Download 2. introduccion - Tesis Electrónicas UACh

UNIVERSIDAD AUSTRAL DE CHILE
Facultad de Ciencias
Escuela de Bioquímica
Modulación aguda del transporte de Hexosas en Neuronas y
Astrocitos
Tesis de Grado presentada como parte de los requisitos para optar al Grado de
Licenciado en Bioquímica y al Título profesional de Bioquímico.
Profesor Patrocinante: Dr. Luis Felipe Barros O. - Centro de Estudios Científicos
(CECS).
Anitsi Marcela Loaiza Díaz
Valdivia Chile 2003
Profesor Co-Patrocinante
Dra. Ilona Concha G. - Instituto de Bioquímica - Facultad de Ciencias.
Epigrafe
¡Oh , la profundidad de las riquezas y de la sabiduría y del conocimiento de Dios! ¡Cuan
inescrutables son sus juicios e ininvestigables sus caminos!. “Romanos 11 : 33”
Dedicatoria
A mi querida mamá, a Ivi por ser una fuente de apoyo siempre.
Y a mis verdaderos amigos.
Agradecimientos
A mi guía académico el Dr. Felipe Barros por haber tenido la fe y paciencia en que mis esfuerzos
en el desarrollo de esta tesis darían sus frutos. Su enseñanza y crítica científica como también su
estímulo son un ejemplo para mí, que sin duda han influenciado en mi formación como
Bioquímica.
A todos quienes conforman el laboratorio haciendo de este un templo del trabajo y saber. En
especial, a los Drs. Francisco Sepúlveda, Pablo Cid y María Isabel Niemeyer quienes estuvieron
siempre disponibles para entregar sus conocimientos y críticas científicas.
A Joel Castro por hacer ameno el ambiente de trabajo. A Carolina Montenegro, Carla Bittner e
Ingrid Carvacho por sus buenos consejos y apoyo que iban más allá del ámbito académico.
A Dra. Ilona Concha y quienes forman parte de su equipo como Angara Zambrano y en especial
a Carola Otth, quién con mucho esmero me enseñó técnicas fundamentales para el desarrollo de
esta investigación.
A Roberto, mi esposo, quién estuvo siempre brindándome apoyo, compañía y ánimo en el
desarrollo de esta. A mi familia: el abuelo Luis, mamá, papá y hermana que influyeron
positivamente y me animaron a finalizar esta etapa de mi vida.
Esta tesis fue desarrollada en el laboratorio de Biofísica y Fisiología Molecular perteneciente al
Centro de Estudios Científicos (CECS) y fue financiada por FONDECYT 1020648, proyecto de
responsabilidad del Dr. Felipe Barros O. con el apoyo de la Fundación Andes.
1. RESUMEN
El transporte de glucosa es activado agudamente ante estrés metabólico en distintos tipos
celulares, sin embargo, no se ha informado de tal modulación en células cerebrales, cuyo
metabolismo es casi exclusivamente dependiente de glucosa. Este trabajo consistió en investigar
si el transporte de glucosa en neuronas y astrocitos es estimulado por efecto del neurotransmisor
excitatorio glutamato, inductor de estrés metabólico en estas células.
El desarrollo de este trabajo comprendió tres etapas. En la primera se caracterizaron los cultivos
mixtos hipocampales, identificándose neuronas y astrocitos por criterios morfológicos,
inmunocitoquímicos y funcionales. Además, se detectó la presencia de GLUT1 en astrocitos. En
la segunda etapa, se desarrollaron dos métodos independientes de medición de captación de
hexosas (galactosa y 2-NBDG), basados en microscopía confocal de epifluorescencia. Ambos
métodos fueron efectivos en la medición del transporte de hexosas sensibles a citocalasina-B, sin
embargo, se optó estudiar la modulación del transporte usando la hexosa fluorescente (2-NBDG)
debido a su menor sensibilidad a artefactos de manipulación. La tercera etapa consistió en evaluar
el efecto del glutamato sobre la captación de la hexosa. Contrario a lo esperado, el
neurotransmisor inhibió en un 42 % la captación de 2-NBDG, fenómeno que fue reproducido por
AMPA, un agonista de los receptores ionotrópicos de glutamato. Tanto la entrada de calcio como
la entrada de sodio fueron identificadas como factores necesarios pero no suficientes para la
inhibición por AMPA. En astrocitos el glutamato estimuló rápidamente, en el orden de segundos,
la captación de
2-NBDG, fenómeno de interés para los modelos actuales de interacción
metabólica entre neuronas y astrocitos.
SUMMARY
Glucose transport is activated by metabolic stress in different cell types, however modulation has
not been reported in brain cells, whose metabolism is almost exclusive dependent of glucose.
This study investigated if glucose transport in neurons and astrocytes is stimulated by the
excitatory neurotransmissor, glutamate, and an inducer of metabolic stress in these cells.
This study comprised three parts. In the first, hippocampal mixed cultures were characterized,
identifying neurons and astrocytes by morphological, inmunocytochemical and functional
criteria. Also, GLUT1 was detected in astrocytes. The second part included the development of
two independents assays of hexose (galactose and 2-NBDG) uptake, based in epifluorescence
confocal microscopy. Both assays were effective at measuring, cytochalasin-B-sensitive hexose
transport; however, we chose the fluorescent hexose (2-NBDG) to further study transport
modulation due to its lower sensitivity to manipulation artifacts. The third part was an evaluation
of the effect of glutamate on hexose uptake. Contrary to our expectation, the neurotransmissor
inhibited 2-NBDG uptake by 42 %, phenomenon that was reproduced by AMPA, an ionotropic
glutamate receptor agonist. Calcium and sodium entry were identifying as necessary factors but
not sufficient for the inhibition by AMPA. In astrocytes, glutamate quickly stimulated, in the
order of seconds, 2-NBDG uptake, phenomenon of interest for current models of metabolic
interaction between neurons and astrocytes.
2. INTRODUCCION
El cerebro es uno de los órganos con mayor demanda energética, que a pesar de representar solo
un 2% del peso corporal gasta el 20% del oxígeno y glucosa consumidos por el organismo.
La glucosa es prácticamente el único sustrato utilizado por el cerebro como combustible. Para
acceder al parénquima cerebral esta molécula requiere atravesar las membranas celulares del
endotelio que constituyen la barrera hematoencefálica (Cremer et al., 1979;Lund-Andersen,
1979). El transporte de la glucosa es mediado por los transportadores facilitativos GLUTs
(Figura 1) (Joost y Thorens, 2001). Se han identificado diferentes isoformas de los
transportadores facilitativos de glucosa en el cerebro, siendo los principales GLUT1, GLUT3 y
GLUT8. Las neuronas expresan abundantemente GLUT3 con menores densidades de GLUT1
GLUT8. Los astrocitos expresan sólo GLUT1 con la excepción de los astrocitos hipotalámicos
que también expresan GLUT2 (ver tabla 1).
En neuronas, se acepta actualmente que la fosforilación de la glucosa por la hexoquinasa a
glucosa-6-fosfato es la etapa limitante de su velocidad de consumo y no así su transporte. Por
ejemplo, cultivos neuronales en estado de reposo mostraron que la fosforilación es la etapa
limitante al constatar que en estado estacionario la concentración de glucosa intracelular era
similar a la extracelular (Heidenrich et al., 1989), (Whitesell et al., 1995). Utilizando resonancia
magnética nuclear en cerebros de rata se demostró que la distribución de glucosa en el espacio
intra y extracelular permanecía igualmente distribuida (Pfeuffer et al., 2000). Sin embargo, otros
grupos apuntan a que la velocidad del transporte puede llegar a ser limitante su velocidad de
consumo. Estudios in vivo con microsensores en el intersticio del giro dentado de ratas muestran
que la estimulación eléctrica local disminuye la concentración de glucosa intersticial en un 20 a
30% (Hu y Wilson, 1997). Estimulación de la actividad neuronal por microdialisis con
veratridina, un agente despolarizante, muestra que el eflujo de glucosa al extracelular disminuye
en el hipocampo, indicando que aumentaría el consumo de glucosa (van der Kuil y Korf, 1991).
Ambos resultados sugieren que
en condiciones de actividad las neuronas aumentarían su
consumo de glucosa.
Trabajos en condiciones de estrés metabólico en sistemas neuronales indican que el transporte de
glucosa ocupa un papel importante. Por ejemplo, episodios hipóxicos in vivo en el hipocampo de
ratas generan disminución de la concentración de glucosa extracelular transitoriamente (van der
Kuil y Korf, 1991), en condiciones de hipoxia in vitro provocan un aumento de la expresión de
GLUT1 en astrocitos y GLUT3 en neuronas de cultivos primarios de cerebro de rata (Bruckner et
al., 1999), en condiciones de isquemia cerebral se ha observado in situ sobreexpresión de
GLUT3 en neuronas de la corteza cerebral (Urabe et al., 1996).
En diversos sistemas celulares las condiciones de estrés metabólico incrementan el transporte de
glucosa aguda o tardíamente. Aumento del pH, inhibición de la fosforilación oxidativa, hipoxia o
deprivación de glucosa aumentan la velocidad de transporte de glucosa. La estimulación rápida
del transporte de glucosa puede ser resultado de la activación de transportadores pre-existentes en
la membrana plasmática o de la translocación de transportadores desde sitios intracelulares
(Ismail-Beigi, 1993). Por ejemplo, la línea celular de fibroblastos de ratón swiss 3T3 presenta una
estimulación rápida del transporte inducida por un aumento de Cai2+ con un t1/2 de
aproximadamente 4 min. (Kitagawa, 1987). GLUT1 es modulado agudamente por estrés
metabólico, como se ha demostrado por varios grupos, incluido el nuestro (Baldwin et al.,
1997;Hamrahian et al., 1999). En la línea celular hepática Clone-9, GLUT1 responde al estrés
metabólico con un incremento en su actividad intrínseca, el cual parece ser
mediado por la proteína quinasa activada por AMP (AMPK)(Barnes et al., 2002). En estas
células la actividad de GLUT1 es también modulada agudamente por la concentración citosólica
de calcio (Quintanilla et al., 2000b). La actividad de GLUT3 es estimulada de manera aguda ante
la exposición a trombina en plaquetas con un t1/2 de 1-2 min como consecuencia de la
translocación del transportador (Sorbara et al., 1997).
En actividad sináptica las neuronas del sistema nervioso central liberan glutamato desde los
terminales presinápticos, la interacción del neurotransmisor con sus receptores específicos en los
terminales postsinápticos generan potenciales excitatorios. Cuando la actividad sináptica se
incrementa, la liberación excesiva de glutamato resulta tóxica para las neuronas. Episodios
epilépticos,
isquemia
e
hipoglicemia
provocarían
una
excesiva
excitación
neuronal
(excitotoxicidad) (Lynch y Guttmann, 2002). Se ha descrito que la excitotoxicidad provocada por
altos niveles de glutamato altera la homeostasis del calcio y sodio en las neuronas resultando en
aumento intracelular de estos iones (Choi, 1987). Concentraciones elevadas de calcio intracelular
inducen una sobrecarga de Ca2+ por la mitocondria causando disipación del potencial de su
membrana (Schinder et al., 1996), disminuyendo la producción de energía aeróbica y
aumentando la producción de especies reactivas de oxígeno (Dugan et al., 1995;Reynolds y
Hastings, 1995), condiciones de estrés metabólico celular. Posteriormente los niveles aumentados
de calcio también activan proteasas, fosfolipasas y nucleasas dependientes de calcio resultando en
toxicidad y finalmente en muerte neuronal (Rothman y Olney, 1987), (Orrenius et al., 1989),
(Miller et al., 1992).
FIGURA 1. Modelo esquemático de las proteínas GLUT. Con sus 12 α-hélices dominios
transmembrana. Superior, GLUTs clase I (GLUT1, GLUT3, GLUT4, GLUT2). Inferior, GLUTs
clase III (GLUT6, GLUT8, GLUT10, GLUT12). Los residuos altamente conservados tienen el
fondo blanco y los propios de la clase con fondo negro (modelo obtenido de Joost HG, Molecular
Membrane Biology, 2001, 18, 247-256). Al extremo carboxilo terminal son afines los anticuerpos
anti-GLU1 y anti-GLUT3 usados en este trabajo.
TABLA 1. Familia de Transportadores facilitativos de glucosa GLUTs.
Transportador
Sitios de expresión/Función
GLUT1
eritrocitos, barreras titulares sanguíneas.
(55kDa)
cerebro: barrera hematoencefálica.
(45kDa)
mayoría células corporales: transporte basal.
cerebro: glias, neuronas, plexo coroides, epéndimo.
Referencia
Vannucci S., et al, 1997 (Glia, 21:2-21)
GLUT2
hígado, riñón, páncreas; transportador con alta K m,
sensor de liberación de glucosa.
cerebro: hipotálamo; astrocitos.
Placenta, espermios, plaquetas; transportador con
GLUT3
Km muy baja, alta velocidad de transporte.
cerebro:
corteza,
hipocampo,
neurohipófisis,
cerebelo, núcleo caudado. Neuronas.
corazón, músculo, tejido adiposo; transportador
GLUT4
sensible a insulina.
cerebro:
cerebelo,
hipocampo.
neuronas,
microvasos cerebrales.
intestino
GLUT5
delgado,
macrófago,
espermios;
transportador de fructosa.
cerebro:
microglia
y
células
endoteliales
microvasculares.
GLUT6
pseudogen
hígado, glándula adrenal, bazo, tejido adiposo,
GLUT8
pulmones, testículos.
Ibberson M., et al, 2000 (JBC, 275: 4607-12)
cerebro: cerebelo, hipocampo, hipotálamo
neuronas excitadoras e inhibitorias hipocampales.
GLUT9
bazo, leucocitos y cerebro.
Reagan L., et al, 2002; (Brain Res. 932: 129-34)
Doege H., et al, 2000(Biochem J., 350: Pt3, 771-6)
riñón e hígado
Phay J. E., et al, 2000 (Genomics, 66 (2) : 217-20)
GLUT10
corazón, pulmón, hígado, musculo esquelético,
páncreas, placenta, riñón y cerebro humanos.
Dawson PA, et al, 2001
cerebro e hígado fetal.
(Mol Genet Metab. 4:186-99)
niveles mayores en hígado y páncreas. niveles
McVie-Wylie AJ, et al, 2001
menores en corazón, placenta, músculo esquelético
(Genomics ; 72:113-7)
y riñón.
corazón
y
músculo
esquelético
humanos.
