9 TRANSFERENCIA DE PROTEINAS A MEMBRANA PVDF
Las proteínas separadas electroforéticamente se transfirieron a una membrana
de PVDF (difluoruro de polivinildeno, 0,45 micrones de poro, 100-145 µm de espesor).
La membrana fue activada por un par de segundos en metanol, luego de esto se armó
el sistema de la siguiente manera: Sobre una esponja humedecida en tampón de
30
transferencia (Tris 25 mM, glicina 190 mM, SDS 0,1%, metanol 20%, pH 8,3) se colocó
un papel filtro (Whatman n°1), la membrana de PVDF activada, gel de poliacrilamida a
transferir, papel filtro y otra esponja empapada en tampón de trasferencia. Esto se
colocó en una cámara de electrotransferencia y se rellenó con tampón de transferencia.
La transferencia fue realizada a una intensidad de corriente constante de 380 V por 1
hora. Una vez finalizada la transferencia, la membrana se dejó secar a temperatura
ambiente.
3.2.10 ANÁLISIS DE WESTERN BLOT.
Las membranas de PVDF fueron incubadas con 10 ml de solución de bloqueo
(BSA 5%, Tween-20 0,3% en PBS 0,1 M, pH 7,4) por una hora a temperatura ambiente.
Posteriormente, se les incubó con el anticuerpo primario en dilución 1:1000 o 1:2000
según las indicaciones del fabricante en solución de bloqueo (BSA 1%, Tween-20 0,3%
en PBS 0,1 M, pH 7,4) por un periodo de tiempo de 10 a 12 horas en agitación
constante a temperatura ambiente. Luego, las membranas fueron lavadas 3 veces con
PBS-Tween (PBS 0,1 M, Tween-20 0,3%, pH 7,4) por periodos de 15 minutos para
luego ser incubadas con el anticuerpo secundario correspondiente (anti-IgG de conejo)
conjugado a peroxidasa a una dilución de 1:5000 en solución de bloqueo (BSA 1%,
Tween-20 0,3% en PBS 0,1 M, pH 7,4) por un periodo de tiempo de 2 horas. Después
de finalizado este paso, las membranas fueron lavadas 3 veces con PBS-Tween (PBS
0,1 M, Tween-20 0,3%, pH 7,4) durante 15 minutos cada lavado, adicionando un lavado
más con PBS 0,1 M. Para revelar dichas membranas, se ocupó un método de
quimioluminiscencia el cual consiste en una solución de luminol y una solución de
31
sustrato, peróxido. Se aplica 1 ml de cada solución sobre la membrana y luego de un
minuto se visualizaron las bandas utilizando un ULTRALUM.
Para realizar control de carga con β-actina para la normalización de datos de
expresión GLUT3 y GLUT1 se realizó una elución de la membrana de PVDF con una
solución de stripping (glicina 1,5%, SDS 0,1% , 1 ml de Tween-20, pH 2,2). Para ello se
realizaron 2 incubaciones con 20 ml de solución de stripping por 10 minutos cada uno, 2
lavados con 20 ml de PBS 1X por 10 minutos cada uno y dos lavados con PBS-Tween
0,3%, y luego las membranas fueron bloqueadas para continuar con el Western blot de
rutina para β-actina.
3.2.11 ENSAYOS DE CAPTACIÓN DE GLUCOSA FLUORESCENTE.
Las neuronas fueron sembradas previamente en cubreobjetos de 25 mm de
diámetro. Dichos cubreobjetos fueron montados en una cámara y se les agregó 400 μl
de tampón de incubación (Hepes 0,5 mM, NaCl 135 mM, KCl 5 mM, CaCl 2 1,8 mM,
MgCl2 0,8 mM, pH 7,4) para luego agregar 2-NBDG (2-[N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol4-il)amino]-2-desoxiglucosa) a concentración final 0,5 mM. La incorporación de 2-NBDG
fue registrada usando un microscopio confocal FLUOVIEW 1000. Este experimento fue
desarrollado de igual manera para neuronas nativas y neuronas tratadas con shRNA
para bloquear la expresión de GLUT3. Los datos fueron analizados con el software
Image J.
32
3.2.12 PREPARACIÓN DE REBANADAS ESTRIATALES.
Las rebanadas fueron obtenidos de ratones C57BL/6 de 1 a 2 meses de edad.
Las rebanadas de cerebro (350 μm de espesor) fueron cortados con un Vibratome
(Pelco 101, Series 000; Vibratome, St Louis, MO, USA) y fueron posteriormente
incubados durante 1 hr a 20ºC en CSF artificial (ACSF; NaCl 124 mM , KCl 2,69 mM,
KH2PO4 1,25 mM, MgSO4 2 mM, NaHCO3 26 mM, glucosa 10 mM y CaCl 2 2 mM, pH
7,3) a una concentración de gases correspondiente a 95% de O 2 y 5% CO2. Luego las
rebanadas fueron trasladados a una cámara de 2 mL fijada a un microscopio invertido
Olympus (Tokyo, Japan) BX50WI y perfundido continuamente a 1 ml/min en una
cámara de gas con ACSF a 30°C (Araque et al. 2002).
3.2.13 ANÁLISIS ELECTROFISIOLÓGICOS.
Un electrodo de estimulación monopolar fue colocado en el cuerpo calloso con el
fin de producir la estimulación de la vía cortico-estriatal. Los registros de las neuronas
del estriado fueron tomados de acuerdo a la técnica de patchclamp en modalidad célula
completa con voltage constante, conocido como voltage clamp. Las corrientes post
sinápticas excitatorias (EPSCs) fueron registradas utilizando pipetas de borosilicato con
una impedancia de 3-10 MΩ, manteniendo un potencial de -70mV. La solución interna
utilizada estaba compuesta por gluconato de potasio 131 mM, EGTA 1 mM, MgCl 2 1
mM, ATP-K2 2 mM, GTP-Na 0,3 mM, KCl 6 mM, NaCl 1 mM y HEPES 5 mM, pH 7,3;
290 Osm. Los estímulos se realizaron aplicando 10 pulsos de estímulo de 0,1-0,2 ms
cada 200 ms. Los registros fueron obtenidos con un amplificador Axoclamp 2A (Axon
Instruments, Foster City, CA, EE.UU.). El software PCLAMP 8 (Axon Instruments) fue
33
utilizado para la generación de estímulos, visualización de datos, adquisición y
almacenamiento (Araque et al. 2002). Las sustancias extracelulares fueron perfundidas
y las soluciones intracelulares fueron incorporadas en la pipeta con la cual se realizó el
registro.
3.3.14 ENSAYO DE VIABILIDAD CELULAR.
Se preparó una placa de 6 pocillos con cubreobjetos de 25 mm estériles
pretratados con poli-L-lisina. Se sembraron células en una cantidad de 1x10 5
células/cubreobjeto con el fin que la confluencia no fuera mayor que el 50%. Las células
fueron preincubadas con tampón de incubación a pH 7,4 de manera que el medio
intracelular y extracelular se equilibren. Posteriormente se aplicó tampón de incubación
a distintos pHs (5,4-9,4) durante 10 segundos, se retiró el tampón y se aplicó ioduro de
propidio en una concentración de 1,7 µg/ml. Finalmente, las células fueron observadas
en un microscopio de epifluorescencia.
34
4. RESULTADOS
4.1
ANÁLISIS
DE
LA
EXPRESIÓN
DE
TRANSPORTADORES
DE
MONOCARBOXILATO EN LÍNEA CELULAR C6.
