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PROCEDIMIENTO PARA REALIZAR
CONCENTRACION DE VIRUS ENTERICOS
(NOROVIRUS Y HEPATITIS A) EN
MOLUSCOS BIVALVOS
Sección Microbiología
de Alimentos
1.
PRT- 712.07.01-098
Fecha emisión:
07-06-2011
Revisión: 0
Fecha revisión:
07-06-2011
Página 1 de 5
OBJETIVO
Realizar concentración viral desde muestras de moluscos bivalvos para su posterior análisis de
presencia de Norovirus y Hepatitis A.
2.
CAMPO DE APLICACIÓN Y ALCANCE
Este procedimiento se aplica a la preparación de muestras de mariscos para la extracción de
virus.
3.
FUNDAMENTO
Es ampliamente conocido que los moluscos son una importante fuente de transmisión de
patógenos humanos (bacterianos y virales).
Uno de los principales obstáculos en la detección de virus en alimentos de origen marino es que
no puede ser enriquecido en la matriz. Como son organismos concentradores se trabaja con el
hepatopancreas.
El método consiste en liberar las partículas virales de a la carne para eliminar inhibidores. Una
vez que el virus se encuentra liberado de la matriz es sometido a ultracentrifugación para obtener
un pellet con las partículas virales, el cual es sometido a una extracción con cloroformo y
finalmente concentrado por ultracentrifugación. Finalmente antes de su detección molecular por
PCR en tiempo real (qPCR) se somete a una etapa de extracción.
4.
REFERENCIAS
4.1
Entrenamiento en Vibrios and Viruses in Seafood, a cargo de U. S. Food and Drug
Administration en Gulf Coast Seafood Laboratory, Dauphin Island, Alabama. 15 -19
Noviembre 2010. Proyecto Corfo 09CN14-5951.
5.
TERMINOLOGÍA
No Aplica
6.
MATERIALES, INSUMOS Y EQUIPOS
6.1
Materiales
6.1.1
Placas Petri estéril.
6.1.2
Herramienta estéril para apertura de bivalvos.
6.1.3
Bolsas de stomacher
6.1.4
Tubos cónicos de 50 mL
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6.1.5
Tubos de 70 mL para ultracentrífuga.
6.1.6
Pipetas de 10 o 20 mL.
6.1.7
Hielo picado
6.1.8
Micropipetas de 1000 µL
6.1.9
Microtubos de 1,5 mL.
6.2
HCl 6 N
6.2.2
Agua destilada estéril en volúmenes de 100 mL
6.2.3
Buffer glicina 0,75 M / NaCl 0,15 M.
6.2.4
Norovirus murino (Control de extracción)
6.2.5
NaOH 5 N
6.2.6
PBS estéril.
6.2.7
Cloroformo.
Equipos
6.3.1
Frezzer -20ºC
6.3.2
Balanza
6.3.3
Centrifuga refrigerada
6.3.4
Peachimetro
6.3.5
Ultracentrífuga refrigerada
7.
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07-06-2011
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Reactivos
6.2.1
6.3
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DESARROLLO
7.1
Las muestras de bivalvos pueden ser procesadas inmediatamente una vez recibidas o
pueden se almacenadas a -20ºC por meses.
7.2
Si las muestras están congeladas, proceder a su descongelación por toda la noche.
7.3
Abrir la ostra y depositar el cuerpo de ésta sobre una placa Petri estéril.
7.4
Utilizando pinzas y bisturí estéril separar el estómago dejando éste lo mas limpio posible
de restos de grasa.
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7.5
Repetir 7.1 con las unidades necesarias para reunir 4 gramos de muestra. Depositar la
muestra en un tubo cónico de 50 mL.
7.6
Agregar 40 mL de agua destilada estéril, o la suficiente para mantener la relación 1/10
muestra/agua.
7.7
Agregar 5 uL de control de extracción.
7.8
Moler brevemente en Blender (20 segundos aproximadamente) y trasladar el
homogenizado al tubo cónico.
7.9
Ajustar el pH entre 4,0 a 5,0 agregando gotas de HCl 6 N. (1 gota aprox.)
7.10
Centrifugar a 2000 x g durante 15 minutos a 4ºC.
7.11
Descartar el sobrenadante.
7.12
Resuspender el pellet en 40 mL de glicina 0,75M / NaCl 0,15 M.
7.13
Ajustar el pH entre 7,5 y 7,8 agregando gotas de NaOH 5 N (1 gota prox.)
7.14
Centrifugar a 5000 x g durante 15 minutos a 4ºC.
7.15
Utilizando pipeta, trasladar el sobrenadante a un tubo de ultracentrífuga de 70 mL, y
mantener el tubo en hielo.
7.16
Resuspender el pellet en 20 mL de Treonina 0,5 M / NaCl 0,15 M (relación peso inicial
muestra/Buffer 5X).
7.17
Centrifugar a 5000 x g durante 15 minutos a 4ºC.
7.18
Retirar el sobrenadante y combinarlo con el que se dejó en el tubo de ultracentrífuga.
7.19
Pesar los tubos y sus tapas y balancear con PBS. La diferencia de peso entre uno y otro
tubo no debe superar los ± 0,05 g.
7.20
Luego de balancear los tubos, centrifugar por 1 hora a 170.000 x g a temperatura de
refrigeración.
7.21
Descartar el sobrenadante y resuspender el pellet en 5 mL de PBS.
7.22
Trasladar la suspensión a un tubo cónico de 50 mL.
7.23
Agregar 5 mL de cloroformo y vortear por 1 minuto.
7.24
Centrifugar a 1700 x g durante 15 minutos a 4ºC.
7.25
Transferir la capa superior acuosa a un tubo limpio de ultracentrífuga.
7.26
Agregar 5 mL Treonina 0,5 M / NaCl 0,15 M, pH 7,5 al tubo con cloroformo y vortear
por 1 minuto.
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7.27
Centrifugar a 1700 x g durante 15 minutos a 4ºC.
7.28
Transferir la capa superior acuosa al tubo de ultracentrífuga del punto 7.20.
7.29
Agregar 30 mL de PBS para eluir. El volumen mínimo para ultracentrífuga en tubo de70
mL es de 37 mL.
7.30
Pesar los tubos y sus tapas y balancear con PBS. La diferencia de peso entre uno y otro
tubo no debe superar los ± 0,05 g.
7.31
Luego de balancear los tubos, centrifugar por 1 hora a 170.000 x g a temperatura de
refrigeración.
7.32
Descartar el sobrenadante y resuspender el pellet viral en 800 µL de PBS.
7.33
Repartir la suspensión en alícuotas de 200 mL en 4 tubos.
7.34
Si no se realiza la extracción de RNA inmediatamente, almacenar a -70 ºC.
7.35
Rotular los tubos y registrar en RG-712.00-124.
8.
8.1
9.
REGISTROS
Registro concentración de virus entéricos, RG-712.00-124
ANEXOS
Anexo Nº1 Registro concentración de virus entéricos, RG-712.00-124.
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Anexo Nº1 Registro concentración de virus entéricos, RG-712.00-124.
Identificación de la muestra:
Nº:...................................Tipo de muestra :.......................................................Analista..................................................
Fecha y hora de recolección.............................................Fecha y hora de análisis:.........................................................
Rotulo extracto:
Tubo 1
Tubo 2
Tubo 3
Tubo 4