Doege H., et al, 2001(Biochem. J., 359:443-9)
Transportador de fructosa con baja afinidad por
GLUT11
glucosa.
corazón, próstata.
GLUT12
Rogers, S., et al, 1998 (Diabetes, 47 A45)
El objetivo principal de este trabajo fue investigar el efecto de glutamato, neurotransmisor
excitatorio, sobre el transporte de glucosa en neuronas y astrocitos. Para esto utilizamos cultivos
mixtos de hipocampo de rata, donde las neuronas crecen en condiciones más fisiológicas al
interactuar con otras células no-neuronales como astrocitos (Laming et al., 2000). La medición
del transporte de glucosa requirió el uso de métodos que permitan diferenciar los tipos celulares
que componen el cultivo mixto. Métodos basados en microscopía confocal de epifluoresencia
permiten medir el transporte de hexosas a nivel de célula única, que a diferencia de los
tradicionales métodos isotópicos, no requieren poblaciones celulares puras.
Los métodos de transporte de hexosas fluorimétricos usados fueron de tipo indirecto y directo. El
primero se basa en registrar los cambios de volumen celular provocados por la entrada de
osmolitos como la galactosa. A partir de estos cambios de volumen es posible determinar la
concentración intracelular de la hexosa. Este método permite efectuar mediciones sucesivas sobre
las mismas células en tiempo real, pudiendo obtenerse tasas de velocidades
iniciales y
variaciones de la Vmáx, debido que la condición de captación es cis-infinito (Barros, 1999). Por
otro lado, el segundo método está basado en el uso del azúcar fluorescente 2-(N-(7-nitrobenz-2oxa-1,3-diazol-4-yl)-2-desoxiglucosa (2-NBDG), análogo fosforilable de glucosa, usado como
sustrato de transportadores de glucosa en diversos sistemas de células eucariontes (Speizer et al.,
1985), (Yamada et al., 2000), (Roman et al., 2001). El uso de concentraciones bajas de esta
azúcar, transportada a velocidad lenta (Yamada et al., 2000) (Cloherty et al., 1995) permite hacer
mediciones de transporte en condiciones de cero-trans a temperatura ambiente, lo cual facilita la
observación de fenómenos de modulación del transporte.
Ambos ensayos de captación de hexosas a nivel de célula individual fueron aplicados a los
cultivos hipocampales mixtos establecidos para explorar los posibles cambios de captación de
hexosas asociadas al fenómeno de la actividad sináptica aumentada. Los resultados de esta tesis
demostraron que la actividad neuronal provocada por glutamato, inhibe el transporte de glucosa
en neuronas y la estimula agudamente en astrocitos. Este nuevo resultado apoya el modelo
propuesto de acoplamiento metabólico neuronal-astrocítico y representa la modulación más
rápida del transporte de glucosa reportada hasta ahora.
HIPÓTESIS DE TRABAJO
El glutamato induce un aumento del transporte de glucosa en neuronas.
OBJETIVO GENERAL
Determinación si el glutamato provoca un aumento del transporte de hexosas en neuronas y
astrocitos hipocampales de rata en cultivo mixto.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Establecimiento y caracterización de los cultivos hipocampales mixtos de neuronas y astrocitos
de rata. Identificación de estas células por criterios morfológicos, inmunológicos y funcionales.
Caracterización de la expresión de los transportadores de glucosa GLUT1 y GLUT3 en los
cultivos mixtos a través de ensayos de inmunocitoquímica y Western Blot.
Desarrollo de dos métodos independientes para medir el transporte de hexosas a nivel de célula
única y determinación de las bondades relativas de estos dos métodos en nuestro sistema
experimental.
Determinación si la exposición a glutamato aumenta el transporte de hexosas en neuronas y
astrocitos.
3. MATERIALES Y METODOS
3.1 Materiales
Calceina-AM, Fluo 3-AM, Fura Red –AM y 2-NBDG, además del ácido plurónico se obtuvieron
de Molecular Probes (Eugene, EEUU). Para identificar los transportadores GLUT1 y GLUT3 se
utilizaron anticuerpos purificados por Cromatografía de Afinidad dirigidos contra el carboxilo
terminal (Figura 1). En el caso del anticuerpo anti-GLUT1, dirigido a los residuos
477 – 492 del carboxilo terminal (regalado por el Dr. Stephen Baldwin, (Quintanilla et al.,
2000b). El anticuerpo anti-GLUT3, dirigido a los residuos 675 – 686 del carboxilo terminal,
fabricado por Eastacres Biologicals (regalado por Dra. Ilona Concha). Otros anticuerpos usados
como anti-GFAP (Dako, EEUU) y anti-MAP1b (SIGMA) están dirigidos contra la proteína
completa. Se usaron como anticuerpos secundarios IgG de conejo anti- rata conjugado a FITC e
IgG de ratón anti-IgG de rata conjugado a TRITC obtenido en Sigma. Como anticuerpo
secundario para Western Blot se utilizó IgG anti-conejo marcado con peroxidasa de rábano
(Vector Laboratories, Inc. EEUU). Como agonista de los receptores de glutamato ionotrópicos se
usó AMPA y como bloqueador CNQX, los cuales fueron obtenidos de Tocris Coockson LTDA
(Saint Louis, EEUU) El glutamato, ionomicina, KCl, EGTA, NMDG y los reactivos de uso
general fueron adquiridos en Sigma (Saint Louis, MO, EEUU). Para medir osmolaridad se utilizó
un osmómetro de presión de vapor 5500 XR, Wescor, Inc. (Utah 84321, EEUU).
3.2 Métodos
3.2.1 Preparación de los Cultivos mixtos de neuronas y glia.
Los cultivos mixtos de neuronas y glia se prepararon a partir de hipocampos de ratas neonatas de
1 a 3 días (P1 - P3) (Perego et al., 2000) de ambos hemisferios cerebrales.
3.2.1.1 Disección, disgregación y sembrado celular.
La disección se hizo usando un protocolo estándar, según está descrito (Alvarez et al., 1999), en
condiciones de semiesterilidad y a 4° C, manteniendo al tejido cerebral en una solución tampón
Hank´s Balanced Salt Solution (HBSS) compuesta por 10 mM de sal sódica de Hepes, 80 mM de
NaCl, 74 mM de KCl, 55 mM de glucosa, 44 mM de KH2PO4, pH 7,4. Una vez aislados, los
hipocampos fueron lavados con HBSS, luego de lo cual se incubaron a 37° C con Tripsina 0,25
% en HBSS durante 5 a 10 min. La tripsinización se detuvo utilizando suero bovino fetal y
sucesivos lavados con HBSS o con MEM 10 (10 % de suero bovino fetal, 5 mM de glucosa, 2
mM de glutamina, 1 mM de piruvato de sodio, 10 UI / ml penicilina G sódica y 10 g / ml de
sulfato de estreptomicina, a veces se utilizó fungizona 2,5 g / ml para evitar el crecimiento de
hongos y levaduras), en algunas ocasiones se utilizó 0,4 mg / ml de DNAsa como inhibidor de la
tripsinización. Luego se disgregó mecánicamente el tejido utilizando pipetas pasteur de vidrio
con puntas de diferente diámetro, en medio de cultivo MEM 10. La suspensión celular fue
recolectada e inicialmente sembrada en medio MEM 10 a una densidad de 100.000 a 200.000
células / ml a 37º C en una atmósfera de 95 % aire y 5 % CO2. La densidad celular de la
suspensión se cuantificó en un hematocitómetro (BOECO, Alemania).
3.2.2 Condiciones de cultivo.
Una hora más tarde del sembrado, el medio de cultivo fue reemplazado por MEM libre de
suero, preparado con un suplemento N1 100 X, a una concentración final de 100 μg / ml de
transferrina, 5 μg / ml de insulina, 20 nM de progesterona, 100 μM de putrescina , 30 nM de
dióxido de selenio , 5 mM glucosa, 1 mM de piruvato sódico, 2 mM de glutamina, 0.1 % de
Ovoalbúmina, 10 UI/ml de penicilina G sódica y 10 μg / ml de sulfato de estreptomicina.
3.2.3 Preparación de las superficies de crecimiento celular.
Para que las células puedan adherirse a la superficie firmemente y por lo tanto crecer y
desarrollarse adecuadamente, en especial las neuronas, se usó poli-L-lisina 1 mg / ml. Los
cubreobjetos de vidrio y las placas de plástico (Falcon, EEUU) fueron recubiertas con este
polímero.
3.2.4 Inmunocitoquímica
3.2.4.1 Protocolo de Inmunocitoquimica.
El día del experimento, los cubreobjetos de vidrio de 12 mm de diámetro (Marienfield,
Alemania) con células se lavaron 3 veces con PBS a temperatura ambiente, luego se fijaron con
2 % de paraformaldehído en tampón de sales de fosfato (PBS, 10mM de NaH2PO4 x 1H2O, 145
mM NaCl) durante 15 minutos a temperatura ambiente. El exceso de paraformaldehído fue
apagado mediante incubación por 10 minutos con 10 mM glicina. Se permeabilizaron 5 minutos
con 0,2% Tritón X-100 en PBS y luego se lavaron tres veces con PBS. Luego de esto en algunos
casos se utilizó 0,025 mg / ml de ioduro de propidio incubándose en oscuridad por 10 min. Antes
de incubar con los anticuerpos primarios correspondientes se bloquearon los posibles sitios de
unión inespecífica utilizando una solución de 10 % albúmina sérica de bovino en PBS durante 40
minutos. Se usaron como anticuerpos secundarios anti rata: IgG de conejo conjugado a FITC e
IgG de ratón conjugado a TRITC a las diluciones convenientes de acuerdo al protocolo. Se lavó
tres veces el exceso de anticuerpo secundario con PBS y finalmente los cubreobjetos se montaron
sobre portaobjetos de 76 X 26 mm (B y C, Alemania) utilizando un medio de montaje
acondicionado para fluorescencia (Dako, EEUU).
3.2.4.2 Utilización de marcadores celulares para neuronas y astrocitos.
La identificación de los tipos celulares en el cultivo mixto se llevó a cabo utilizando anti-MAP1b,
anticuerpo monoclonal dirigido contra proteínas asociadas a microtúbulos, como marcador
neuronal y anti-GFAP, anticuerpo policlonal dirigido contra la proteína acídica fibrilar de la
glia, como marcador de astrocitos (Engel y Muller, 1989).
La inmunodetección dirigida a las neuronas se llevó a cabo usando 3,5 μg /ml de anti-MAP1b
con incubación a 4° C durante toda la noche, por otro lado, la identificación de los astrocitos se
desarrolló usando 4,1 μg /ml de anti-GFAP, incubando a temperatura ambiente durante dos horas.
Como anticuerpos secundarios se usaron IgG conjugado a TRITC para anti-MAP1b e IgG
conjugado a FITC para anti-GFAP diluidos 1:200 veces.
Para la doble inmunocitoquímica se incubaron las células con una mezcla de los anticuerpos antiMAP1b y GFAP, utilizándolos a 7 y 1,025 μg / ml e incubándose durante toda la noche a 4° C .
Finalmente, se reveló con una mezcla de 1:2000 de TRITC y 1:200 de FITC los cuales se
incubaron durante dos horas a temperatura ambiente.
3.2.4.3 Detección de los transportadores de glucosa GLUT1 y GLUT3.
Las células se incubaron durante toda la noche a 4oC a las concentraciones de 0,05 y 0,693 g /
ml de GLUT1 y GLUT3, respectivamente. Como anticuerpo secundario se usó FITC (1:100).
3.2.5 Inmunodetección tipo Western blot
Para hacer este análisis las células fueron crecidas en placas de 10 cm de diámetro (Falcon)
haciéndose las extracciones proteicas los días 4, 8 y 10 post-cultivo.
3.2.5.1 Extracción de proteínas totales.
Las placas se lavaron tres veces con PBS frío en una cama de hielo a 4° C, luego de aspirar el
PBS las células fueron lisadas. El proceso de lisado consistía en incubar la placa de células con
una solución tamponada (tampón RIPA), según está descrito (Angulo et al., 1998) que contiene
50 mM de Tris-HCl pH 7,5, 150 mM de NaCl, 0,5 % de desoxicolato de sodio, 5 mM de EDTA,
0,1 % de SDS, 1 % de NP-40 además de un coctel de antiproteasas que lleva de aproteinina A 2
μg / ml de, 1 μg / ml de leupeptina, 150 μg / ml de pepstatina y 0,57 mM de fluoruro de
fenilmetilsulfonilo ( PMSF ) durante 15 min a 4º C. El total de las proteínas de membrana
solubles fueron colectadas una vez centrifugadas a 14.800 g durante 15 min a 4ºC. La
concentración de proteínas de solubles fue determinada usando el método del ácido bicinconínico
(BCA) y cobre oxidado (Micro BCA Protein Assay, Pierce, EEUU).
3.2.5.2 Separación de las proteínas por Electroforesis en gel de poliacrilamida.
Se utilizó el método de (Laemmli, 1970). Una vez obtenidas las proteínas se cargaron 50 μg de
estas en cada carril usando un buffer de carga 2X (100 mM Tris pH 6,8, 2 % de 2-Mercaptoetanol
(W y Z, Santiago, Chile), 4 % Lauril Sulfato
de sodio (SDS), 20% Glicerol y
0,2 % Azul de Bromofenol), se fraccionaron por una electroferesis en gel 10 % poliacrilamida (W
y Z, Santiago, Chile) – SDS, el cual estaba formado en la parte superior por un gel concentrador y
en la inferior por uno separador de 2,25 % y 10 % de poliacrilamida respectivamente (Angulo et
al., 1998). La electro-transferencia se hizo sobre una membrana de nitrocelulosa a 50 Volts por 2
hrs en un tampón de transferencia (190 mM Glicina, 25 mM Tris y 0,1 % SDS, pH 8,3) en una
cámara de frío. Luego se lavó la membrana con tampón TBS (20 mM Tris y 500 mM NaCl) por
20 min en agitación constante y se bloqueó con 5% de leche descremada en tampón TBS - T
(TBS más 0,2 % de Tween 20) durante 2 hrs con agitación.