Se realizaron cultivos celulares de la línea celular C6 que corresponde a un
glioma de rata. Esta línea celular es de fácil manejo y de crecimiento rápido
representando así un buen modelo para estudiar células de linaje astrocítico. En
particular, en nuestro trabajo el uso de esta línea celular es útil puesto que en nuestro
laboratorio se a demostrado que ellas expresan el transportador de glucosa neuronal
GLUT3 (Beltrán et al., 2011). Para desarrollar la caracterización del modelo ocupado en
este trabajo, identificamos la presencia de transportadores de monocarboxilato MCT1,
MCT2 y MCT4 mediante Western blot e inmunofluorescencia.
Mediante ensayos de Western blot se pesquisó la presencia de estas proteínas,
observando una marca positiva en una posición de la membrana que corresponde a un
tamaño relativo de 47 kDa tanto para MCT1 como para MCT2 y de 42 kDa para MCT4
(Figura 2 A). Por medio de inmunofluorescencia se confirmó la presencia de estos
transportadores y su localización celular, evidenciando que existe una abundante
reacción positiva para MCT1 a nivel de la membrana plasmática al igual que para
MCT2 , no así para MCT4 que se encuentra menos expresado pero de igual manera
también con localización aparente en la membrana plasmática (Figura 2 B).
35
Figura 2. Caracterización de la expresión de MCTs en células C6. (A) Western blot
de MCT1, MCT2 y MCT4 usando extractos de proteínas totales de células C6. Los
números a la derecha indican kDa. (B) Immunofluorescencia para MCT1, MCT2 y
MCT4. La barra de magnificación corresponde a 20 µm. Los núcleos fueron teñidos
con ioduro de propidio. Los paneles representan imágenes representativas de tres
experimentos.
36
4.2 ANÁLISIS DE LA FUNCIONALIDAD DE LOS TRANSPORTADORES DE
MONOCARBOXILATO, MCTS.
Se realizaron ensayos de transporte los cuales consisten en medir la
incorporación del radioisótopo ácido 14C-Láctico el cual sería transportado por MCTs. En
este caso, se midió el ingreso del radioisótopo en ausencia del sustrato en el espacio
intracelular (condiciones zero-trans). Las cinéticas de incorporación para lactato 0,1 mM
a 20°C, mostraron una incorporación lineal hasta los 10 segundos y aproximándose al
equilibrio desde los 30 segundos en adelante (Figuras 3 A y B). Adicionalmente, se
realizaron ensayos de saturación del transporte de lactato con el fin de determinar los
parámetros cinéticos (Figura 3 C). Según un análisis de Eadie-Hofstee, de los datos de
velocidad de transporte en función de las concentraciones de lctato, se observaron dos
componentes cinéticos. El primero mostró una velocidad máxima de 18,5 ± 2,4
pmoles/106 células x minuto y una Km aparente de
2,4 ± 1 mM probablemente
correspondiente a las actividades de MCT1 y MCT2. Mientras que el segundo
componente mostró una velocidad máxima aproximada de 110,4 ± 7 pmoles/10 6 células
x minuto y una Km aparente de 56 ± 2 mM atribuible a MCT4. Estos valores coinciden
con lo descrito previamente en la literatura (Juel y Halestrap, 1999; Broer et al, 1997,
Brauchi et al., 2005).
37
38
Figura 3. Evaluación del transporte de lactato en células de glioma de rata C6.
(A) Cinética de incorporación de
14
C-Lactato 0,1 mM realizados en células C6 a 10
segundos, 20ºC. A los datos obtenidos se ajustó un modelo de una curva exponencial
simple de dos parámetros (Panel A, R= 0,9573) y una recta (Panel B, R=0,9358). (C)
Los parámetros cinéticos fueron obtenidos a partir de la Gráfica de Eadie-Hofstee
observándose dos componentes cinéticos con contantes: Km 1 aparente 2,4 ± 1 mM,
Km2 aparente de 56 ± 2 mM, Vmax 118,5 ± 2,4 pmol/106 células x minuto y Vmax2 110,4
± 7 pmol/106 células x minuto. Las distintas poblaciones de puntos fueron ajustadas a
una recta (, R: 0,8204 y , R: 0,8004). Los datos corresponden a la media ± DS de 4
experimentos independientes.
39
4.3 ANÁLISIS DE LA EXPRESIÓN DE TRANSPORTADORES DE GLUCOSA Y
TRANSPORTADORES DE ÁCIDO ASCÓRBICO EN LÍNEA CELULAR C6.
Posteriormente se realizó un análisis de la expresión de los transportadores de
glucosa GLUT1 y GLUT3, además de los transportadores de ácido ascórbico SVCT1 y
SVCT2 en las células C6 mediante
Western blot e inmunofluorescencia utilizando
microscopía confocal.
Confirmamos la presencia de estos transportadores mediante análisis de
Western blot . Tal como observamos en la Figura 4 A, detectamos reacción positiva
para GLUT1 en una posición que corresponde a un tamaño de 48 kDa y para a GLUT3
un tamaño de 50 kDa para las proteínas. Así mismo para SVCT1 y SVCT2
encontramos reacción positiva en posiciones que corresponden a un tamaño de 60 kDa
para estas proteínas. A su vez analizamos la localización de las mismas proteínas
mediante inmunofluorescencia. En estos últimos observamos la presencia de estos
transportadores de glucosa y para los SVCTs, todos ellos ampliamente distribuidos a
nivel intracelular y de la membrana plasmática celular (Figura 4 B).
4.4 ANÁLISIS DE LA FUNCIONALIDAD DE LOS TRANSPORTADORES DE
HEXOSAS, GLUTs.
Para determinar la funcionalidad de los transportadores en estudio, se realizaron
ensayos de transporte con análogos radiactivos de glucosa. Para esto se utilizó
40
Figura 4. Caracterización de la expresión de transportadores de hexosas y
transportadores de ácido ascórbico. (A) Western blot correspondiente a GLUT1,
GLUT3 y SVCT1, SVCT2 a partir de extractos de proteínas totales de células C6. El
número de la derecha indica kDa. (B) Immunofluorescencia para GLUT1, GLUT3 y
SVCT1, SVCT2. La barra de magnificación corresponde a 20 µm. Los núcleos fueron
teñidos con ioduro de propidio. Los paneles muestran im ágenes representativas de
tres experimentos.
41
3
H-o-metilglucosa (OMG) que es un análogo de glucosa incorporado por GLUTs, pero
no metabolizable por la célula y 3H-desoxiglucosa (DOG), el cual es un análogo de
glucosa metabolizable que es transportado por los GLUTs
y
fosforilado por
hexoquinasa. Se midió la entrada del análogo radiactivo en ausencia del sustrato en el
espacio
intracelular
(condiciones
es
zero-trans).
Se
realizaron
cinéticas
de
incorporación para OMG 0,5 mM y DOG 0,5 mM a 20°C, mostrando una incorporación
lineal hasta los 20 segundos (Figura 5 B y D) y aproximándose a un equilibrio desde los
40 segundos en adelante (Figura 5 A y C).
4.5 ESTUDIO DEL EFECTO DE ÁCIDO ASCÓRBICO SOBRE EL TRANSPORTE DE
GLUCOSA EN CÉLULAS C6.
Según hallazgos publicados por nuestro laboratorio, ácido ascórbico intracelular
inhibe el transporte de DOG mediante un mecanismo que involucra al transportador de
glucosa neuronal GLUT3 (Beltrán et al., 2011). Por este motivo se estudió el efecto de
ácido ascórbico intracelular sobre la incorporación de DOG y de lactato en células C6
expresando o no GLUT3. El bloqueo de la expresión de GLUT3 se realizó utilizando un
shRNA específico. En las células tratadas con este shRNA se observó la disminución
de la incorporación de DOG basal (Figura 6 A) y el bloqueo fue comprobado mediante
análisis de RT-PCR, Western blot e inmunofluorescencia (Beltrán et al, 2011). De
acuerdo a lo observado en Figura 6 A, las células C6 carentes de GLUT3 incorporan un
45 % menos el análogo de glucosa. La incorporación de DOG residual se puede deber
a la expresión de GLUT1 y de otras isoformas de los GLUTs.
42
Figura 5. Análisis del transporte de análogos de glucosa en células de glioma de
rata C6. A, B. Cinética de incorporación para el transporte de 3H-o-metilglucosa 0,5 mM
(20°C). A los datos obtenidos se ajustó un modelo de una curva exponencial simple de
dos parámetros (Panel A, R: 0,9589) y a una recta (Panel B, R: 0,9467). C,D. Cinética
de incorporación para el transporte de 3H-desoxiglucosa 0,5 mM (20°C). A los datos
obtenidos se ajustó ajustó un modelo de una curva exponencial simple con de
parámetros (Panel C, R: 0,9715) y a una recta (Panel D, R: 0,9406). Los datos
corresponden a la media ± DS de 3 experimentos independientes.
43
44
Figura 6. Caracterización del transporte de DOG en células expresando o no
expresando GLUT3. A. Transporte de DOG 0,5 mM (15 segundos de captación a
20ºC) en células C6 tratadas o no tratadas con un shRNA específico para bloquear la
expresión de GLUT3 . Los datos corresponden la media ± DS de 3 experimentos. B.
Cinética
de
incorporación
de
2-[N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-il)amino]-2-
desoxiglucosa (2-NBDG) 0,5 mM en cultivos primarios de neuronas corticales de rata
tratados o no tratados un shRNA para bloquear la expresión de GLUT3. Los datos
corresponden a la media ± DS de 4 experimentos. Las fotografías corresponden a
imágenes representativas de un experimento en células nativas (arriba) y células
tratadas con shRNA-GLUT3 (abajo), tomadas a tiempo 0, 200, 400 y 600 segundos.
45
Puesto que las neuronas expresan preferentemente GLUT3, adicionalmente, se
determinó la captación de un análogo de glucosa fluorescente, 2-NBDG
nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino]-2-desoxiglucosa)
en
cultivos
(2- [N-(7-
primarios
de
neuronas corticales tratadas con el mismo shRNA. En las células controles la captación
de 2-NBDG mostró tener un comportamiento bifásico, con una rápida fase lineal inicial
de aproximadamente 66 segundos (Figura 6 B). Este mismo comportamiento bifásico
se observó en los cultivos tratados con shRNA para bloquear la expresión de GLUT3.
Ya que 2-NBDG es un análogo de glucosa similar a DOG, es decir, es transportado por
los GLUTs y fosforilado por hexoquinasa, nosotros razonamos que el primer
componente (más rápido) correspondería a la translocación del análogo, mientras que
el componente más lento correspondería a la tasa de fosforilación.
La tasa de
captación de 2-NBDG para las neuronas tratadas con shRNA fue 17,8 veces más baja
que la tasa de captación para las neuronas nativas lo que confirma el eficiente bloqueo
de la expresión de GLUT3 (Figura 6 B).
El ácido ascórbico es capaz de inhibir la incorporación de DOG en cultivos
primarios de neuronas corticales e hipocampales (Castro et al., 2007, Beltrán et al.,
2011) y en HEK293 (Castro et al., 2008), no así en cultivo primario de astrocitos (Castro
et al., 2007, Beltrán et al., 2011). En base a estos antecedentes, realizamos ensayos de
incorporación de DOG 0,5 mM en presencia de ácido ascórbico en células que
expresan o no el transportador GLUT3. Las células fueron incubadas por 1 hr con
distintas concentraciones de ácido ascórbico y luego se midió la incorporación de DOG
46
Figura 7. Efecto del ácido ascórbico intracelular sobre el transporte de DOG y de
lactato en células C6 expresando o no expresando GLUT3. A. Gráfica semilogarítmica de la dependencia de la concentración de ácido ascórbico sobre el
transporte de DOG 0,5 mM a 20ºC (15 segundos de captación) en células C6 tratadas o
no tratadas con shRNA para bloquear la expresión de GLUT3. B. Incorporación de
lactato 0,1 mM a 20ºC (10 segundos de captación) en células C6 nativas y tratadas con
shRNA para bloquear la expresión de GLUT3 en presencia de ácido ascórbico
intracelular.
47
0,5 mM a 20ºC por 15 segundos. Como se observa en la Figura 7 A, en células C6
nativas en presencia de ácido ascórbico intracelular a niveles de 30 µM existe una
inhibición del transporte de DOG que alcanza el 50% a 1mM de ácido ascórbico con
respecto a la captación basal. En cambio, en células tratadas con shGLUT3 no se
evidencia ningún efecto inhibitorio en el transporte de DOG a estos niveles de ácido
ascórbico.
Teniendo en consideración que según datos de nuestro laboratorio altos niveles
de ácido ascórbico intracelular son capaces de estimular el transporte de lactato en
cultivos primarios de neuronas y en células HEK293 y que estas células expresan
endógenamente GLUT3, estudiamos el efecto del ácido ascórbico intracelular sobre el
transporte de lactato en las células C6. Para ello, medimos el transporte de
14
C-lactato a
20ºC durante 10 segundos en células que fueron previamente cargadas con distintas
concentraciones de ácido ascórbico durante 1 hora. Un alto nivel de ácido ascórbico
intracelular fue capaz de estimular el transporte de lactato en aproximadamente un 35%
solo en células nativas, es decir, que expresan GLUT3 (Figura 7B). Puesto que un alto
nivel de ácido ascórbico no produce ningún efecto sobre aquellas células que carecen
de GLUT3, es posible especular la existencia de un vínculo directo entre la presencia
de este transportador y la estimulación que produce el ácido ascóbico sobre la
incorporación de lactato.
48
4.6 EFECTO DE LA INHIBICIÓN DEL TRANSPORTE Y DE LA FOSFORILACIÓN DE
GLUCOSA SOBRE LA ACTIVIDAD DE TRANSPORTADORES DE HEXOSAS Y DE
MONOCARBOXILATO.
Según los resultados expuestos anteriormente y hallazgos de nuestro laboratorio
(Beltrán et al., 2011; Castro et al., 2008), un alto nivel de ácido ascórbico intracelular es
capaz de inhibir el transporte de DOG en células que expresan el transportador de
glucosa GLUT3. En forma reciproca, ácido ascórbico intracelular solo es capaz de
estimular el transporte de lactato en células que expresan GLUT3 (Castro et al., 2008,
Figura 6).
Por tanto, es posible especular que la estimulación del transporte de lactato es
una consecuencia de la inhibición del transporte de glucosa. Con el fin de testear el
enunciado anterior y a modo de determinar si el efecto de ácido ascórbico sobre el
transporte de lactato es especÍfico, diseñamos dos tipos de experimentos. En primer
lugar, utilizamos un inhibidor clásico de los transportadores de glucosa, citocalasina B
(Bloch, 1973; Colville et al., 1973; Basketter y Widdas, 1978), el cual comprobamos es
capaz de inhibir el transporte de DOG en células C6 (Figura 8 C). En segundo lugar,
utilizamos un exceso de DOG no radiactiva a modo de saturar la enzima hexoquinasa y
con ello, inhibir el metabolismo de glucosa. Puesto que la DOG no radiactiva compite
con la DOG marcada en los ensayos de captación, observamos adicionalmente una
inhibición del transporte de DOG radiactiva en células C6 (Figura 8 A). Posteriormente,
analizamos el transporte de lactato en presencia de los inhibidores del transporte
49
(citocalasina B) y del metabolismo (exceso de DOG no marcada) en células C6 y
observamos que citocalasina B no afecta el transporte de lactato (Figura 9 C) a
concentraciones que si observamos inhibición del transporte de DOG. En cambio, en
experimentos donde las células fueron pre incubadas durante 15 minutos con DOG no
marcado de modo de provocar la inhibición del metabolismo de glucosa, observamos
un aumento del transporte de lactato de aproximadamente 160% por sobre el control
cuando se usaron concentraciones de DOG 200 mM (Figura 9 A, DOG/lac). En
experimentos donde las células fueron incubadas simultáneamente con DOG y lactato
(10 segundos, 20°C) no se observó estimulación del transporte de lactato (Figura 9 A,
lac/DOG).