3.2.5.3 Inmunodetección de GLUT1 y GLUT3 por Western blot.
Luego del bloqueo la membrana de nitrocelulosa se incuba con un anticuerpo primario
policlonal, ya sea con anti-GLUT1 o anti-GLUT3 durante toda la noche a 4ºC con agitación. Los
anticuerpos estaban en solución de 5% leche TBS-T. Después de esto se lavó la membrana 3
veces con TBS-T durante 20 min cada vez. Se usó como anticuerpo secundario una dilución de
1:25000 de IgG anti-conejo conjugado con peroxidasa de rábano durante 2 horas a temperatura
ambiente. La detección de la actividad de peroxidasa se realizó por un ensayo de
quimioluminiscencia (Supersignal West Pico Chemiluminescent Substrate, Pierce, EEUU) y
finalmente se expuso la membrana de nitrocelulosa a una película radiográfica (Hiperfilm E,
Kodak, EEUU).
3.2.6 Ensayos de Transporte.
Las células se incubaban en calceina o Fura-red-AM, dependiendo del tipo de ensayo de
transporte usado, luego se lavaban con tampón Krebs-Ringer-HEPES (KRH; 136 mM NaCl, 10
mM HEPES, 4,7 mM KCl, 1,25 mM MgSO4, 1,25 mM CaCl, pH 7,4) suplementado con 3,3 mM
glucosa y permanecían en esa solución hasta el inicio del transporte. Todos los experimentos se
hicieron a temperatura ambiente (22-26 ºC). Estos ensayos son descritos en profundidad en los
resultados por considerarse un aporte a los resultados de esta tesis.
3.2.7 Reemplazos isotónicos.
El tampón KRH-NMDG reemplazaba Na+ por NMDG+. KRH-40 mM KCl contenía 100,7 mM
NaCl y, 40 mM KCl. KRH-manitol o KRH-20 y 100 mM glucosa contenían 126 y 86 mM NaCl,
respectivamente manteniéndose las otras sales a las concentraciones indicadas en KRH solo.
3.2.8 Mediciones Fluorescentes.
Las células fueron sembradas sobre cubreobjetos de 25 mm de diámetro (n°1, Erie Scientific,
USA), los cuales fueron montados sobre cámaras abiertas construídas por BioJSP (Santiago,
Chile).
La fluorescencia fue medida en regiones de interés (Region Of Interest: ROIs) posicionadas sobre
las células cada 20-30 segundos utilizando un Microscopio Confocal Zeiss, modelo LSM 5
Pascal, equipado con laseres de Argón y Helio/Neón para excitar a 488 y 543 nm,
respectivamente.
En este sistema confocal la fluorescencia es convertida a una imágen digital de 512 X 512 o 1024
X 1024 pixeles, para los cursos temporales y la toma de fotos de alta resolución, respectivamente,
donde a cada píxel se le ha asignado un valor entre 0 (negro) y 256 (blanco). Las imágenes se
obtuvieron usando un pinhole de 150-165 μm, lo cual corresponde a registrar la fluorescencia
emitida por un corte óptico de aproximadamente 2,0 μm de grosor. La saturación de la señal se
evitó manipulando la ganancia y el offset para que al inicio de los experimentos la señal
estuviese entre 100-130 pixeles. La señal de fondo (background) se midió colocando una región
de interés (ROI) en lugares sin células y este valor fue sustraído a las mediciones de fluorescencia
proveniente de los ROIs celulares colocados sobre las células.
3.2.9 Características de las sondas fluorescentes usadas.
La calceina presenta un máximo de absorción / emisión de 494 / 517 nm, la cual emite en el
rango del verde, color otorgado artificialmente.
El azúcar fluorescente 2-NBDG posee un máximo de excitación de 466 nm y de emisión a 540
nm, por otro lado la sonda Fura-red presenta un máximo de excitación a 488 nm y de emisión a
655 nm. Como ambos son excitables a la misma longitud de onda y emiten en rangos de longitud
de onda diferentes, fue posible experimentalmente registrar la señal de ambos fluoróforos
simultáneamente en dos canales de emisión distintos; observándose la señal de Fura-red en
emisión mayor que 585 nm (canal rojo) y 2-NBDG entre 505 y 550 nm (canal verde). A pesar de
que las señales estaban lo suficientemente separadas, el espectro de emisión de 2-NBDG es ancho
y se produjo solapamiento de la señal 2-NBDG en Fura-Red lo que llevó a que se observara una
contaminación de la señal fluorescente de Fura-Red por efecto de 2-NBDG, esta no interfiere con
las mediciones de calcio cualitativas. En algunos casos cuando se requirió calcular la variación
del Ca2+ se debió eliminar esta contaminación. Para esto se promediaron los primeros 10 puntos
antes y durante la exposición a 2-NBDG de los canales rojo y verde, luego cada promedio fue
restado de su respectiva señal, de esa manera se obtuvieron dos valores uno correspondiente al
aumento de la señal en el canal verde (V) y otro en rojo (R). Se obtuvo entonces una fracción R /
V la cual fue multiplicada a todos los puntos de la señal verde correspondientes a la exposición a
2-NBDG, estos nuevos valores correspondían a la señal contaminante de 2-NBDG que se
sobrepasaba al canal rojo (contaminación en rojo). Finalmente, los puntos de la señal de FuraRed correspondientes a la exposición a 2-NBDG se restaban a los valores de contaminación en
rojo.
En otros experimentos se usaron Fluo-3 y Fura red, ambos excitables a 488 nm con picos de
emisión a 526 y 655 nm, respectivamente. Estas sondas unen calcio con distinta Kd, 390 en el
caso de Fluo-3 y 140 nM para Fura-Red.
Todas las sondas estaban preparadas en 0,02 % de ácido plurónico en DMSO. Calceina-AM 5
μM fue incubada durante 5 min Fura-Red fue cargada a una concentración final de 5 μM durante
30 min. También se usaba doble carga con 5 μM de Fluo-3 más 15 μM de Fura-Red, incubándose
por 30 min. En todos los casos se incubaron a temperatura ambiente.
3.2.10 Análisis Estadístico.
Los datos son presentados como promedio ± error estándar (número de células). Para los análisis
de regresión lineal se utilizó el programa Sigma Plot 5.0 (Jandel), descartándose regresiones con r
< 0,7. Se usó el mismo programa para ajustar los histogramas de distribución utilizándose una
curva Gaussiana: y = a*e (-0,5 ((x0-x)/b)2), donde x0 equivale al promedio estadístico.
Los análisis estadísticos se realizaron en el programa Sigma STAT (Jandel). Para comparar dos
muestras de distribución normal, la significancia estadística fue evaluada usando la prueba tstudent pareada de dos colas. Para comparar dos muestras sin distribución normal se usó el Test
Man Whitney Rank Sum. Múltiples grupos con distribución normal fueron evaluados usando
ANOVA, seguido del Test de Dunn. Multiples grupos sin distribución normal fueron evaluados
por el Test de Kruskal-Wallis one way. En todos los análisis estadísticos se consideró diferencia
significativa p < 0,05.
4. RESULTADOS
4.1 Caracterización de los cultivos mixtos hipocampales.
4.1.1 Identificación de neuronas y astrocitos.
Es de importancia reconocer morfológicamente a las células de interés para ubicarlas sin
ambigüedad en el campo óptico y luego cargarlas con las sondas fluorescentes. Con esta idea se
hizo una detallada corroboración de la identificación entre neuronas y astrocitos hipocampales de
índole morfológica, inmunocitoquímica y funcional.
4.1.1.1 Identificación morfológica.
En cultivo, las características de los astrocitos difieren morfológicamente de las neuronas. Según
se ha descrito, los astrocitos son mayores y planos, adoptando formas poligonales. Los cuerpos
neuronales aparecen en contraste de fase más redondos, densos y refractarios a la luz (Ahmed et
al., 2000;Froes et al., 1999;Lefrancois et al., 1997). Estas características fueron las mismas
observadas en nuestros cultivos mixtos de hipocampo de rata (Figura 2, A). Los astrocitos
crecieron formando una monocapa continua sobre la cual yacen las neuronas y sus procesos; esta
disposición fue más claramente observada al teñir las células con el colorante vital calceina
(Figura 2, B). Estos cultivos contenían también otros tipos celulares como microglia y
oligodendrocitos, los cuales se encontraban en menor cantidad a los días en que se desarrollaban
los experimentos de transporte, además de ser morfológicamente distintos a las neuronas y
astrocitos (VerderioyMatteoli, 2001).
FIGURA 2. Identificación morfológica de neuronas y astrocitos. A, microfotografía de
contraste de fases, las flechas blancas indican neuronas y las negras núcleos de astrocitos. B,
Células cargadas con calceina. La flecha con línea sólida muestra una neurona y la flecha
punteada un astrocito. La imagen de la derecha corresponde a una reconstrucción tridimensional
con una rotación de la foto izquierda en 90° del plano.
4.1.1.2 Identificación inmunocitoquímica.
La identidad celular adscrita en contraste de fases fue confirmada en los cultivos mixtos por
doble inmunocitoquímica para las proteínas MAP1b y GFAP, los cuales son marcadores de
citoesqueleto específicos para neuronas y astrocitos, respectivamente. Las células positivas a
GFAP presentaban un núcleo de 10-12 μm de diámetro y cuerpos grandes, polimórficos y planos,
difiriendo marcadamente de las células positivas a MAP1b. Estas últimas eran menores, con un
cuerpo de alrededor de 10 μm de diámetro de formas bipolares o multipolares (Figura 3). Estos
resultados inmunocitoquímicos confirmaron que los astrocitos pueden ser distinguidos
claramente de las neuronas basándose en un criterio morfológico (Ahmed et al., 2000;Froes et
al., 1999;Lefrancois et al., 1997).
4.1.1.3 Identificación funcional.
Adicionalmente, se hizo un test de reconocimiento funcional induciendo la despolarización de las
células con alto K+ extracelular (Ahmed et al., 2000). Se sabe que las neuronas, al tener un
número mucho mayor de canales de Ca2+ sensibles a voltaje, presentan un mayor aumento de
calcio que los astrocitos ante despolarización. En nuestros cultivos las células identificadas
morfológicamente como neuronas presentaron un aumento de calcio significativamente mayor
que las células reconocidas como astrocitos (Figura 4). Por lo tanto, este ensayo funcional
permitió corroborar la identificación de estos tipos celulares mediante los otros dos criterios.
FIGURA 3. Identificación inmunocitoquímica de neuronas y astrocitos. A, Células teñidas
con anticuerpo anti-GFAP con características de astrocitos, representativo de n = 3 y células
reactivas a MAP1b con características neuronales, representativo de n=2. Las barras de escala
indican 10 m. B, Los cultivos fueron teñidos simultáneamente con anti-GFAP (anticuerpo
policlonal) y anti-MAP1b (anticuerpo monoclonal). La microfotografía superior derecha
corresponde a la tinción de MAP1b, la superior izquierda a GFAP, la inferior izquierda a la
superposición de las dos anteriores y la inferior derecha al contraste de fase. La tinción
inmunocitoquímica fue desarrollada como se describe en Materiales y Métodos. Este
experimento es representativo de n = 2.
FIGURA 4. Identificación funcional de los astrocitos y las neuronas ante un estímulo
despolarizante. Las células fueron crecidas sobre un cubreobjeto de vidrio cuadriculado para así
ubicar el campo óptico experimentado. Estas se cargaron con Fluo-3 y luego de obtener una señal
estable se expusieron a KCl. A, Las imágenes corresponden al mismo campo óptico, en contraste
de fase antes del experimento (a), durante la exposición a 40 mM KCl, cargadas con Fluo-3 (b) y
luego de la tinción inmunocitoquímica anti-MAP1b y anti-GFAP post-exposición a KCl. Las
flechas blancas corresponden a dos neuronas (1, 2) en el campo óptico del cultivo mixto y 3 a 9
corresponden a astrocitos (c). B, Los gráficos representan la señal de Cai2+ en las dos neuronas
(flechas) y en astrocitos respectivamente ante el estímulo despolarizante de 40 mM KCl.
4.1.2 Reconocimiento de GLUT1 y GLUT3.
Nuestros cultivos expresaron tanto GLUT1 como GLUT3, según ensayos de inmunocitoquímica
y Western Blot. La tinción inmunocitoquímica de cultivos mixtos hipocampales mostraron que
tanto las neuronas como los astrocitos reaccionaron con anti-GLUT1, sin embargo, las neuronas
presentaron baja reactividad al compararlas con los astrocitos. Se observó un patrón de
distribución superficial de GLUT1, similar a resultados anteriores (Vannucci et al., 1997). Por
otro lado, el anticuerpo anti-GLUT3 reaccionó fuertemente con neuronas (Figura 5) y en menor
medida los astrocitos (datos no mostrados).
La especificidad de los anticuerpos anti-GLUT1 y anti-GLUT3 usados fue analizada mediante
análisis de Western blot (Figura 6). El anticuerpo para GLUT1 reaccionó con dos bandas de
aproximadamente 55 y 45 kDa de masa aparente, lo cual indicaría la presencia de dos isoformas
en el cultivo (Vannucci, 1994). Como control positivo se usó una muestra de eritrocitos humanos,
los cuales expresan mayoritariamente GLUT1; esta muestra también presentó una banda ancha de
similar velocidad de migración. El nivel de expresión de los transportadores GLUT1 en las
células provenientes de cultivo mixto fue dependiente directamente del tiempo en cultivo,
resultado similar a lo ya descrito (Vannucci, 1994). Por otro lado, el anticuerpo para GLUT3
reaccionó principalmente con dos bandas que migraron con masas relativas aparentes de 51 y 44
kDa y en menor grado con tres bandas de 69, 62 y 30 kDa. El control positivo, extracto crudo de
hipocampo de rata mostró el mismo patrón de migración. La multiplicidad de bandas reconocida
por el anticuerpo anti-GLUT3 impide una interpretación segura de los resultados obtenidos en la
inmunocitoquímica. Este resultado establece la expresión de GLUT1 principalmente en los
astrocitos, pero no permite emitir conclusiones sobre la presencia de GLUT3 en nuestros cultivos.
FIGURA 5. Reconocimiento inmunocitoquímico de GLUT1 y GLUT3 en neuronas y
astrocitos en cultivo. A, Superior. Células incubadas con anti-GLUT1. Microfotografias
correspondientes a una reconstrucción tridimensional, en un mismo campo óptico en distinto
ángulo, a 0º se observan astrocitos y a 90º neuronas del mismo campo (flechas rojas). Inferior.
Previo a incubación con anti-GLUT1, las células se incubaron con ioduro de propidio, un agente
intercalante del ADN, a temperatura ambiente, lo cual otorga un color rojo a los núcleos. B,
Células incubadas con anti-GLUT3 e ioduro de propidio. Superior izquierdo, somas reactivos a
ioduro de propidio. Superior derecho, células positivas a anti-GLUT3. Inferior, Fusión de las
dos fotos superiores. Resultados similares se observaron en más de 3 experimentos diferentes.