Adicionalmente, se realizaron estos mismos experimentos en células C6 tratadas
con shRNA para bloquear la expresión de GLUT3. En el caso de los experimentos en lo
cuales intentamos bloquear el transporte de glucosa utilizando citocalasina B, no
observamos efecto sobre el transporte de lactato (Figura 9 D). Sin embargo, estos
datos no nos entregan mucha información puesto que a las concentraciones de
citocalasina B utilizadas fue imposible inhibir el transporte de glucosa en las células C6
que no expresan GLUT3 (Figura 8 D). Por otra parte, en los experimentos donde se
inhibió el metabolismo y transporte de glucosa utilizando un exceso de DOG no
marcada, observamos la misma tendencia que en las células C6 nativas, pero no
estadísticamente significativa. Es decir, una inhibición del metabolismo de glucosa por
saturación de la enzima de hexoquinasa provoca la disminución del transporte de
50
51
Figura 8. Efecto de la inhibición de los GLUTs y de la inhibición del metabolismo
de glucosa sobre la incorporación de DOG en células C6 expresando o no GLUT3.
Transporte de DOG 0,5 mM (15 segundos de captación a 20ºC) en presencia de DOG
en rangos de concentraciones de 0 a 100 mM, en células C6 nativas (A) y células
tratadas con shRNA para bloquear la expresión de GLUT3 (B). Transporte de DOG 0,5
mM (15 segundos de captación a 20ºC) en presencia de citocalasina B en rangos de
concentración de 0 a 50 µM en células C6 nativas (C) y células tratadas con shRNA
para bloquear la expresión de GLUT3 (D). Los datos corresponden a la media ± DS de
4 experimentos independientes *p < 0,05; **p<0,01; ****p<0,0001.
.
52
53
Figura 9. Efecto de la inhibición de los GLUTs y de la inhibición del metabolismo
de glucosa sobre la incorporación de lactato en células C6 expresando o no
GLUT3. Transporte de lactato 0,1 mM (10 segundos de captación a 20ºC) en células
tratadas previamente con DOG (pre incubación de 15 muntos a 37ºC) en rangos de
concentraciones de 0 a 200 mM, en células C6 nativas (A, DOG/lac) y células C6 que
no expresan GLUT3 (B, DOG/lac). Transporte de lactato 0,1 mM (10 segundos de
captación a 20ºC) en células tratadas simultáneamente con DOG en rangos de
concentraciones de 0 a 200 mM, en células C6 nativas (A, lac/DOG y células C6 que no
expresan GLUT3 (B, lac/DOG). Transporte de lactato 0,1 mM (10 segundos de
captación a 20ºC) en presencia de citocalasina B en rangos de concentración de 0 a 50
µM en células C6 nativas (C) y células shGLUT3 (D). Las células fueron tratadas con
las concentraciones de citocalasina B indicadas durante 15 minutos previo al ensayo de
captación. Los datos corresponden a la media ± DS de 4(A), 3 (B,C) y 5 (D)
experimentos independientes *p<0,05; ***p<0,001;****p<0,0001. Lac: lactato
54
glucosa y la estimulación del transporte de lactato en células que expresan y que no
expresan GLUT3.
4.7 EFECTO DEL pH EXTRACELULAR SOBRE EL TRANSPORTE DE DOG Y
LACTATO EN CÉLULAS C6.
Los transportadores de lactato corresponden a una familia de transportadores
capaces de translocar monocarboxilatos (lactato, piruvato, β-hidroxibutirato) a través de
la membrana plasmáticas manejados por la gradiente de protones (Juel y Halestrap,
1999). Aprovechando esta característica, se realizó un ensayo de transporte variando el
pH del tampón de incubación con el cual se preparan las soluciones para realizar el
ensayo. Según los resultados mostrados en la Figura 9, la inhibición del consumo de
glucosa es capaz de estimular el transporte. Para saber si este efecto es específico,
diseñamos un experimento en el cual activamos el transporte de lactato para verificar si
se afecta el consumo de glucosa. Como se observa en la Figura 10 A existe
efectivamente una activación del transporte de lactato mediado por MCTs a
concentraciones altas de protones, lo cual se manifiesta por un aumento del trasporte
de lactato de un 30% respecto al control, que corresponde al ensayo realizado a pH
fisiológico. Para la incorporación del análogo de glucosa DOG, realizado bajo las
mismas condiciones habituales (DOG 0,5 mM a 20ºC por 15 segundos) observamos
que la incorporación de DOG no inhibida, por la estimulación del transporte de lactato
(Figura 11). Además, se realizó un ensayo de viabilidad celular, en
55
Figura 10. Efecto del pH sobre la incorporación de lactato en células C6 nativas.
A. Ensayo de incorporación de lactato 0,1 mM (10 segundos de captación a 20ºC) en
presencia de distintas concentraciones de protones en el espacio extracelular.
Los
datos corresponden a la media ± DS de 5 experimentos independientes. B. Ensayo de
viabilidad con yoduro de propidio 1,7 µg/ml a los distintos pHs trabajados. Los paneles
corresponden a fotos representativas de 3 experimentos independientes ****p<0,0001.
56
Figura 11. Efecto del pH sobre la incorporación de DOG en células C6 nativas.
Ensayo de transporte de DOG 0,5 mM (15 segundos de captación a 20ºC) En presencia
de distintas concentraciones de protones en el espacio extracelular. Los d atos
corresponden a la media ± DS de 8 experimentos independientes *p<0,05.
57
el cual las células fueron tratadas con ioduro de propidio y tal como se observa en la
Figura 10 B, no se produce muerte celular a los diferentes pHs trabajados, por ende
efectivamente logramos estimular el transporte de lactato, no afectando así la viabilidad
celular.
4.8 EXPLORANDO EL MECANISMO DEL EFECTO DE ÁCIDO ASCÓRBICO:
EFECTO DE GLUTATIÓN SOBRE LA INCORPORACION DE DOG Y LACTATO EN
CÉLULAS C6.
De acuerdo a las características del ácido ascórbico, se sabe que éste posee un
gran poder antioxidante. En consideración de lo anterior quisimos explorar de qué
manera el ácido ascórbico intracelular está ejerciendo su efecto inhibitorio sobre la
incorporación de glucosa en células que poseen GLUT3, y para ello hicimos un ensayo
de transporte en células C6 con y sin GLUT3 en presencia de glutatión intracelular en
su forma reducida (GSH). Las células fueron incubadas por un periodo de 15 minutos a
distintas concentraciones de glutatión que oscilan entre 0 y 100 mM como fue descrito
por Patel, 2001. Luego de esto se les realizó un ensayo de incorporación de DOG a
temperatura ambiente (15 segundos de captación). El transporte de DOG se ve
significativamente afectado por GSH en las células C6 nativas, observándose una
disminución de aproximadamente un 40% respecto al control (Figura 12 A) y en las
células C6 tratadas con shRNA para bloquear la expresión de GLUT3 se observa que
solo ocurre a altas concentraciones de GSH (Figura 12 B).