FIGURA 6. Reconocimiento de GLUT1 y GLUT3 en cultivos mixtos por western blot. Para
GLUT1 y 3 se cargaron 50 μg de proteínas solubles extraídas del cultivo mixto de hipocampo de
los días de cultivo indicados. En el último carril de la inmunodetección para GLUT1 se usaron 50
ng de proteínas provenientes de membranas de eritrocitos humanos (eri), utilizándolo como
control. Para GLUT3 se utilizó como control positivo una extracción cruda de hipocampo (hip).
Las condiciones en que se efectuó el ensayo se explican en materiales y métodos (n = 2).
4.2 Desarrollo de dos métodos independientes para medir transporte
de hexosas a nivel de célula única.
Una vez establecidas las diferencias entre las neuronas y astrocitos y establecidos los cultivos
mixtos hipocampales se desarrollaron dos métodos independientes para medir transporte de
hexosas a nivel de célula única, utilizando microscopía confocal de epifluorescencia. Los
métodos usados y que se describen en detalle a lo largo de este trabajo de tesis fueron uno de
medición indirecta, basado en las variaciones del volumen celular causado por el flujo de
galactosa y el otro de medición directa, basado en la permeabilidad de un análogo de la glucosa,
la hexosa fluorescente 2-NBDG. El transporte fue medido preferentemente en células con 7 a 10
días en cultivo mixto a temperatura ambiente, debido a que en ese tiempo las neuronas y
astrocitos se han desarrollado lo suficiente y visualmente son diferenciables.
4.2.1 Método Indirecto: Volumétrico.
Descrito anteriormente en células epiteliales (Barros, 1999), este método fluorimétrico que
permite la medición de transporte de azúcar en células mamíferas utilizando microscopía
confocal, está basado en los cambios de volumen celular ocurridos durante la captación de
hexosas. El principal requisito de este método es que las células deben comportarse como
osmómetros, es decir, que varían su volumen en respuesta a soluciones anisosmóticas de una
manera predecible. Por eso, para establecer el uso del método indirecto volumétrico, se debió
determinar la sensibilidad de las neuronas y astrocitos ante una solución anisosmótica. Con ese
objetivo se utilizó el manitol, que no permea la membrana celular (Carruthers, 1990).
4.2.1.1 Neuronas y astrocitos son osmosensibles.
Las neuronas y astrocitos cargadas con calceina aumentaron rápidamente su intensidad de
fluorescencia (F) ante la exposición a manitol hiperosmolar (Figura 7). Esta respuesta inicial se
debe a la rápida salida de agua durante el equilibrio de las fuerzas osmóticas. El aumento de la
fluorescencia se mantuvo estable mostrando en primer lugar que este azúcar no es transportado
en estas células y, además, ni las neuronas ni los astrocitos presentan regulación del volumen
celular (Regulatory Volume Increase, RVI), que es consistente con trabajos anteriores (Aitken et
al., 1998;Andrew et al., 1997;Crepel et al., 1998).
La Figura 8 en su parte A representa a un grupo de neuronas y la figura B astrocitos, de
experimentos independientes. Las células fueron expuestas a osmolaridades crecientes
observándose que la fluorescencia celular es proporcional a la fuerza osmótica de la solución
aplicada en el medio extracelular. Con los gráficos a la derecha de A y B, representativos, fue
posible determinar que las células se comportaban como osmómetros, es decir que variaban su
volumen en respuesta a soluciones anisosmóticas de una manera predecible. Finalmente se
obtuvo una relación matemática como promedio de dos experimentos que para las neuronas fue
Fb / F = 0,8 * Osmb/Osm + 0,21 y un r de 0,99 (n=2, 6 células) y para los astrocitos Fb / F = 0,72
* Osmb/Osm + 0,29 y un r de 0,98 (n=2, 12 células). Donde Fb, F, Osmb, Osm, corresponden a la
fluorescencia basal, la fluorescencia a las diferentes osmolaridades, osmolaridad basal y
osmolaridad correspondiente a las soluciones usadas. Debido a que la regresión lineal se acercaba
a 1 se concluyó que ambos tipos de células se comportaban como osmómetros ideales. La
extrapolación de los interceptos de las curvas con las ordenadas arrojó los valores que
porcentualmente indicaron un 21 y 29 % del secuestro de calceina en compartimientos
intracelulares de la sonda para las neuronas y astrocitos, respectivamente. En células HeLa se ha
encontrado un 56 % de porcentaje de secuestro de la calceina (Barros, 1999) y en células de
neuroblastoma un 64 % (Crowe et al., 1995).
Estos resultados mostraron que calceina es sensible en cerca de un 80 % a los cambios de la
osmolaridad externa, debido a su bajo porcentaje de sonda secuestrada en compartimientos
intracelulares. Por lo tanto, este método aplicado en neuronas y astrocitos es apto para medir
cambios osmométricos y así determinar el transporte de hexosas.
FIGURA 7. Cambios Fluorescentes en células cargadas con calceina-AM expuestas a
hiperosmolaridad. A, B Las células se cargaron con calceina. Luego de esperar una señal de
fluorescencia estable se expusieron a una solución de 200 mM manitol en KRH-glc, lo cual
provoca un cambio de 285 a 485 mOsM. A, microfotografías de un grupo de neuronas y
astrocitos obtenidas antes, durante y después de la exposición a manitol, las barras de medida
equivalen a 10 μm y 20 μm para las neuronas y astrocitos respectivamente.. B, Se muestra la
señal de fluorescencia normalizada de una neurona y de un astrocito.
FIGURA 8. Las neuronas y los astrocitos se comportan como osmómetros. Las células
cargadas con calceina, primero fueron expuestas a KRH solo, luego a osmolaridades crecientes
provocadas por KRH con concentraciones crecientes de manitol (100, 200, 400 y 800 mM). Los
datos representan un promedio ± error estándar de un total de 5 neuronas en A y de un total de 7
astrocitos en B. Los gráficos a la derecha muestran el promedio de fluorescencia obtenido a cada
osmolaridad (F) relativa a la fluorescencia basal (Fb). Los puntos fueron ajustados a una regresión
lineal utilizando el programa Sigma Plot, entregando los parámetros de pendiente e intercepto.
Resultados similares se obtuvieron en otros 2 experimentos independientes.
4.2.1.2 Captación de galactosa.
Con los experimentos anteriores se demostró una respuesta osmométrica lineal en neuronas y
astrocitos frente al osmolito no transportable, manitol. Ahora se debe determinar la respuesta de
neuronas y astrocitos frente a los cambios osmóticos provocados por la captación de una hexosa
como la galactosa (Barros, 1999). Galactosa es un sustrato natural de los transportadores
facilitativos de glucosa, captada por GLUT1 y GLUT3 (Carruthers, 1990), (Gould et al., 1991).
Esta hexosa en cultivos neuronales y cerebrales inhibe el transporte de D-glucosa (Hara et al.,
1987). Por lo tanto, galactosa sería captada por neuronas y astrocitos de los cultivos mixtos ya
establecidos.
La exposición a este azúcar, ejemplificada en la figura 9, muestra los cambios de fluorescencia
producidos en un astrocito y una neurona. Inmediatamente después de exponer la preparación a
200 mM galactosa se observa un aumento de la señal fluorescente, producto de la diferencia
osmótica (menor concentración intracelular que extracelular) (a), respuesta similar a la observada
ante manitol. Lo que sigue del curso temporal (b), a diferencia de la exposición a manitol,
muestra una disminución de la fluorescencia debido a que la captación de hexosas (osmolitos) es
acompañada de la entrada de agua y el resultado final es la dilución del fluoróforo, (c) indica la
entrada repentina de agua y d la salida del azúcar y el agua.
Para obtener la velocidad de captación es necesario hacer una transformación de los datos de
intensidad de fluorescencia (F) (señales de parte b del gráfico A en figura 9) en unidades de
concentración del azúcar intracelular (Si) utilizando la ecuación 1, descrita para este método en
otro sistema celular (Barros, 1999), donde Fb es la fluorescencia basal, Fmáx es el máximo de F
(inmediatamente después del equilibrio de las presiones osmóticas) y S0 es la concentración
externa del azúcar al inicio del transporte.
 Fmáx  F 
Si ( captación )  So

 Fmáx  Fb 
(1)
Con esta fórmula fue posible graficar la concentración intracelular con relación al tiempo (Figura
10 B), donde la pendiente equivale a la velocidad de captación.
Las neuronas en varios experimentos no captaron galactosa mostrando un patrón idéntico a la
exposición a manitol por lo cual no fue posible determinar la tasa de transporte de la hexosa
(círculo blanco en Figura 10 A). Por otro lado, en aquellos cursos temporales en que mostraron
captación de esta hexosa se calculó que la tasa de captación fue de 78 ± 37 μM/s (n=7, 15
células). Los astrocitos transportaron 200 mM galactosa a una tasa de 213 ± 85 μM/s (n=9, 22
células). Para descartar la permeabilización inespecífica de las células, terminado el transporte de
galactosa, se usaba manitol (datos no mostrados). La velocidad promedio de captación fue
diferente entre ambos tipos celulares, sin embargo, la resolución dada por la medición de
transporte a nivel de célula única permitió evidenciar una gran heterogeneidad. En algunos casos
los astrocitos presentaron menor o igual velocidad de captación que las neuronas (Figura 10 A).
Las diferentes tasas de captación observadas en neuronas y astrocitos concuerdan con resultados
en otros sistemas de cultivos (Hara et al., 1989;Heidenrich et al., 1989;Maher et al.,
1996;Pellerin y Magistretti, 1994).
La relación entre las tasas de captación de galactosa y los días de cultivo indicó que estos últimos
no afectaban la tasa de captación del azúcar en las neuronas, pero sí la de astrocitos, con mayores
tasas de captación en los días 8 y 9 (Figura 10, C).
En astrocitos se hicieron inhibiciones de la captación de galactosa usando citocalasina-B,
mostrando que la velocidad inicial de captación de galactosa fue inhibida en un 88 ± 24 % (n = 8
cells; p < 0.05) (Loaiza et al., 2003).
FIGURA 9. Captación de galactosa en neuronas y astrocitos. Las células fueron incubadas
por 5 min en KRH sin glucosa. Luego se expusieron a galactosa por 900 s. A, Curso temporal de
la señal fluorescente normalizada a la señal basal de una neurona y transformación de los datos
de fluorescencia relativa a concentración intracelular de galactosa (Materiales y Métodos). La
regresión lineal aplicada entregó la velocidad de captación de galactosa de 0.040 mM / s. B,
Curso temporal de la señal fluorescente normalizada a la señal basal de un astrocito y
transformación de los datos de fluorescencia relativa a concentración intracelular de galactosa, la
regresión lineal aplicada entregó la velocidad de captación de galactosa de 0.106 mM / s
(experimentos representativos de n=3)
FIGURA 10. Velocidad de Captación de Galactosa en neuronas y astrocitos. A, Valores de
velocidad de captación de galactosa 200 mM en 15 neuronas que transportaban, n=7
experimentos (●), 14 neuronas que no transportaban, n=4 experimentos independientes (○) y 22
astrocitos, n = 9 (▲). B, Promedio ± error estándar de A, se descartaron para el promedio los
datos correspondientes a las neuronas que no transportan (○). C, Relación entre los días de
cultivo y la velocidad de captación de galactosa en neuronas (●) y astrocitos (○) como promedio
± error estándar. Neuronas, días de cultivo 4, 5, 6 y 9 (n=1) y 7 (n=2). Astrocitos, días de cultivo
6 (n=1), 7 (n=3), 8 y 9 (n=2).
4.2.2 Método directo: hexosa fluorescente.
Como método alternativo se utilizó el azúcar fluorescente, 2-NBDG, análogo de glucosa que
potencialmente es fosforilable por hexoquinasa. Ha sido probada en diversos tipos celulares como
eritrocitos (Speizer et al., 1985), células de islotes pancreáticos (Yamada et al., 2000) y células
epiteliales polarizadas (Roman et al., 2001). Además, se ha usado 6-NBDG, hexosa fluorescente
no fosforilable, para medir transporte en neuronas y astrocitos (Ahmed et al., 2000). Para llevar a
cabo la medición del transporte de esta hexosa en nuestro sistema de cultivo mixto neuronal-glial
analizamos el curso temporal de la hexosa, determinamos la concentración óptima experimental
y evaluamos si su vía de permeación es mediada por GLUTs.
4.2.2.1 Curso temporal de la entrada de 2-NBDG.
En un experimento típico las células fueron incubadas con Fura-Red, para poder visualizarlas al
microscopio, además de obtener una idea del nivel celular del Ca2+. Luego de lo cual
se
expusieron una solución tampón KRH durante 5 min para comenzar la captación de
2-NBDG por aproximadamente 15 min. Finalmente, se lavaba el azúcar usando KRH.
La señal fluorescente dada por Fura-Red aumentaba al momento de exponer las células al 2NBDG, debido a que esta hexosa, dado su espectro de emisión aplanado, contaminaba el canal
donde se registraba el Fura-red. Por este motivo los datos de calcio fueron considerados de tipo
cualitativo.
La señal fluorescente dada por 2-NBDG, medida en las regiones de interés (ROIs) colocadas en
el medio del soma neuronal incrementó bifásicamente, con un rápido salto inicial seguido por una
fase lenta (Figura 11). La señal correspondiente a la segunda fase fue transformada a
concentración de 2-NBDG intracelular usando las fórmulas descritas. El cálculo de la tasa de
captación se desarrolló por medio de ajustar una regresión lineal a los puntos de la cinética de
acumulación intracelular del azúcar (Figura 12). Nótese que la fórmula (Figura 12 B) considera al
alza inicial como contaminación extracelular en la señal intracelular. Esto último es probable
dado que un experimento control con la sonda fluorescente calceina también presentó alza inicial
(Figura 13). Por lo tanto, la fórmula usada subestima en un 12 % (n=55) la tasa de transporte
calculada. Cuando se considera al alza inicial significante debe usarse una fórmula que incluya
este parámetro (Anexo 1).
4.2.2.2 Curva Dosis-Respuesta de 2-NBDG en neuronas.
Para determinar la dependencia de dosis de las neuronas se hizo una curva dosis-respuesta a
distintas concentraciones del azúcar, mostrando que a mayor concentración de sustrato
aumentaba la velocidad de captación, con tendencia a la saturación (Figura 14). No se investigó
el rango superior a 3,2 mM por razones de costo del reactivo. Se determinó la concentración de
300 μM 2-NBDG, como la mínima capaz de entregar una adecuada razón señal-ruido de
fluorescencia, por lo que se usó en los experimentos que se describen más adelante.
FIGURA 11. Curso Temporal de la captación de 2-NBDG en una neurona. A, Las células
fueron cargadas con Fura-Red. Las fotos corresponden a una secuencia de antes, durante y
después de la exposición a 300 μM 2-NBDG. Durante la exposición a 2-NBDG se observa
amarillo el extracelular, producto de la fluorescencia del 2-NBDG. La figura B muestra el curso
temporal de la intensidad promedio de la señal de fluorescencia de 2-NBDG en la neurona
seleccionada (○) y en la región extracelular (□).
FIGURA 12. Transformación de los datos de fluorescencia de 2-NBDG a velocidad de
captación. A, Feo y Fe indican la fluorescencia extracelular inicial a tiempo 0 y a tiempo “t”,
respectivamente. Fit=0, Fit=t indican la fluorescencia promedio de los 4 primeros puntos de la señal
intracelular de 2-NBDG y a tiempo “t”, respectivamente. En los casos en que la Fe no es estable
se usa un factor de corrección Fet=0 / Fe t=t, para que sea multiplicado a todos los puntos de Fi. B,
Fórmula usada para transformar los datos de fluorescencia Fi a porcentaje de captación con
respecto al extracelular. C, Fórmula utilizada para la transformación de % de captación a
concentración de 2-NBDG intracelular.
FIGURA 13. La fase rápida del aumento de la fluorescencia intracelular corresponde a
contaminación extracelular. A, Un grupo de 9 neuronas fue expuesto a un curso temporal de
300 M 2-NBDG, luego de lavar el azúcar fluorescente estas mismas células se expusieron a
calceina desesterificada. B, Nótese que la exposición a calceina causa un aumento rápido de la
señal intracelular, similar al registrado con 2-NBDG en las mismas células.
A
B
Fluorescencia (u.a)
Fluorescencia (u.a)
250
2-NBDG 300 M
300
250
200
150
100
50
Calceína
200
150
100
50
0
0
0
500
1000
1500
2000
Tiempo (s)
señal intracelular
señal extracelular
2500
0
100 200 300 400 500 600 700
Tiempo (s)
señal intracelular
señal extracelular
FIGURA 14. Curva de dosis respuesta de la captación de 2-NBDG en neuronas. Las células
se cargaron con Fura red, luego de esperar una señal estable se deprivaron de glucosa siendo
incubadas con KRH por 5 min. Luego sobre un mismo grupo de neuronas se expusieron las
concentraciones de 100, 200, 300, 400, 800, 3200 M de 2-NBDG preparadas en KRH. Los
puntos experimentales corresponden al promedio ± error estándar de 18 neuronas (n = 4
experimentos).
Tasa de Captación (M/s)
0.40
0.35
0.30
0.25
0.20
0.15
0.10
0.05
0.00
0
500 1000 1500 2000 2500 3000 3500
Concentración de 2-NBDG (M)
4.2.2.3 Evaluación de la vía de permeación de 2-NBDG.
Se sabe que la captación de esta hexosa es mediada por GLUTs (Yamada et al., 2000), pero no se
ha utilizado en cultivos cerebrales que abundantemente expresan GLUT3. En nuestro sistema
celular, según nuestros resultados, tanto las neuronas como los astrocitos expresan GLUT1
(Figura 5)
y según literatura las neuronas principalmente GLUT3 (ver tabla 1). Por ello
evaluamos la vía de permeación de 2-NBDG usando inhibidores de GLUTs como citocalasina B
y floretina en experimentos pareados, en los cuales la captación de 2-NBDG se midió primero en
ausencia y luego en presencia del inhibidor en las mismas células. Además, se hicieron
experimentos de competencia con glucosa.
4.2.2.3.1 Captación de 2-NBDG en neuronas es mediada parcialmente por GLUTs.
Las neuronas se expusieron a dos exposiciones sucesivas de 2-NBDG con y sin inhibidor cada
una. Las tasas de transporte de 2-NBDG tenían una velocidad de 14 ± 2,5 nM / s y la captación
en presencia de citocalasina-B una velocidad de 8,1 ± 1,1 nM / s (20 células, n= 4 experimentos)
(Figura 15 A). Para controlar que la segunda captación sea reproducible a la primera se hicieron
controles, usando el mismo protocolo de inhibición, pero solamente en presencia del vehículo del
inhibidor (metanol). La primera captación sin vehículo presentó una velocidad de captación de 12
± 1,1 nM / s y con vehículo 19 ± 2,2 nM / s, evidenciando una estimulación significativa en la
segunda captación (23 células, n=4) (Figura 15 B). Este control, nos sugiere que el vehículo per
se genera una estimulación sobre la captación, sugiriendo que la inhibición provocada por
citocalasina-B sobre la captación de 2-NBDG podría ser aún mayor.
FIGURA 15. La captación de 2-NBDG por neuronas es inhibida por citocalasina-B. Antes
de la exposición a 2-NBDG se expusieron a KRH sin glucosa y después de la exposición al
azúcar se lavaban con KRH-glc. (valor promedio ± error estándar). A, Curso temporal
representativo de dos exposiciones seguidas a 2-NBDG solo y con citocalasina-B. El gráfico de
barras indica los promedios de las velocidades de captación del azúcar en presencia del inhibidor
con respecto a la captación en ausencia del inhibidor (n=4, 19 neuronas). B, Curso temporal
representativo de dos exposiciones seguidas a 2-NBDG solo y con metanol (vehículo de
citocalasina-B). El gráfico de barras indica los promedios de las velocidades de captación del
azúcar en presencia del 1 μl de metanol respecto a la captación sin el vehículo (n=4, 23
neuronas). El asterisco representa diferencia significativa (t-student, p<,0,05).
Además, se hizo el mismo protocolo, pero usando floretina en la segunda captación (Figura 16),
dando como resultado velocidades de captación de 17 ± 1,5 nM / s y 11 ± 1,7 nM / s en ausencia
y presencia de floretina. Inhibiciones similares en un 65 y 58 % por citocalasina y floretina nos
indican que la captación de la 2-NBDG está mediada parcialmente por transportadores GLUTs.
La captación mediada se calculó restando de la captación total (sin inhibidor) la captación en
presencia de los inhibidores, siendo esta de 5,3 ± 0,8 nM / s 20 M citocalasina-B y 30 μM
floretina en neuronas (n = 4 con citocalasina B y 2 con floretina).
Se hicieron dos tipos de ensayos de competencia (A y B) con D-glucosa, el sustrato natural de los
GLUTs. Inicialmente se hicieron experimentos de competencia con glucosa 20 mM, pero como
promedio de 8 neuronas de 2 experimentos no se observó inhibición de la captación de 2-NBDG
por ello luego utilizamos 100 mM. Para evitar los cambios osmóticos que repercutirían en las
células, se expusieron primero a una solución KRH 100 mM manitol sin glucosa durante 5 min.
El ensayo tipo A, luego de deprivar de glucosa, consistía en exponer a 300 μM 2-NBDG en KRH
manitol, transcurridos 8 min de transporte se cambiaba la solución extracelular por otra con 300
μM 2-NBDG más 100 mM glucosa. Después de 8 min se detenía el transporte lavando con
KRH-manitol. Para descartar efectos no deseados provocados por la exposición primeramente a
manitol y luego a glucosa se utilizó una variante de este ensayo (tipo B). En este ensayo, después
de deprivarlas de glucosa, las células se exponían a una solución de 2-NBDG más glucosa y
luego esta era cambiada por manitol más 2-NBDG, finalmente se lavaba con KRH manitol.
Las tasa de captación en presencia de 100 mM glucosa fueron inhibidas en 5 de 7 células en 2
experimentos tipo A (Figura 17 A) y en 3 de 6 en 2 experimentos tipo B (Figura 17 B). Sin
embargo, la glucosa no pudo inhibir las tasas de captación de 2-NBDG en el promedio de las
neuronas como es posible ver en la figura 17 C. La relación entre la velocidad de captación de 2NBDG en presencia de glucosa y de manitol se resolvió dividiendo la velocidad de captación
promedio en presencia de glucosa versus la captación basal en su ausencia. Para las neuronas
entregó los resultados de 0,9 ± 0,2 veces para la competencia tipo A y de 1,2 ± 0,2 veces para la
competencia tipo B (Figura 17 C). Por lo tanto, la glucosa inhibió la tasa de captación en algunas
neuronas, pero en promedio no se observó inhibición.
FIGURA 16. La captación de 2-NBDG por neuronas es inhibida por Floretina. El protocolo
A al descrito en la figura 15 utilizándose
B
experimental es similar
en este caso 30 μM floretina. A,
Cada símbolo representa la tasa de transporte de 2-NBDG en ausencia y presencia del inhibidor
de una neurona. B, Las barras representan el valor promedio ± error promedio correspondiente a
un grupo de 8 neuronas de 2 experimentos diferentes. ). El asterisco representa diferencia
significativa (t-student, p<,0,05).
0.07
0.06
Tasa de Transporte de
2-NBDG 300 M (M/s)
0.06
0.05
0.05
0.04
0.04
0.03
0.03
0.01
0.01
0.00
0.00
2-NBDG
Floretina
*
0.02
0.02
+
-
+
+
+
-
+
+
FIGURA 17. La captación de 2-NBDG en algunas neuronas es inhibida por glucosa. A y B
Tasas de captación detallada de 2-NBDG en ausencia y presencia de 100 mM glucosa en
condiciones de experimento tipo A y B respectivamente descritos en el texto. Cada gráfico
corresponde a dos experimentos. C, Las barras muestran los valores promedio ± error estándar de
la normalización de la velocidad de captación de 2-NBDG a la velocidad de captación basal (ya
sea con manitol o glucosa). (tipo A: 7 neuronas, n=2; tipo B: 6 neuronas, n=2).
4.2.2.3.2 Captación de 2-NBDG en astrocitos es mediada parcialmente por GLUTs.
Las tasas de transporte 2-NBDG en experimentos pareados con 20 μM citocalasina-B en
astrocitos entregaron velocidades de captación de 49 ± 3,4 nM / s y 19 ± 3,7 nM / s en ausencia y
presencia de citocalasina-B, respectivamente (19 células, n = 3) (Figura 18).
La captación mediada se calculó restando de la captación de 2-NBDG total (sin inhibidor) la
captación en presencia de citocalasina-B resultando en 29 ± 2,6 nM / s (n = 3).
Las velocidades de captación de 2-NBDG en presencia de glucosa normalizadas a la captación en
ausencia de glucosa entregaron una relación de 0,6 ± 0,1 (tipo A) y 0,7 ± 0,2 (tipo B) entregando
una inhibición del 44 ± 12 y 33 ± 23 %. Por lo tanto, la captación de 2-NBDG por los astrocitos
fue inhibida parcialmente por la glucosa. Promediando las inhibiciones de ambos ensayos la
captación de 2-NBDG se vio inhibida en un 39 ± 12 % por 100 mM glucosa (n=4, 11 astrocitos)
(Figura 19). Resultados similares a este se observó con glucosa 20 mM siendo inhibida la
captación de 2-NBDG en un 43 ± 9,0 % y (n = 3, 10 astrocitos).
4.2.2.4 Tasas de transporte de 2-NBDG en neuronas y astrocitos.
Debido a que la concentración intracelular de hexosa, tanto en neuronas como en astrocitos,
durante los ensayos de captación inicial no alcanzaron sobre el 20% de la hexosa del extracelular,
se asume que las velocidades de captación reflejan la actuación del transporte bajo condiciones
zero-trans (Quintanilla et al., 2000a). Esto es importante, debido a que la captación en zero-trans
es determinada únicamente por la eficiencia del transporte, siendo despreciables los cambios en
la fosforilación de la hexosa.
Las tasas de transporte de 2-NBDG tanto en neuronas como astrocitos no variaron
considerablemente con respecto a los días en cultivo. Se vieron aumentadas en los días 6, 7 y 10
de cultivo en el caso de las neuronas, por otro lado, los días 7, 8, 9 y 10 fueron mayores, para los
astrocitos (Figura 20). El transporte a nivel individual tanto de neuronas como astrocitos fueron
bastante variable como lo denota el gráfico estadístico de barras (Figura 21), con variaciones
desde 1 a 90 nM / s en neuronas y desde 7 a 86 nM /s en astrocitos. La velocidad promedio de
transporte fue de 13 ± 0,6 y 36 ± 0,2 nM / s para neuronas y astrocitos respectivamente. Con todo
esto se concluye, al igual que los resultados dados por el método indirecto, que las neuronas
poseen una velocidad de captación menor que los astrocitos.
FIGURA 18. La captación de 2-NBDG es inhibida por citocalasina-B en astrocitos. A, Curso
temporal representativo de dos exposiciones seguidas a 300 μM 2-NBDG en un mismo grupo de
astrocitos durante el período indicado por la barra, solo y en presencia de 20 μM citocalasina-B.
B, (a), Detalle de todos los astrocitos expuestos a esta inhibición. (b), Promedio de velocidades de
captación por astrocitos en ausencia y presencia del inhibidor (barra negra y gris
respectivamente). Los valores promedios se registran ± error estándar (n=3, 19 astrocitos). El
asterisco representa diferencia significativa (t-student, p<,0,05).
FIGURA 19. La captación de 2-NBDG es inhibida parcialmente por glucosa en astrocitos.
A, B, Protocolos de competencia en que primero se exponían las células al azúcar control y luego
a 100 mM glucosa o viceversa. Las soluciones estaban preparadas en KRH. Se ajustaron
regresiones lineales con el Sigma Plot para obtener las tasas de captación. C, Cada barra
representa los valores promedio ± error estándar de la normalización de la velocidad de captación
de 2-NBDG a la velocidad de captación basal (ya sea con manitol o glucosa). (tipo A: 6
astrocitos, n=2; tipo B: 5 astrocitos n=2).
FIGURA 20. Relación entre los días de cultivo y la tasa de transporte de 2-NBDG en
neuronas y astrocitos. Las células fueron deprivadas de glucosa por 5 min (KRH), luego de esto
se incubaron con 300 μM 2-NBDG en KRH por 15 min. Finalmente se lavó el azúcar del medio
extracelular usando nuevamente KRH. Cada punto representa al promedio ± error estándar de
velocidades de captación de un grupo de neuronas (○) y astrocitos (●) de distintos experimentos
correspondientes a los días 4 (4 células, n=1), 5 (6 células, n=1), 6 (31 células, n=7), 7 (30
células, n=5), 8 (16 células, n=4), 9 (4 células, n=1), 10 (14 células, n=3), 12 (4 células, n=1). y
los días 6 (8 células, n=2), 7 ( 3 células, n=1), 8 (9 células, n=3), 9 (1 célula, n=1), 10 (9 células,
n=2), 11 (4 células, n=1), 12 (1 célula, n=1), respectivamente.