58
Figura 12. Efecto glutatión sobre la incorporación de DOG en células C6 nativas y
tratadas con shRNA para bloquear la expresión de GLUT3. A. Ensayo de transporte
de DOG 0,5 mM (15 segundos de incorporación, 20ºC) en células C6 nativas tratadas
previamente con GSH a distintas concentraciones. B. Ensayo de transporte realizado
en las mismas condiciones en células C6 shRNA para bloquear la expresión de GLUT3.
Los datos corresponden a la media
*p<0,05;**p<0,01;****p<0,0001.
± DS de 3 experimentos independientes
59
4.9 EXPLORANDO EL MECANISMO DEL EFECTO DE ÁCIDO ASCÓRBICO:
EFECTO DE FOSFOASCORBATO SOBRE LA INCORPORACIÓN DE GLUCOSA EN
REBANADAS DE ESTRIADO.
De acuerdo a los resultados mostrados para glutatión, estos nos parecen indicar
que el efecto de ácido ascórbico sobre la incorporación de glucosa es mediado por su
capacidad antioxidante. Con el fin de seguir explorando esta idea, tomamos como base
experimentos electrofisiológicos realizados anteriormente en nuestro laboratorio como
se observa en la Figura 13, realizados en rebanadas de hipocampo de rata. En estos
experimentos se estimuló la colateral de Schaeffer, la cual es una aferente
glutamatérgica y se registró el componente postsináptico, neuronas piramidales de la
región de CA1 . Cuando estas rebanadas son sometidas a periodos de privación de
glucosa, se observa un decaimiento en la amplitud de las corrientes post sinápticas
excitatorias (EPSCs) registradas, las cuales se recuperan rápidamente al restituir la
glucosa en el medio de perfusión. Sin embargo, cuando las células son tratadas en
presencia de 200 µM de 4-CIN, concentración a la cual se inhibe MCT2 y por tanto se
inhibe la incorporación de lactato en las neuronas, no se observa dicha recuperación.
Esto se explica puesto que, como fue descrito en la introducción de esta tesis, las
células neuronales consumen lactato preferentemente durante periodos de activación
sináptica. Si no pueden usar este monocarboxilato, entonces carecen de una fuente
energética para sustentar dicha actividad aún cuando exista glucosa en el medio
60
Extraído de Castro et al., 2009
61
Figura 13. Efecto del ácido ascórbico intracelular en la restauración de la
recuperación de la glucosa después de la privación de glucosa en la presencia de
4 CIN. A, B, C. Izquierda: Representación esquemática de cada ensayo. Gráficos:
Gráfica en función del tiempo de la amplitud de las EPSCs. A la derecha de cada
gráfica se muestran trazos representativos de las EPSCs obtenidas. Barra de
calibración: 100 pA, 20 ms. Derecha: Esquema representativo de interacción neuronaglia. Extraído de Castro et al., 2009, J Neurochem, 110: 423–440.
62
(Figura 13 A). De esto último se desprende que el consumo de glucosa neuronal se
encuentra inhibido durante actividad sináptica. De hecho, nuestro laboratorio ha
demostrado en forma consistente, que efectivamente esto sucede debido a que las
neuronas incorporan ácido ascórbico durante estos episodios y el ácido ascorbico
intracelular inhibe el consumo de glucosa (Castro et al., 2007, Castro et al., 2009,
Beltrán et al., 2011). De hecho, cuando se repite el experimento en presencia de 4 CIN,
pero ahora incorporando un anticuerpo anti-SVCT2, el cual bloquea el transportador de
ácido ascórbico con la consecuente inhibición de la incorporación de este antioxidante,
se observa una robusta recuperación de la actividad sináptica luego del periodo de
privación (Figura 13 B). Esto último, se ve revertido al incorporar adicionalmente ácido
ascórbico directamente en la pipeta de registro (Figura 13 C). Valiéndonos de este
modelo de estudio, realizamos experimentos del mismo tipo para determinar si
fosfoascorbato, un análogo de ácido ascórbico que carece de poder antioxidante, es
capaz de inhibir el consumo de glucosa. Utilizamos rebanadas estriatales de ratones de
1-2 meses de edad en los cuales se posicionó un electrodo de estimulación en el
cuerpo calloso con el fin de estimular la vía glutamatérgica cortico-estriatal (Figura 14
A). Las respuestas obtenidas con los tratamientos con 4 CIN y con 4 CIN y anti-SVCT2
fueron las mismas que lo observado en hipocampo (Castro et al., resultados no
publicados), es decir, en presencia de 4 CIN no se oberva recuperación y en presencia
de 4 CIN y anti-SVCT2 si se observa recuperación posterior al periodo de privación de
glucosa. En experimentos donde adicionalmente se agregó ácido ascórbico en la pipeta
de registro (intracelular) se observa que la actividad sináptica no se recupera (Figura 14
B superior y Figura 14 C). Esto se explica puesto que ácido
63
64
Figura 14. Fosfoascorbato, al igual que ácido ascórbico, sería capaz de inhibir el
consumo de glucosa en neuronas bajo actividad sináptica glutamatérgica.
A.
Esquema representativo de los cambios en la amplitud de las EPSCs en relación al
tiempo
en presencia de 4CIN, anti-SVCT2 y ácido ascórbico (superior) o
fosfoascorbato (inferior). Los trazos a la derecha de las gráficas muestran las EPSCs
del mismo experimento graficado. Barra de calibración: 100 pA, 20 ms. Derecha:
Esquema representativo de interacción neurona-glía en las dos condiciones trabajadas.
C. Gráfico del porcentaje de recuperación posterior al periodo de privación
(correspondiente al promedio de las amplitudes de las EPSCs registradas los primeros
5 minutos posterior al restituir glucosa en el medio). Los datos en C corresponden a la
media ± DS de 3 experimentos independientes. Cx: corteza, St: estriado, CC: cuerpo
calloso, AA: ácido ascórbico, AA-P: fosfoascorbato.
ascórbico inhibe la incorporación de glucosa, y por tanto, la neurona no cuenta con
sustratos metabólicos disponibles para sustentar su actividad sináptica (el experimento
65
es realizado en presencia de 4CIN y por tanto, la incorporación de monocarboxilatos
también se encuentra inhibida). La misma tendencia fue observada en experimentos en
los cuales se utilizó fosfoascorbato intracelular, lo que indicaría que fosfoascorbato es
capaz de inhibir la incorporación de glucosa en células neuronales (Figura 14 B inferior
y Figura 14 C).
66
5. DISCUSIÓN
El metabolismo energético del sistema nervioso central, fue uno de los primeros
aspectos abordados en la bioquímica cerebral, desde entonces se ha avanzado
enormemente evolucionando sobre los conocimientos básicos y aportando ideas del
acoplamiento metabólico en distintos tipos celulares del cerebro. Desde hace más de
una década, ha tomado fuerza la hipótesis de la lanzadera de lactato astrocito-neurona
propuesta por Maggistretti y colaboradores (1999). Según ésta, el metabolismo de las
células neuronales sería suplido por diferentes sustratos metabólicos dependiendo de si
se encuentran bajo periodos de actividad sináptica o de reposo. En este contexto,
varios grupos de investigación, incluído nuestro laboratorio, han trabajado describiendo
mayores detalles de esta idea. Según datos de nuestro grupo, el acoplamiento
metabólico dado entre astrocitos y neuronas estaría estrechamente regulado por ácido
ascórbico (Castro et al., 2009). Ácido ascórbico intracelular actuaría como una especie
de switch metabólico, inhibiendo la captación de glucosa (Castro et al., 2007) y
promoviendo de igual manera el transporte de lactato (Castro et al., 2008). Este efecto,
sucede en células neuronales y es reproducible en otros tipos celulares que expresen el
transportador de glucosa neuronal, GLUT3 (Beltrán et al., 2011). El trabajo presentado
aquí estuvo enfocado a determinar si la estimulación de la incorporación de lactato
mediada por ácido ascórbico es consecuencia de la inhibición de la captación de
glucosa.