FIGURA 21. Transporte de 2-NBDG en neuronas y astrocitos. A, y B, Representan la
distribución estadística de las tasas de captación en neuronas y astrocitos (n=29, 129 neuronas y
n=19, 82 astrocitos). Esta distribución se ajustó a una curva Gaussiana, cuyos parámetros x 0, a y
b fueron de 13 ± 0,0 nM / s, 0,3 ± 2,5, 5,9 ± 0,7 nM / s para las neuronas y para los astrocitos 36
± 2,2 nM / s, 6,9 ± 0,7, 20 ± 2,3 nM /s, respectivamente (fórmula de curva descrita en Materiales
y Métodos).
4.3 Modulación aguda del transporte de 2-NBDG.
Luego de desarrollar y validar dos métodos de medición de captación de hexosas a nivel de célula
única, decidimos investigar la posible modulación aguda del transporte usando el método directo
de la hexosa fluorescente. El uso del método volumétrico en neuronas se hacía dificultoso debido
a que estas en su mayoría no captaban galactosa, probablemente debido a que galactosa no es
buen sustrato de GLUTs (Gould et al., 1991). Además, el uso de una concentración elevada de
galactosa podría resultar en un shock osmótico afectando el transporte. Por otro lado, el uso de 2NBDG con características menos invasivas, nos permitía monitorear la variación cualitativa del
Cai2+ lo cual sería relevante al evaluar la existencia de un aumento de la captación de azúcar
durante un estímulo de actividad sináptica provocado por glutamato. Por lo tanto, este método se
eligió para hacer cursos temporales en ambas células, observar su respuesta al calcio y la
modulación aguda del transporte de esta hexosa en respuesta a glutamato.
4.3.1 Glutamato inhibe el transporte en neuronas y lo estimula en astrocitos.
Tanto las neuronas como los astrocitos fueron expuestos a glutamato, un neurotransmisor
excitatorio, en presencia de 300 μM 2-NBDG (Figura 22 A, B). Contrario a lo esperado, los
resultados mostraron que el glutamato en promedio disminuyó la captación de 2-NBDG en las
neuronas desde una velocidad basal promedio de 44 ± 13 a 25 ± 5,8 nM / s (Figura 22 C) (n = 6
experimentos, 15 células, p > 0,05). Como resultado adicional se observó en los astrocitos una
señal consistente de estimulación del transporte como promedio de 33 ± 2,5 a 68 ± 5,7 nM / s (n
= 8 experimentos, 48 células) (Figura 22 C).
Las neuronas analizadas de manera individual mostraron una respuesta variable ante glutamato,
algunas inhibieron su captación y otras la aumentaron. En los astrocitos una minoría no respondió
o disminuyó su captación por efecto del glutamato. La mayoría vio estimulada su captación de 2NBDG y este efecto fue variable como es posible observar en la Figura 23, presentando un
máximo sobre 1400 % de estimulación del transporte y un valor promedio de estimulación, x0, de
186 ± 9,9 %.
4.3.1.1 La estimulación del transporte en astrocitos es de carácter agudo.
Debido a que el transporte de 2-NBDG se veía estimulado, nosotros usamos las bondades de este
método para obtener una estimación de la rapidez en la activación de la captación de 2-NBDG
por efecto del glutamato. Como se ha demostrado previamente, el glutamato causa un incremento
en el calcio citosólico en los astrocitos en el orden de los 3 segundos (Glaum et al., 1990). Por lo
tanto, se utilizó la señal fluorescente de Fura Red, la cual presentó una aguda deflexión de su
señal como resultado de la exposición al glutamato, indicando que el astrocito aumenta su Cai2+
producto de este estímulo y se consideró como el momento en que comenzaba el efecto del
glutamato en los astrocitos.
Luego se resolvió el sistema de ecuaciones de las regresiones lineales correspondientes al
transporte de la hexosa sin y con glutamato, obteniéndose el instante en que cambiaba la
pendiente del transporte. Este era mayor que el tiempo en que se presentaba la aguda deflexión de
la señal de Fura red. Entonces el retardo de la activación se calculaba restando el tiempo dado por
el sistema de ecuaciones menos el tiempo del pico de calcio (Figura 24). El tiempo que tarda en
activarse el transporte de 2-NBDG con relación al aumento del calcio intracelular fue variable,
iba desde - 5 a 95 segundos. El promedio de los 10 astrocitos que mostraron la estimulación más
rápida fue de 9 ± 3 s.
FIGURA 22. Efecto de glutamato sobre el transporte de 2-NBDG en neuronas y astrocitos.
A y B. El protocolo de transporte fue levemente diferente. La deprivación completa de glucosa se
reemplazó por exposición a KRH-glc 1 mM durante 5 min, luego a 2-NBDG en KRH-glc 1 mM,
y fue agregado a la mitad del curso temporal glutamato con una concentración final de 500 μM.
Ambos gráficos representan a células de un mismo campo óptico. Cada punto representa el
promedio de la señal de fluorescencia emitida ± error estándar de 3 neuronas y 5 astrocitos, A y
B respectivamente (experimento representativo). C, Las barras representan el promedio ± error
estándar
de las velocidades de captación de las células individuales (48 astrocitos, n= 8
experimentos y de 15 neuronas, n= 6 experimentos). El asterisco representa diferencia estadística
con respecto al control (t-student pareado p < 0,05).
FIGURA 23. Respuesta heterogénea en neuronas y astrocitos por efecto del glutamato. A,
En 4 de 15 neuronas el glutamato estimula su trasnporte y en el resto la inhibe (n=6). Los datos se
expresan como promedio ± error estándar. B, Distribución estadística de la estimulación en
astrocitos. Cada barra corresponde a un grupo de astrocitos que presentó el mismo porcentaje de
estimulación (n=8, 48 astrocitos). Esta distribución se ajustó a una curva Gaussiana, cuyos
parámetros x0, a y b fueron 186 ± 9,9 %, 6,8 ± 0,5 y 105 ± 11 % respectivamente (fórmula de
curva descrita en Materiales y Métodos).
FIGURA 24. Tiempo transcurrido entre el aumento de Cai2+ y la estimulación del
transporte de 2-NBDG provocado por glutamato. A, Experimento de un astrocito. El Cai2+ y
la señal de 2-NBDG fueron registradas simultáneamente. La señal de Fura-red era inversa a la
señal de Calcio, además se ajustaron regresiones lineales a las condiciones basales y estimuladas
de la captación por glutamato. B, Amplificación del gráfico A permite visualizar el tiempo
transcurrido entre el aumento de Cai2+ y la estimulación de la captación, que en este caso fue de
12,7 segundos.
4.3.2 AMPA inhibe el transporte de 2-NBDG en neuronas y no en astrocitos.
Para explorar el mecanismo molecular por el cual glutamato disminuye el transporte de
2-NBDG en neuronas, se incubaron éstas con AMPA, agonista de los receptores ionotrópicos de
glutamato homónimos.
En células incubadas con los fluoróforo Fluo-3 y Fura Red se observó que el AMPA provocó un
aumento marcado del Cai2+ en las neuronas no así en los astrocitos, utilizándose como control
positivo ionomicina, un ionóforo de iones divalentes, el cual provocó un alza de calcio en ambos
tipos celulares (Figura 25).
En la Figura 26 A y B es posible visualizar cursos temporales del efecto del AMPA sobre ambos
tipos de células.El AMPA provocó una disminución de la captación de 2-NBDG en las neuronas
que va desde una captación basal de 20 ± 2,0 a 5,1 ± 1,4 nM / s, es decir, fue inhibida la
captación en un 75 % con respecto al basal (n = 6 experimentos, 28 células, p < 0,05). Por otro
lado, un total de 11 astrocitos de 4 experimentos distintos, el AMPA no afectó la captación de 2NBDG, con valores de 30 ± 5,5 y 28 ± 5,5 nM / s (n = 4 experimentos, 11 células, p > 0,05)
(Figura 26 C).
Centrando nuestra atención a la inhibición significativa causada por AMPA en el transporte de 2NBDG en neuronas, observamos que esta modulación fue variable: inhibiendo, no provocando
ningún cambio o estimulando, resultados representados en la figura 27. Sin embargo, el promedio
mostró inhibición del transporte de 2-NBDG.
FIGURA 25. Efecto de AMPA sobre el Cai2+ en neuronas y astrocitos. Este grupo de células
se expusieron a KRH, sobre esta solución tampón se añadió AMPA y finalmente sin lavar este
sustrato, se expusieron a ionomicina como control del aumento de calcio intracelular. 4 neuronas
y 7 astrocitos ubicados en un mismo campo óptico fueron cargados con Fura Red y Fluo-3. La
señal fluorescente se expresó en porcentaje y equivalía a la razón de fluorescencia a cada tiempo
con respecto al máximo de fluorescencia inducida por ionomicina (n=2).
FIGURA 26. Efecto de AMPA sobre el transporte de 2-NBDG en neuronas y astrocitos. A y
B. Experimento representativo de la cinética de captación en un grupo de 4 neuronas y 1 astrocito
del mismo campo óptico. A, Superior, señal de fura-red. Inferior, señal de 2-NBDG de 5
neuronas. B, Superior, señal de fura-red, Inferior, señal de 2-NBDG de un astrocito. C, Las barras
corresponden al promedio de las tasas de captación del azúcar ± error estándar y el asterisco
representa diferencia estadística con respecto al control (t-student pareado p < 0,05) (n=6, 28
neuronas y n=4, 11 astrocitos).
FIGURA 27. Efecto variable de AMPA sobre el transporte de 2-NBDG en neuronas. Dos
neuronas correspondientes a un mismo experimento (●, ○). Neurona de un experimento diferente
(▲). Neurona representativa de la respuesta promedio de inhibición del transporte de 2-NBDG
por AMPA (○).
AMPA 20 M
140
[2-NBDGi] (M / s)
120
100
80
60
40
20
0
0
200 400 600 800 1000 1200 1400
Tiempo (s)
4.3.2.1 La Inhibición del transporte en neuronas es aguda.
Para determinar el tiempo transcurrido desde la deflexión aguda de Cai2+, producto del AMPA, y
la respuesta inhibitoria de la captación se usó la misma metodología descrita en el item 4.2.3.1.2.
En general, las neuronas mostraron diferentes tiempos de inhibición de la captación, desde -26
hasta 159 segundos. La figura 28 muestra que inmediatamente expuestas a AMPA las células en
promedio inhiben su captación y el tiempo de inhibición es muy negativo. Para obtener el tiempo
de retardo de la inhibición se requieren datos con menor ruido.
4.3.2.2 AMPA no provoca aumento del volumen neuronal.
Se ha descrito que el glutamato y AMPA pueden aumentar el volumen neuronal por su
facilitación de la entrada de sodio (Takahashi et al., 1999). Para controlar que la inhibición de la
captación de 2-NBDG en las neuronas por AMPA no fuera un artefacto producto del aumento del
volumen celular, se midió el efecto del AMPA sobre el volumen celular. Para ello, en el mismo
día se hizo tanto el protocolo de captación del azúcar en presencia de AMPA, como el control del
volumen celular en presencia del AMPA (Figura 29)
Para calcular la variación del volumen celular inducida por el AMPA se utilizó la respuesta
osmométrica en las neuronas y astrocitos (4.2.1.1 y Figura 8). A partir de los datos de
fluorescencia de cada experimento control, se calculó la variación de la fluorescencia de la
calceina antes y durante la exposición al AMPA (Fb / F) y este valor se introdujo en las fórmulas
de volumen celular correspondiente a cada tipo celular. De esta manera, fue posible obtener la
variación del volumen celular o Volumen relativo parcial (Osmb / Osm) que fue para las
neuronas de 1,00 ± 0,01 (n = 4 experimentos, 16 células) y para los astrocitos de 1,05 ± 0,02 (n =
3 experimentos, 5 células). Por lo tanto, el volumen de las neuronas y astrocitos frente al AMPA
aumenta en un 0 ± 1 % y 5 ± 2 % respectivamente.
Además, se efectuó otro control del volumen celular, pero esta vez utilizando 2-desoxiglucosa
(otro azúcar fosforilable similar al 2-NBDG) y en la mitad del curso temporal se agregó el
AMPA, no provocando aumento del volumen celular (n=2, experimentos desarrollados por Maite
Castro, datos no mostrados).
En conclusión, las mediciones de volumen celular mostraron que el efecto inhibitorio de AMPA
sobre la captación neuronal de 2-NBDG no es debido a una dilución de la sonda fluorescente.
FIGURA 28. AMPA inhibe agudamente el transporte de 2-NBDG en neuronas. Experimento
representativo de neuronas expuestas a AMPA en el curso de la captación de 2-NBDG. Los
puntos (● y ○) representan el promedio de 6 neuronas ± error estándar antes y durante la
exposición a AMPA. Los datos fueron ajustados a regresiones lineales utilizando Sigma Plot. La
señal de Fura red, inversa a la señal de calcio intracelular, presentó una señal mínimo mostrado
por la línea discontinua. El tiempo de inhibición en este experimento fue de -108 segundos.
FIGURA 29. Efecto del AMPA sobre el volumen de las neuronas. A, Efecto de AMPA sobre
el Ca2+. Las 9 neuronas cargadas con Fluo-3 se expusieron a KRH sin glucosa por 13 min; luego
sobre esta solución se añadió AMPA por 13 min. Se lavó el sustrato con KRH-glc, finalmente
como control positivo se expusieron a ionomicina. B, Efecto de AMPA sobre el volumen celular.
El mismo día experimental otro grupo de 6 neuronas previamente incubadas con calceina se
expusio al mismo protocolo, pero como control del aumento de volumen se usó una solución
hipotónica.
4.3.2.3 Exploración del mecanismo inhibitorio del transporte de 2-NBDG.
Se sabe que los receptores de AMPA conducen cationes monovaletes ( Na+, K+), llevando a una
despolarización de la membrana plasmática neuronal. El mecanismo por el cual podría verse
inhibido el transporte de 2-NBDG es representado en el siguiente esquema. Este denota que la
inhibición del transporte por AMPA podría ser directa o indirecta. Para dilucidar el mecanismo
inhibitorio en neuronas se tomaron dos caminos distintos, el primero aumentando el calcio
intracelular utilizando ionomicina (ionóforo altamente selectivo a calcio) y KCl (estímulo
despolarizante) y el segundo inhibiendo la entrada del calcio desde el medio extracelular hasta el
intracelular utilizando EGTA (un quelante de calcio), NMDG (un análogo del sodio) y CNQX
(bloqueador competitivo de los receptores AMPA / Kainato).
4.3.2.3.1 El aumento de Cai2+ por ionomicina o la despolarización no inhiben el transporte en
neuronas.
Las neuronas fueron expuestas a 2 μM ionomicina en la mitad del curso temporal, generando este
ionóforo un aumento del Cai2+ y, a su vez, un leve aumento no significativo del transporte que iba
desde 15 ± 1,4 en ausencia del ionóforo a 21 ± 2,2 nM / s (n = 3 experimentos, 17 neuronas) en
presencia de este (Figura 30).
Por otro lado, 40 mM de KCl no provocó ningún cambio significativo en el transporte de 2NBDG en 28 neuronas de 6 experimentos, siendo la velocidad de la captación basal de 23 ± 2,7 y
en presencia de KCl de 21 ± 4,8 nM / s (Figura 31).
4.3.2.3.2 El Na+, Ca2+ extracelular son necesarios pero no lo suficiente para la inhibición del
transporte.
El AMPA en ausencia de calcio extracelular, inducido por 10 mM EGTA provocó un leve
aumento no significativo de la velocidad del transporte que iba desde 25 ± 3,9 a 28 ± 6,6 nM / s
(n = 4 experimentos, 22 neuronas) en presencia de AMPA (Figura 32).
El CNQX, usado a 20 μM es un inhibidor competitivo reversible de los receptores de glutamato
tipo AMPA y Kainato (Clements et al., 1998). Esto es posible visualizarlo en la parte A de la
figura 34, en dónde CNQX bloqueó el aumento del Cai2+ en las neuronas provocado por AMPA.
Las neuronas incubadas con este inhibidor, mostraron un transporte basal de 21,65 ± 2,28 y en
presencia de AMPA de 21 ± 2,8 ( n = 2 experimentos, 9 células) (Figura 33). Este resultado
mostró que CNQX inhibe el efecto que AMPA provoca sobre el transporte de 2-NBDG en
neuronas
El AMPA provoca la entrada directa de calcio y sodio al interior de la célula, activando los
receptores de glutamato tipo AMPA, los cuales son de índole excitatorios, la apertura de los
receptores genera una entrada indirecta de sodio por medio de inducir la apertura de canales de
sodio dependientes de voltaje. Por esta razón, utilizamos NMDG, un análogo del sodio que no es
transportable ni permeable al interior de la célula. Como resultado se obtuvo que el transporte
basal en presencia de NMDG y ausencia de AMPA fue de 30 ± 3,3 y en presencia de NMDG y
de AMPA fue de 32 ±3,8 nM / s (n = 3 experimentos, 15 células) (Figura 34).
FIGURA 30. Efecto de ionomicina sobre el transporte de 2-NBDG en neuronas. A, Cinética
de transporte de 2-NBDG en un grupo de 8 neuronas expuestas a ionomicina, cada punto
representa el promedio de la señal de fluorescencia emitida ± error estándar. La aguda deflexión
de la señal de Fura-Red representa el aumento del Ca2+ dentro de las células. B, Las barras
corresponden al promedio ± error estándar de un grupo de 17 neuronas de 3 experimentos
distintos (t-student p > 0,05).
FIGURA 31. Efecto de KCl sobre el transporte de 2-NBDG. A, Curso temporal de un grupo
de 6 neuronas expuestas a un estímulo despolarizante, cada punto representa el promedio de la
señal de fluorescencia emitida ± error estándar. La aguda deflexión de la señal de Fura-Red
señala el aumento del Ca2+ dentro de las células. C, Las barras corresponden al promedio ± error
estándar de un grupo de 28 neuronas de 6 experimentos distintos (t-student pareado p > 0,05)
FIGURA 32. Dependencia de calcio del efecto inhibitorio producido por AMPA sobre el
transporte de 2-NBDG. A, Un grupo de 10 neuronas fue expuesto al protocolo de transporte del
azúcar y luego a 2-NBDG más EGTA en KRH, cada punto representa el promedio de la señal de
fluorescencia emitida ± error estándar. B, Las barras corresponden al promedio ± error estándar
de un grupo de 22 neuronas de 4 experimentos distintos (t-student pareado p > 0,05).
FIGURA 33. Efecto del bloqueador competitivo CNQX sobre el efecto de AMPA en el
transporte de 2-NBDG. A, Un grupo de 4 neuronas fue expuesto a CNQX, en su presencia se
hizo el protocolo de transporte y se añadió AMPA, cada punto representa el promedio de la señal
de fluorescencia emitida ± error estándar. B, Las barras corresponden al promedio ± error
estándar de un grupo de 7 neuronas de 2 experimentos distintos. Los experimentos fueron hechos
pareados (t-student pareado p > 0,05).
A
FIGURA 34. Dependencia de sodio del efecto inhibitorio producido por AMPA sobre el
transporte de 2-NBDG. A, En un grupo de 4 neuronas el Na+ extracelular fue reemplazado por
NMDG+ (KRH-NMDG), cada punto representa el promedio de la señal de fluorescencia emitida
± error estándar. B, Las barras corresponden al promedio ± error estándar de un grupo de 15
neuronas de 3 experimentos distintos (t-student pareado p > 0,05).
4.3.2.4 Mecanismo propuesto de inhibición del transporte por AMPA.
Estos resultados denotan que la inhibición de la velocidad de transporte inducida por el AMPA es
dependiente de calcio y de sodio, además, que requiere interactuar con su receptor
específicamente para que induzca la modulación. A su vez demuestra que el calcio por sí solo no
modula el transporte de 2-NBDG, como lo hace el AMPA. Se hizo una comparación entre el
porcentaje inhibitorio del AMPA por sí solo y en presencia de los antagonistas sobre el transporte
de 2-NBDG. Los resultados mostraron que hay diferencias significativas entre el efecto de
AMPA en condiciones normales y en ausencia de sodio y calcio extracelular y en presencia de
CNQX (Figura 35 A). Además, el aumento de calcio extracelular por ionomicina o KCl no
indujeron per se un efecto inhibitorio sobre el transporte de 2-NBDG en las neuronas (Figura 35
B). Por otro lado, la señal de fluorescencia de Fura-Red nos permitieron analizar el efecto del
calcio provocado por AMPA, ionomicina y KCl indicando que la respuesta de aumento del Ca2+
en un 50% aproximadamente en las neuronas fue constante (Figura 35 C). Con todo esto, el
modelo queda reducido al siguiente esquema, donde la entrada de Ca2+ secundaria a la activación
del receptor es necesaria pero no suficiente para la inhibición del transporte.
De acuerdo a los resultados mostrados el método directo de medición de transporte de hexosas
utilizando el azúcar fluorescente 2-NBDG mostró que en las neuronas el glutamato induce una
inhibición menor y no significativa del transporte. Resultados similares de inhibición fueron
encontrados al usar un análogo de los receptores de glutamato tipo AMPA, siendo esta inhibición
significativa. En los astrocitos la presencia de glutamato aumentó significativamente la captación
de este azúcar. Ambos tipos celulares mostraron modulación del transporte de tipo agudo del
orden de los segundos.
FIGURA 35. Inhibición del transporte de 2-NBDG en neuronas por agonistas y antagonistas y la
variación de la señal de calcio dada por estos. agonistas: AMPA, KCl, ionomicina; antagonistas:
EGTA, NMDG, CNQX. A, El número de neuronas expuestas a AMPA fue de 24 (n=7), 22 con
EGTA (n=4), 15 con NMDG (n=3), 9 con CNQX (n=2). Los asteriscos representan diferencia
significativa estadística con respecto al efecto provocado por el AMPA (ANOVA, Test de Dunn,
p < 0,05). B, Se registraron 17 neuronas expuestas a ionomicina (n=3), 28 a KCl (n=6). El
asterisco representa la diferencia significativa estadística con respecto al efecto de ionomicina
(Test de Man Whitney, p < 0.05). C, Disminución de la señal de Fura-Red calcio, se debió
corregir la contaminación de la señal de 2-NBDG en Fura-Red para obtener la señal de Fura-Red
real, descrito en Materiales y Métodos. Las barras representan valores promedio ± error estándar.
*
*
*
5. DISCUSION
En este trabajo se evaluó si el glutamato induce un aumento del transporte de glucosa en
neuronas. Nuestros resultados mostraron que en las neuronas el transporte de 2-NBDG ante un
estímulo excitatorio generado por el glutamato fue inhibida. Esta inhibición se estudió usando
AMPA mostrando resultados similares de inhibición del transporte. AMPA requiere de calcio y
sodio para su efecto sobre el transporte. Como resultado adicional observamos que en los
astrocitos se estimuló el transporte ante la exposición a glutamato, siendo esta de carácter agudo.
El método para medir transporte a nivel de célula única fue importante para estudiar el transporte
en células de cultivos mixtos debido a que los métodos convencionales utilizan radioisótopos que
requieren poblaciones celulares homogéneas. Además nuestro método de elección permitió hacer
experimentos “antes-después” sobre las mismas células sin necesidad de destruirlas para cada
punto como es requerido al utilizar los métodos con radioisótopos. El método volumétrico
utilizado nos permitió medir las velocidades en condiciones basales de las neuronas y astrocitos
(Figura 9 y 10). Sin embargo, debido a la disposición espacial en que crecen ambos tipos de
células situándose en planos distintos (Figura 2), la medición del transporte de galactosa en el
mismo campo óptico en neuronas y astrocitos se hacía técnicamente difícil más aún ante los
cambios de volumen inducidos por la concentración elevada del azúcar. Por estas razones
planteadas decidimos utilizar el método de 2-NBDG con características menos invasivas (Figura
11). Las bajas velocidades de transporte de este azúcar por neuronas como por astrocitos
permitieron medir la velocidad en condiciones zero-trans a temperatura ambiente, permitiendo
monitorear los cambios rápidos en tiempo real de la velocidad bajo condiciones experimentales.
Las neuronas de nuestros cultivos mixtos hipocampales transportaban 300 μM 2-NBDG a una
velocidad de 13 ± 0,6 nM / s, velocidad muy lenta comparada a tasas de transporte de azúcares
marcadas radiactivamente (Tabla 2). Este resultado se relaciona con la bajísima velocidad de
transporte de 6-NBDG, el cual es transportado a 24 ºC 3.300 veces más lento que 3OMG a 4 ºC
(Cloherty et al., 1995).
En neuronas el transporte de 2-NBDG mostró ser inhibida parcialmente pero significativamente
por citocalasina-B y por floretina (Figuras 15, 16). Estos últimos resultados demostrarían que 2NBDG ingresa por al menos dos vías, una específica, es decir, por transportadores facilitativos de
glucosa y una inespecífica, es decir, difusión simple. Por otro lado, 20 ó 100 mM glucosa inhibió
el transporte sólo en algunas neuronas pero en promedio no inhibió (Figura 17). La difusión
simple de 2-NBDG fue de menor magnitud que la difusión facilitada por GLUTs, debido a que
fueron detectables los fenómenos de inhibición y modulación, así como sucedió con los
inhibidores citocalasina-B, floretina (Figura 15 y 16) y los moduladores del transporte glutamato
y AMPA (Figuras 23 y 26). En el caso de que las tasas basales fueran casi iguales a la difusión
simple, no sería posible ver modulación del transporte. De esta manera se explicaría porque la
glucosa no inhibe la tasa de transporte en promedio de las células. Sin embargo, al comparar las
tasas de transporte basales entre las células que respondieron a AMPA, glutamato, citocalasina-B
y floretina con las células expuestas a glucosa podemos concluir que la tasa basal promedio de las
células expuestas a glucosa como competidor no fue menor a las otras, siendo entonces esperable
que sea inhibida el transporte en presencia de glucosa (Anexo 2). En contraste con estos
resultados, recientemente nuestro laboratorio ha estado estudiando el transporte de 6-NBDG en
botones sinápticos, siendo inhibida esta por 20 mM glucosa en un 85 ± 12 % (n=5) (Porras et al,
2002). En estos resultados las condiciones experimentales fueron las mismas usadas en esta tesis.
Por lo tanto, la respuesta de por qué la glucosa no inhibe el transporte de 2-NBDG en los somas
neuronales queda aún sin contestar estando sujeta a estudios futuros.
No ha sido estudiado con anterioridad el efecto del glutamato sobre el transporte en neuronas
cultivadas en asociación con astrocitos. La inhibición no significativa del transporte en neuronas
por glutamato (Figura 22 A y C) fue estudiada usando AMPA, dando resultados similares de
inhibición, pero a un porcentaje mayor y estadísticamente significativa en un 75 % (Figura 26).
Según nuestros resultados, la entrada de calcio secundaria a la activación del receptor no es
suficiente para la inhibición del transporte. La insuficiencia de calcio se mostró con la
permeabilización de la membrana neuronal por ionomicina y con la despolarización por KCl
(Figuras 30y 31), estimulando levemente ionomicina y KCl no produciendo ningún cambio sobre
el transporte. Resultados anteriores obtenidos en nuestro laboratorio mostraron que el calcio
citosólico representa un papel permisivo sobre el transporte de 2-desoxiglucosa, mostrando que
los niveles de calcio extracelular inhibían a concentraciones bajas, estimulaban a concentraciones
altas o no afectaban el transporte a niveles suprafisiológicos (Quintanilla et al., 2000b). En este
caso, el aumento de Cai2+ inducido por AMPA, ionomicina y KCl eran del mismo orden (baja,
alta o suprafisiológica) (Figura 35), no relacionándose con provocar un mismo efecto, lo cual se
explicaría por la relevancia de la acción de los sustratos más bien que por el calcio. Por lo tanto,
se concluyó que el glutamato inhibe el transporte de 2-NBDG por interacción con su receptor,
seguido de la entrada de sodio por los receptores de glutamato y la entrada de calcio, siendo
independiente de la despolarización. También es posible que el glutamato estimule de manera
directa sobre el transportador provocando en el algún proceso que inhiba el transporte de la
hexosa. Mecanismos de inhibición del transporte de glucosa en neuronas hipocampales han sido
estudiados anteriormente. Por ejemplo, la exposición al péptido β-amiloide provoca inhibición de
el transporte de glucosa en neuronas como producto de la inhibición en la translocación de
GLUT3 a la membrana neuronal (Prapong et al., 2002), siendo esta una posibilidad interesante de
analizar para comprender el mecanismo de inhibición provocado por AMPA.