67
5.1
Las
células
C6
expresan
transportadores
de
monocarboxilato,
transportadores de glucosa y transportadores de ácido ascórbico funcionales.
En situaciones particulares, otros sustratos metabólicos, diferentes a la glucosa,
pueden ser utilizados por el cerebro. Estos sustratos corresponden a ácidos
carboxílicos tales como lactato, piruvato y cuerpos cetónicos. Cuando los niveles de
estos últimos se ven aumentados en la sangre, las células de la barrera hematoencefálica incrementan la expresión de transportadores de monocarboxilatos (MCT)
(Hasselbalch et al., 1995). De acuerdo a la distribución observada en el cerebro adulto
MCT1 es expresado preferentemente en astrocitos (Vannucci y Simpson 2003). MCT2
se encuentra mayoritariamente en neuronas y su expresión incrementa con la
maduración neuronal y en la sinaptogénesis (Bergersen et al., 2005). También MCT4
ha sido descrito en tanicitos y en
astrocitos de diversas áreas cerebrales, donde
funcionaría principalmente en la liberación de lactato al espacio extracelular (CortezCampos et al., 2011; Pellerin, 2005 ; Bergersen, 2007).
Se sabe que quienes estarían jugando un rol de soporte del metabolismo
energético cerebral bajo actividad sináptica son los astrocitos, considerando además
que serían cruciales en la regulación de este mismo, participando en la generación y
exportación de monocarboxilatos para satisfacer demandas neuronales en periodos de
actividad. De acuerdo a esto, fue imprescindible realizar la caracterización de nuestro
Western blot e inmunofluorescencia
modelo celular. Llevando a cabo técnicas de
pudimos determinar la presencia de transportadores de monocarboxilato, MCT1, MCT2
y MCT4, con distribución aparente en la membrana plasmática y citosólica. Luego,
68
mediante ensayos de incorporación del radioisótopo
14
C-lactato pudimos verificar que
estos transportadores de monocarboxilato eran funcionales. Se observó la presencia de
dos componentes cinéticos, obteniéndose datos correspondientes a una Km aparente
de 2,4 ± 1 mM y a otra Km aparente de 56 ± 2 mM. La Km aparente más baja debe
representar las actividades de MCT1-MCT2, ya que según lo descrito en la literatura,
estos transportadores presentan valores de Kms muy similares (Juel, 1999, Broer,
1997). Mientras que la Km de mayor valor debe corresponder a la actividad de MCT4,
la cual presenta una afinidad notablemente menor por lactato que las isoformas 1 y 2
(Juel y Halestrap, 1999). Según este razonamiento, las velocidades máximas para
MCT1-MCT2 y MCT4 corresponderían a 18,5 ± 2,4 pmol/10 6 células x min y 110,4 ± 7
pmol/106 células x min, respectivamente.
Realizamos la misma dinámica de trabajo para analizar la expresión de los
transportadores de glucosa GLUT1 y GLUT3 mediante análisis de Western blot e
inmunofluorescencia en células C6, pudiendo observar la presencia de ambos
transportadores, corroborando lo descrito previamente en la literatura (Sánchez-Álvarez
et al., 2005). Con el fin de estudiar las características funcionales de estos
transportadores se realizaron ensayos de incorporación, basados en el uso de
radioisótopos, utilizando dos análogos de glucosa: DOG y OMG. DOG es incorporado la
célula por los GLUTs y sirve de sustrato para hexoquinasa, mientras que OMG solo es
transportado, y no es metabolizado.
69
Adicionalmente, trabajamos con una línea celular estable C6 tratada con shRNA
para bloquear la expresión de GLUT3 (C6 shGLUT3). Se evaluó la incorporación de
DOG 0,5 mM en células C6 nativas y células C6-GLUT3(-), observando que
efectivamente existe una disminución en la incorporación de DOG en células tratadas
con shRNA. Estos ensayos fueron corroborados mediante análisis de Western blot, RTPCR e inmunofluorescencia (Beltrán et al., 2011), confirmando que existe una
disminución en la cantidad normal del transportador de glucosa GLUT3 en la línea
celular estable creada en el laboratorio. Como control positivo del bloqueo de la
expresión de GLUT3, usamos cultivos primarios de neuronas corticales de rata y
medimos la incorporación de una análogo fluorescente de glucosa, 2-NBDG. En
neuronas nativas, observamos un comportamiento bifásico, con una fase lineal inicial
rápida hasta aproximadamente 66 segundos y una segunda fase lineal más lenta con
una velocidad constante. Debido a que el 2-NBDG es fosforilado por hexoquinasa
(O'Neil et al., 2005), creemos que el primer componente observado correspondería a la
incorporación de 2-NBDG y el segundo componente correspondería a la fosforilación de
2-NBDG (Beltrán et al, 2011). En neuronas tratadas con el shRNA, observamos una
disminución en la tasa de transporte (fase inicial) de aproximadamente 17,8 veces con
respecto al control.
Finalmente, se corroboró la presencia de transportadores de ácido ascórbico,
SVCT1 y SVCT2 en nuestro modelo de trabajo. La expresión de estos transportadores
fue confirmada mediante ensayos funcionales basados en el uso de radioisótopos
(resultados del laboratorio no mostrados).
70
Por lo tanto, el modelo de trabajo propuesto resultó ser válido para la realización
de los estudios acerca del efecto del ácido ascórbico, sobre el transporte y fosforilación
de DOG, y transporte de lactato en presencia y ausencia de GLUT3.
5.2 El ácido ascórbico intracelular inhibe el transporte de DOG y estimula el
transporte de lactato solo en células que expresan GLUT3.
Como sabemos el cerebro es un buen reservorio de ácido ascórbico (Rose y
Bode 1993; Kratzing et al., 1982) y su concentración extracelular varía de acuerdo a la
actividad cerebral (O`Neill et al., 1984; Yusa, 2001). El glutamato es capaz de estimular
el eflujo de ácido ascórbico desde los astrocitos (Wilson et al., 2000; Portugal et al.,
2009), el cual puede ser incorporado por las neuronas gracias a la expresión del
transportador SVCT2. Como hemos visto en nuestro laboratorio, bajo actividad
sináptica glutamatérgica, el ácido ascórbico incorporado por las células neuronales es
capaz de inhibir la utilización de glucosa (Castro et al., 2007) y estimular la
incorporación de lactato (Castro et al., 2008).
El efecto inhibitorio/estimulatorio de ácido ascórbico es reproducible en células
que expresan GLUT3, ya sea en forma endógena o exógena (Castro et al., 2008,
Beltrán et al., 2011). Esta idea fue confirmada en los experimentos realizados en esta
tesis. En células C6 nativa, se observó un efecto inhibitorio en la incorporación de DOG
71
0,5 mM al incubar las células previamente con ácido ascórbico, no así en células que
no expresaban GLUT3. Además, corroborando los datos publicados por Castro y
colaboradores (2008), cuando se realizaron ensayos de incorporación utilizando OMG
0,5 mM en presencia de ácido ascórbico, no se observó el efecto inhibitorio por parte de
ácido ascórbico intracelular, dando a entender que el proceso de fosforilación de
glucosa/desoxiglucosa es un elemento clave en el blanco inhibitorio de ácido ascórbico.
Sin embargo, el efecto inhibitorio sobre el transporte de DOG es abolido cuando las
células son tratadas con shRNA para bloquear la expresión de GLUT3, indicando que
este transportador también sería una pieza clave en el blanco de acción de ácido
ascórbico (Beltrán et al., 2011).
Por otro lado, observamos que la inhibición de DOG produce una estimulación en
el transporte de lactato en células C6 nativas, no así en células C6 que no expresan
GLUT3. Esto último sustenta fuertemente nuestra hipótesis, indicando que el blanco de
acción de ácido ascórbico sería la inhibición del transporte de glucosa y que el efecto
estimulatorio observado sobre el transporte de lactato sería probablemente sólo una
consecuencia de lo anterior.
5.3 La captación de DOG y lactato se ve afectada por un análogo metabolizable de
glucosa, no así por citocalasina B.
72
En consideración a los antecedentes anteriores, diseñamos dos estrategias
experimentales para evaluar si la estimulación del transporte de lactato era provocada
por la inhibición del transportador GLUT3, o por el transporte y fosforilación de glucosa.
Para ello, utilizamos citocalasina B, un clásico inhibidor de los transportadores de
glucosa (Bloch, 1973) y para inhibir el transporte y fosforilación de glucosa usamos un
exceso de DOG no radiactivo. Esto último fue corroborado en ensayos cinéticos usando
DOG marcada. Observamos que en células C6 expresando GLUT3 endógeno y células
C6 carentes de GLUT3, existe un efecto inhibitorio en la incorporación de DOG
marcada, de manera dosis-dependiente con respecto a la concentración de DOG no
marcada. Esto se debería a que en presencia de grandes concentraciones de sustrato,
la enzima hexoquinasa se inhibe por competencia de sus sustratos, inhibiendo a su vez
la glicólisis y aumentando la concentración de glucosa (o DOG) sin fosforilar y por tanto
(ya que los GLUTs son transportadores facilitativos) inhibiendo el transporte de DOG.
Adicionalmente, no se puede descartar que DOG no marcada compita directamente con
el sustrato por el sitio de unión en el transportador, provocando una inhibición del tipo
competitivo.
En los ensayos usando citocalasina B, un inhibidor específico de GLUTs a
distintas concentraciones, no fuimos capaces de inhibir los transportadores de glucosa
en ambos tipos celulares. La Ki para GLUT1 es 2,4 mM y para GLUT3 1,6 ± 0,4 mM
(Lachaal et al, 1996; Colville et al., 1993). Por lo tanto, a las concentraciones trabajadas
deberíamos estar inhibiendo ambas isoformas de los transportadores de glucosa. En
73
las células tratadas con el shRNA para bloquear la expresión de GLUT3, es posible que
se produzca un upregulation de la expresión de otras isoformas insensibles a
citocalasina B.
Con respecto al efecto de la inhibición de transporte y de la fosforilación de
glucosa sobre el transporte de lactato, observamos que la incorporación de lactato fue
estimulada en células C6 solo cuando las células fueron tratadas previamente con un
exceso de DOG no marcada, observándose un aumento del transporte de lactato de un
160% aproximadamente (DOG 200 mM) mientras que en las células C6 que no
expresaban GLUT3 este aumento fue más modesto, pero estadísticamente no
significativo. Por lo tanto, la inhibición inespecífica del transporte y de la fosforilación de
glucosa produce como consecuencia la estimulación del transporte de lactato solo en
células que expresan GLUT3. En cambio, la sola inhibición del transporte de glucosa
mediada por GLUT3 no fue capaz de estimular el transporte de lactato.
5.4 El aumento de la concentración de protones extracelular, logra estimular el
transporte de lactato sin modificar la incorporación de glucosa.
74
Con la idea de probar, si la estimulación del transporte de lactato causada por la
inhibición del transporte y fosforilación de glucosa era más bien un evento que seguía
una cierta secuencia y especificidad, desarrollamos una estrategia para estimular el
transporte de lactato y ver si esto afectaba a su vez, al transporte de glucosa. Ya que el
transporte que realizan los MCTs es un cotransporte a favor de gradiente
electroquímica de protones, esto quiere decir que si aumenta la concentración de
protones en el medio extracelular se generaría una mayor gradiente y de esta manera
se ve favorecido el transporte de lactato. Considerando esto, nosotros estimulamos la
incorporación de lactato variando el pH del tampón de incubación con el cual se
desarrollaron los experimentos y efectivamente observamos que existe una mayor
incorporación de lactato a mayores concentraciones de protones. Sin embargo, el
transporte de DOG no se vió disminuido en presencia de una alta concentración de
protones, lo que corrobora nuestra idea de que la estimulación del transporte de lactato
es una consecuencia de la inhibición de la utilización de glucosa y no en sentido
contrario.
El transporte de DOG fue estimulado por la concentración de protones. Esto
puede deberse a la protonación de algunos residuos importantes en el ciclo de catálisis.
Como se ha demostrado por Ormazabal et al., 2010, existen residuos aminoacídicos
sensibles al pH que son críticos en la funcionalidad de SVCT2. Mediante mutagénesis
sitio dirigida observaron que la sensibilidad del transportador de ácido ascórbico se veía
75
modificada por variación en la Km y Vmax que producía el mutar un residuo de histidina
específico y así mismo observaron que al mutar otro residuo de histidina, alteraba la
sensibilidad al pH, cooperatividad con el sodio. Si bien, los transportadores de glucosa
GLUTs, son del tipo facilitativo, es posible suponer que efectivamente, lo que
observamos nosotros al variar el pH del tampón estemos alterando ya sea la afinidad
del transportador, reflejado en la Km, o el ciclo de catálisis, reflejado en la Vmax, por
protonación/desprotonación de alguno de sus residuos expuestos a la cara exofacial.
Hemos visto en los controles de viabilidad celular que hemos desarrollado, que a
las distintas concentraciones de protones en las cuales hemos trabajado las células, no
hemos visto cambios significativos en la viabilidad celular, eso nos da a entender que
los ensayos de transporte realizados a distintos pHs, efectivamente logran sólo
estimular el transporte de lactato, sin afectar con ello la permeabilidad o estructura
celular.