Los astrocitos participan estrechamente en el soporte metabólico de las neuronas (Laming et al.,
2000), participación que se hace más activa cuando la actividad sináptica es incrementada (Figura
36).
En
estas
condiciones
los
astrocitos
incrementan
su
velocidad
de
glicólisis
(PellerinyMagistretti, 1994). Se postula que después de la liberación desde los astrocitos, el
lactato producido es tomado por las neuronas vía transportadores específicos de
monocarboxilatos y usado como sustrato energético al ser oxidado completamente a CO2
generándose ATP que sirve como combustible para la restauración de los gradientes iónicos,
cerrándose el ciclo (PellerinyMagistretti, 1994;PellerinyMagistretti, 2003;Sokoloff, 1999). Los
resultados de este trabajo demostraron que el transporte de 2-NBDG es estimulada
significativamente ante glutamato (Figura 22) en un 186 ± 10 % (Figura 23) y de manera aguda
(Figura 24). Se había descrito con anterioridad estimulaciones rápidas de GLUT, por ejemplo
trombina activa la translocación de GLUT3 en plaquetas con un t1/2 de 1 a 2 min (Sorbara et al.,
1997), con nuestro método desarrollado de medición del transporte de azúcar establecimos que la
estimulación del transporte, por efecto del glutamato, en astrocitos puede ser aún más rápida (9 ±
3 s). GLUT1 es la única isoforma conocida que expresan los astrocitos corticales (Tabla 1)
(Vannucci et al., 1997), de esta manera se puede inferir que la estimulación del transporte de
glucosa causada por glutamato podría ser producto de la estimulación de GLUT1. Resultados
recientes de nuestro laboratorio han mostrado que el transporte de 6-NBDG, análogo fluorescente
no fosforilable de glucosa, es estimulada al igual que 2-NBDG por glutamato en astrocitos y
también el transporte de galactosa (modificación del método volumétrico) concluyendo que la
Vmax del transportador es estimulada (Loaiza et al., 2003).
Los mecanismos bioquímicos involucrados en la estimulación de GLUT1 por glutamato están
actualmente en investigación. Uno de los candidatos es el sodio, debido a que la activación
glicolítica por glutamato requiere la entrada de este ión a través de los transportadores de
glutamato seguido de su eliminación por la bomba Na+/K+ATPasa (Figura 36) (Pellerin y
Magistretti, 1997). Otros candidatos comprenden las múltiples vías conocidas que median la
estimulación de GLUT1 por estrés celular en otros tipos de células. Estos incluyen el calcio
(Quintanilla et al., 2000b), la proteína quinasa activada por AMP, AMPK (Abbud et al.,
2000;Barnes et al., 2002), p38MAPK (Barros et al., 1997), y fosfolipasa-C (PrasadyIsmail-Beigi,
1999). Todas estas vías de señalización afectan la Vmáx de GLUT1, fenómeno que se condice con
los resultados expuestos arriba, sin embargo, no ha sido posible determinar los cambios
bioquímicos que le ocurren al transportador en sí. Dada la rapidez de la estimulación por
glutamato en astrocitos, los cuales expresan abundantemente en su superficie GLUT1 (Figura %
A, superior), este sería un sistema celular atractivo para estudiar los mecanismos de estimulación
de GLUT1.
La estimulación provocada por glutamato en astrocitos se contrapone con la inhibición en
neuronas (Figura 22 A y C), siendo este un fenómeno no descrito hasta ahora. El actual modelo
contempla que la utilización de glucosa en condiciones de alto consumo energético es aumentada
en astrocitos, los cuales comunican metabolitos intermediarios de la glicólisis a neuronas,
(Magistretti et al., 1999), pero no se analiza la situación neuronal. En condiciones de mayor
actividad neuronal el gasto de ATP aumenta y una forma de generar energía es que los astrocitos
aumenten su utilización de glucosa aneróbicamente produciendo lactato, siendo este luego
consumido por las neuronas, siendo lactato el principal metabolito consumido por las neuronas
en actividad neuronal. En condiciones de reposo eléctrico la glucosa metabolizada
anaeróbicamente por los astrocitos produce 2 lactatos por glucosa consumida, generando en las
neuronas que hayan incorporado y consumido completamente el lactato a CO2, 36 ATP, la
misma energía producida por el consumo de 1 glucosa por las neuronas (Magistretti et al., 1999).
Por lo tanto, en condiciones de mayor actividad neuronal la utilización de glucosa aumentada en
astrocitos haría dispensable el transporte de glucosa por GLUTs de parte de las neuronas.
Nuestros resultados apoyan este modelo, añadiendo que el transporte de glucosa se detiene o
inhibe. Sin embargo, existe controversia si el lactato es el sustrato preferido por las neuronas en
condiciones de aumento de la actividad neuronal. Resultados contrarios abogan por la glucosa
como sustrato primordial al momento de aumentar la actividad neuronal (Chih et al., 2001), como
la alta densidad de transportadores GLUT3 encontradas en los terminales sinápticos neuronales.
Debido a que esta tesis se enfocó en el transporte de 2-NBDG a nivel de los somas neuronales no
es posible descartar una respuesta estimulatoria en los terminales sinápticos ante glutamato,
siendo esta una posibilidad interesante de investigar.
En base a los resultados expuestos en esta tesis es posible concluir:
El glutamato no provoca una estimulación del transporte de 2-NBDG en neuronas.
El glutamato provoca una inhibición aguda del transporte de 2-NBDG en las neuronas mientras
provoca una estimulación rápida del transporte de esta hexosa en los astrocitos (Figura 37).
La entrada de calcio y de sodio fueron factores necesarios pero no suficientes para la inhibición
por AMPA.
TABLA 2. Velocidades de transporte de hexosas en neuronas.
Referencia
Parámetros cinéticos
Velocidad de
transporte en célula
única calculada
(300μM)
1
(Maher et al., 1996)
Hexosa / TºC
Km
Vmáx
3OMG / 25ºC
2,9 mM
19 nmol/min/106 células
1,02 μM / s (2.9pl)
2
(Hara et al., 1989)
23HDG / 37ºC
1,7 mM
18 nmol/min/mg prot
0,31 μM / s (2.9pl)
3
(Heidenrich et al., 1989)
23HDG / 37ºC
0,7 mM
3 fmol/min/cell
16 μM / s (3,2 pl)
En el primer y segundo caso se asumió un volumen neuronal de 2,9 pl (Hooper et al., 2002) y que
106 células contienen 20 μg de proteína totales de membrana (Maher et al., 1996). Así, se obtuvo
la Vmáx expresada en unidades de micromolar por segundo e introdujo los parámetros cinéticos
correspondiente a la referencia en la fórmula de Michaelis-Menten V = Vmáx * S / (S + Km) para
obtener la velocidad de transporte a 300 μM. En el tercer caso el volumen neuronal usado fue 3,2
pl (Heidenrich et al., 1989). Se hizo el mismo reemplazo para la obtención de la velocidad de
transporte.
FIGURA 36. Esquema del mecanismo para la glicólisis en astrocitos durante activación
fisiológica. En las sinápsis glutamatérgicas el glutamato (glu) despolariza la membrana neuronal.
La acción del glu es finalizada por un eficiente sistema de transporte de glu localizado
principalmente en los astrocitos. El glu es cotransportado con Na+, aumentando intracelularmente
lo que conduce a la activación de la bomba de Na+/K+-ATPasa. La bomba, debido al gasto de
ATP, activa la glicólisis, lo cual llevaría a activación de glicólisis y producción de lactato en
astrocitos. El lactato una vez liberado puede ser tomado y utilizado como sustrato energético por
las neuronas. El proceso de transporte de lactato además de ocurrir en el terminal presináptico
también podría ser en el postsináptico. Este modelo, refleja los eventos celulares y moleculares
ocurridos en la glicólisis inducida por glutamato. A, activación; B, condiciones basales; Pyr,
piruvato; Lac, lactato; Gln, glutamina; G, proteína de unión al nucleótido guanina.(Esquema
obtenido de Pellerin y Magistretti, PNAS USA. 91, 1994).
FIGURA 37. Hipótesis versus resultado. La hipótesis inicial se centraba en la estimulación del
transporte de glucosa en neuronas por efecto de glutamato. Los resultados indicaron que en las
neuronas se inhibe del transporte (-) de glucosa y como hallazgo adicional se observó que en los
astrocitos se estimula el transporte deglucosa por glutamato. Transportadores GLUTs (círculos
grises).
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ANEXOS
ANEXO A. Criterio alternativo de estimación de la transporte
de 2-NBDG.
La fórmula usada para estimar la tasa de transporte de 2-NBDG en esta tesis considera al
alza inicial como contaminación de la señal extracelular en la señal intracelular. Esto debido a un
experimento control utilizándo la sonda fluorescente calceina, no transportable, que igualmente
presentó ese alza inicial. Como criterio alternativo para determinar el transporte de 2-NBDG, en
nuestro laboratorio, se hizo una modificación a la fórmula ya mencionada, la cual considera el
alza inicial como significativa.
La fórmula usada (1) en este trabajo de tesis y la alternativa (2) se describen abajo. Nótese que en
la fórmula 2 el alza inicial, Fit=0, se resta de la fluorescencia extracelular.
Fórmula (1): % transporte = 100 * (Fit=t - Fit=0) / (Fe - Feo)
Fórmula (2): % transporte = 100 * (Fit=t - Fit=0) / (Fe + Fib - Feo - Fit=0)
A partir de los gráficos de los cursos temporales de transporte de 2-NBDG en neuronas se
obtuvieron los parámetros “a” equivalente a Fib - Feo , “b” equivalente a Fit=0 y “c” equivalente a
Fe - Feo siendo expresados en milímetros.
TABLA A. Parámetros medidos a partir de la señal de 2-NBDG en neuronas.
parámetros (mm)
Fecha / nºexp
a
b
c
26 06 01exp1
5
12
42
7 07 01 exp1
1
9
41
7 07 01 exp2
1
7
49
9 07 01
1
5
39
10 07 01
1
3.5
35
11 07 01
3
6
41
7 08 01
2
6
45
25 10 01 exp1
1
4
46
25 10 01 exp2
2
5
50
08 02 02 exp1
1
3
25
08 02 02 exp2
1
2.5
25.5
11 02 02 exp1
1
3
20
11 02 02 exp2
1
4
36
13 02 02 exp5
0.5
3
25
11 03 02 exp1
0
2
26
11 03 02 exp2
1
4
33
15 03 02 exp1
2
5
40
15 03 02 exp2
2
5
39
15 03 02 exp3
1
4
35
29 03 02 exp3
1
4
31
08 04 02 exp1
1
3
22
08 04 02 exp2
1
4
34
08 04 02 exp3
1
4
27
12 06 02
1
4
24
16 09 02 exp1
1
3.5
36.5
16 09 02 exp2
1
4
32
16 09 02 exp3
1
6
46
16 09 02 exp4
1
5
35
20 09 02 exp1
1
3.5
32.5
24 10 02 exp1
1
6
35
24 10 02 exp2
1
5
31
24 10 02 exp3
1
4
33
25 10 02 exp2
1
5
34
29 10 02 exp1
1
8
30
29 10 02 exp3
1
5
32
29 10 02 exp4
1
4.5
30
30 10 02 exp1
1
7
43
31 10 02 exp1
1
6
37
31 10 02 exp2
1
6
43
11 11 02 exp1
1
4
31
11 11 02 exp2
1
6
41
18 11 02 exp2
1
7
41
18 11 02 exp3
1
5
49
14 11 02
1
7
37
16 11 02 exp1
1
6
41
16 11 02 exp2
1
7
40
16 11 02 exp3
1
6
40
16 11 02 exp4
1
8
40
01 12 02 exp1
1
4
26
01 12 02 exp2
1
6
26
07 12 02 exp1
1
3
20
20 12 02 exp3
1
6
48
20 12 02 exp4
1
10
37
20 12 02 exp5
1
6
32
20 12 02 exp6
1
4
30
Promedio
1.155
5.191
35.26
error estandar
0.09
0.255
1.027
n experimentos
55
Cálculo del porcentaje en que la fórmula 1 subestima el transporte con respecto a la
fórmula 2.
Reemplazo de los promedios en ambas fórmulas
Fórmula (1) % transporte = 100* (Fit=t - b) / c
= 100* (Fit=t - 5,1) / 35,2
Suponiendo que Fit=1 = 10 el % transporte = 13,9 %
Suponiendo que Fit=2 = 20 el % transporte = 42,3 %
Entonces, Fit=2 - Fit=1 = 28,4 %
Fórmula (2) % transporte = 100* (Fit=t - b) / c + a + b
= 100* (Fit=t - 5,1) / (35,2 + 1,1 - 5,1)
= 100* (Fit=t - 5,1) / 31,2
Suponiendo que Fit=1 = 10 el % transporte = 15,7 %
Suponiendo que Fit=2 = 20 el % transporte = 47,7 %
Entonces, Fit=2 - Fit=1 = 32 %
La diferencia entre la fórmula (1) y (2) es de 11,5 %.
Conclusión: En promedio la fórmula (1) subestima la tasa de transporte en un 11,5 % respecto a
la (2), que considera al alza inicial.
ANEXO B. La falta de inhibición de la transporte de 2-NBDG
por glucosa en neuronas no es debida a una posible tasa basal
menor en ese grupo experimental.
TABLA B. Velocidades de transporte de 2-NBDG en neuronas expuestas a distintos inhibidores.
transporte basal
(M /s)
transporte inhibido
inhibidor
(M / s)
p
20 ± 2,0
20 μM AMPA
5,1 ± 1,4
< 0,05
44 ± 13
500 μM glu
25 ± 5,8
> 0,05
13 ± 1,4
20 μM cito-B
9,0 ± 1,0
< 0,05
17 ± 1,5
50 μM floretina
10 ± 1,7
< 0,05
26 ± 4,0
100 μM glucosa
29 ± 5,5
> 0,05
Los datos se expresan como promedio ± error estándar. 20 μM AMPA (28 células, n=6),
glu: 500 μM glutamato (15 células, n=6), 100 mM glucosa (13 células, n=4), cito-B: 20 μM
citocalasina-B (20 células, n=4), flore: 30 μM floretina (8 células, n=2).