5.5 Glutatión intracelular afecta débilmente la incorporación de desoxiglucosa.
Los astrocitos tienen un rol fundamental en la regulación de los niveles
extracelulares de glutamato y en la protección neuronal de la toxicidad causada por
glutamato (Hertz y Zielke, 2004). Una de las moléculas más importantes en lo que
respecta a esto es el glutatión (GSH) (Schulz et al., 2000). El glutatión es un tripéptido
compuesto de ácido glutámico, glicina y cisteína. Su función a nivel celular radica en ser
76
un agente reductor no enzimático. Su bioactividad es de crucial importancia para toda
célula, sobre todo por su efecto protector contra RNOS, excitotoxicidad y disfunción
mitocondrial, entre otras. El tráfico de GSH entre astrocitos y neuronas es
particularmente importante en condiciones de estrés oxidativo (Dringen, 2000). Los
astrocitos son capaces de aumentar el GSH neuronal mediante la liberación al medio
extracelular de GSH (Sagara et al, 1996; Dringen et al, 1999; Stewart et al., 2002), sin
embargo las neuronas son incapaces de tomar el GSH directamente desde el medio
extracelular y sólo pueden hacer uso de cisteinil glicina y cisteína, que se producen a
partir de GSH por la acción consecutiva de γ-glutamil transferasa (γ-GT) y la
aminopeptidasa N, dos enzimas expresadas en la superficie de los astrocitos y las
neuronas, respectivamente (Dringen et al., 1997-2001). Cisteína es el sustrato que
limita la velocidad de la síntesis de GSH en las neuronas, por lo que la oferta de este
sustrato por los astrocitos es esencial para el mantenimiento de los niveles de GSH en
las neuronas (Dringen et al., 1999). Como fue demostrado por Frade et al., 2008 el
incremento de GSH extracelular corresponde a un efecto producido por la liberación de
glutamato lo cual está sustentado por experimentos que demuestran que los niveles de
GSH extracelular no depende de la síntesis de novo por parte de las neuronas,
tampoco es producto de un daño celular con las consecuente filtración del medio
intracelular y se ha visto también que no posee relación con la inhibición de γglutamiltransferasa, enzima presente en los astrocitos y que está encargada de
transferir el grupo glutamil a aceptores aminoacídicos o dipéptidos. De acuerdo a esto,
se plantea que el incremento de GSH de los astrocitos podría ser consecuencia de la
activación de receptores de glutamato y/o de la activación río abajo de cascadas de
77
señalización a causa del glutamato, las cuales pueden incluir regulación intracelular de
Ca+2, estimulación de proteina quinasa C y la inhibición de adenilato ciclasa (Porter y
McCarthy 1996, 1997; Winder y Conn 1996). El glutamato es capaz de inducir varios
cambios en astrocitos los cuales no son mediados vía receptores de glutamato. Estos
cambios incluyen un switch metabólico entre metabolismo glicolítico y metabolismo
oxidativo. Este cambio se vería evidenciado por una disminución en la utilización de
glucosa y un incremento de la actividad mitocondrial (Liao y Chen, 2003), lo cual puede
modificar el metabolismo y exportación de GSH.
Con la idea de explorar la naturaleza del efecto inhibitorio de ácido ascórbico,
considerando, que éste también es un agente antioxidante, decidimos analizar si el
efecto inhibitorio que posee el ácido ascórbico, se debe a una reacción redox producida
al interior de la célula, lo cual gatillaría que la incorporación de glucosa se vea afectada.
Para esto, realizamos ensayos en presencia de otro agente antioxidante como lo es
GSH. Observamos que la previa incubación de las células con glutatión-ester, el cual es
permeable a la membrana plasmática (Im et al., 2006), afecta significativamente la
incorporación de DOG en células C6 nativas, efecto también observado en células C6
shGLUT3 pero solo a concentraciones altas (100 mM) de glutatión. En Rice et al, 2008
se plantea que ascorbato y GSH son distribuídos distintamente en el cerebro, esto
quiere decir que se ha visto que la concentración de ascorbato es más alta en neuronas
y glutatión tiene localización preferencial en la glía, esto proviene de mediciones
realizadas por este grupo de trabajo en donde se indica que las concentraciones de
78
glutatión en neuronas es de 2,5 mM y en la glía corresponde a 3,8 mM. Si bien
trabajamos a concentraciones muy altas respecto a los niveles fisiológicos, el efecto
observado en células C6 es estadísticamente significativo a concentraciones pequeñas.
Planteamos que el ácido ascórbico al ingresar (cuyo potencial eléctrico E 0 es
0,08v) a la célula reacciona con la forma reducida del glutatión (con potencial eléctrico
E0 de -0,23v), haciendo que este último se oxide. En efecto esta reacción de óxidoreducción conlleva a que el ácido ascórbico pueda ser capaz de reducir residuos
aminoacídicos expuestos en los loops intracelular, lo cual a su vez puede modificar la
sensibilidad del transportador al sustrato, ya sea por un cambio conformacional o bien
por afectar un residuo aminoacídico involucrado directamente en la unión del sustrato.
5.6 Fosfoascorbato, un análogo no antioxidante de ácido ascórbico, es capaz de
inhibir el consumo de glucosa en neuronas bajo actividad sináptica.
De acuerdo a lo que observamos en los experimentos electrofisiológicos, ácido
ascórbico intracelular inhibe el consumo de glucosa en neuronas bajo actividad
sináptica glutamatérgica, lo que se evidencia por la falta de recuperación de las EPSCs
luego de un periodo de privación de glucosa. La incorporación de monocarboxilatos
como fuente energética en este experimento fue inhibida por 4 CIN 100 µM. Se ha
criticado extensivamente el uso de este compuesto en este tipo de experimentos,
79
puesto que 4 CIN es capaz de inhibir MCT1, el cual se expresa en la membrana interna
mitocondrial y por tanto, inhibiría la entrada de piruvato a la mitocondria. La Ki de 4CIN
para MCT1 es 425 µM (Halestrap et al., 1999), mientras que la Ki de 4CIN para MCT2
es 24 µM (Broer et al., 1999). Por lo tanto, la presencia de 4 CIN 100 µM inhibiría solo
parcialmente a MCT1, mientras que la función de MCT2 debiera ser casi
completamente abolida. Además, Erilchman y colaboradores (2008) demostraron la
existencia del flujo de lactato entre astrocitos y neuronas en presencia de 4CIN 100 µM
bajo condiciones experimentales in vivo.
Por último, en forma interesante en presencia de fosfoascorbato intracelular, el
cual es una molécula parecida estructuralmente, pero sin la capacidad antioxidante que
posee el ascorbato, observamos la misma tendencia que en presencia de ácido
ascórbico intracelular. Es decir, glucosa no es capaz de sustentar la actividad sináptica
después del periodo de privación. Esto confirma que fosfoascorbato sería capaz de
inhibir el consumo de glucosa en neuronas bajo actividad sináptica glutamatérgica.
Puesto que este efecto es más robusto que el observado con GSH, nos inclinamos a
pensar que el mecanismo de acción de ácido ascórbico para modular el consumo de
glucosa es independiente de sus propiedades antioxidantes. Dicho de otro modo,
proponemos que el efecto inhibitorio de ácido ascórbico sobre GLUT3 no dependería de
su capacidad antioxidante, más bien creemos que este efecto correspondería a alguna
interacción de modo estructural, es decir, sugerimos que ácido ascórbico podría estar
80
interactuando directa o indirectamente con GLUT3, hexoquinasa u otra molécula
intermediaria del consumo de glucosa.
Por consiguiente, según lo hemos demostrado en nuestro laboratorio GLUT3 es
una pieza clave en el efecto inhibitorio que ejerce el ácido ascórbico intracelular sobre
la incorporación de glucosa. En este trabajo, demostramos que la inhibición del
transporte, mediado por GLUT3, y también la inhibición de la fosforilación de glucosa (o
análogos de glucosa) producen como consecuencia la estimulación del transporte de
lactato (Figura 15). Se ha propuesto que existiría una estrecha relación, inclusive una
posible interacción, entre la enzima hexoquinasa tipo I y los transportadores de glucosa
(Rauch et al., 2004, Acuña et al., datos no publicados). Por tanto, es posible proponer
que ácido ascórbico cause tanto la inhibición del transporte y de la fosforilación de
glucosa afectando a un putativo complejo GLUT3-hexoquinasa.
81
81
Figura 15. Interacción entre el consumo de glucosa y el transporte de lactato
neuronal bajo episodios de actividad sináptica glutamatérgica.
Bajo actividad
sináptica glutamatérgica las células gliales liberan ácido ascórbico al espacio
extracelular. Las neuronas incorporan ácido ascórbico gracias a la expresión de
SVCT2. El aumento de ácido ascórbico intracelular inhibe el transporte de glucosa
mediado por GLUT3. Esta disminución de la tasa de transporte de glucosa, así como la
también disminución en la tasa de fosforilación de la misma producen la estimulación
del transporte de lactato neuronal. Asc: ácido ascórbico. Gluc: glucosa. GSH: glutatión
reducido. GSSH: glutatión oxidado. HK: hexoquinasa. Glu: glutamato. Asc+:
deshidroascórbico.
82
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