Download Método de detección de Norovirus y Hepatitis A

MÉTODO DE DETECCIÓN DE NOROVIRUS Y HEPATITIS A
Mercedes Álvarez García
Servicio de Microbiología Alimentaria
CNA (AECOSAN)
Jornadas de Referencia sobre Análisis de Alimentos
Centro Nacional de Alimentación
Majadahonda, 11 junio 2014
Centro
Nacional de
Alimentación
VIRUS
Parásitos intracelulares
obligados
Infección a dosis muy
bajas
Resistentes a condiciones
ambientales
Centro
Nacional de
Alimentación
VIRUS ENTÉRICOS
Hábitat
Ruta de
transmisión
Presentes en
aguas residuales
• Intestino de humanos y animales
• Oral - Fecal
• Vertidos (ríos, lagos y mares)
Centro
Nacional de
Alimentación
• ARNss +
• Grupo de riesgo 2
• Incubación: 4
semanas
• Síntomas: Fiebre,
náuseas, vómitos,
diarrea, ictericia
• Duración: meses
• No estacional
Norovirus
Hepatitis A
Virus de la Hepatitis A y Norovirus
• ARNss +
• Grupo de riesgo 2
• Incubación: 1 - 4
días
• Síntomas: Fiebre,
náuseas, vómitos,
diarrea
• Duración: 2 días
• Estacional: Invierno
Centro
Nacional de
Alimentación
MOLUSCOS BIVALVOS
Sedimento marino
Acumulación
de virus en
el aparato
digestivo
Aguas superficiales
Riesgo
consumo
Centro
Nacional de
Alimentación
Método de detección de HAV y NoV en
moluscos bivalvos
ISO/TS 15216:2013
Microbiología de los alimentos para consumo
humano y animal. Método horizontal para la
detección de virus de la hepatitis A y norovirus en
alimentos utilizando RT-PCR en tiempo real.
Parte 1: Método para la determinación cuantitativa
Parte 2: Método para la determinación cualitativa
Centro
Nacional de
Alimentación
Método de detección de HAV y NoV en
moluscos bivalvos
1. Extracción del virus
2. Extracción del ARN viral
3. RT-PCR en tiempo real
Centro
Nacional de
Alimentación
Método de detección de HAV y NoV en
moluscos bivalvos
1. Extracción del virus
2. Extracción del ARN viral
3. RT-PCR en tiempo real
Centro
Nacional de
Alimentación
1. Extracción del virus
Hepatopáncreas (glándula digestiva):
zona preferente de bioacumulación del virus
2g
hepatopáncreas
Lisis de los tejidos
del animal
1 h, 37ºC
2 ml
proteinasa K
y
liberación de las
partículas virales
Centro
Nacional de
Alimentación
Método de detección de HAV Y NoV en
moluscos bivalvos
1. Extracción del virus
2. Extracción del ARN viral
3. RT-PCR en tiempo real
Centro
Nacional de
Alimentación
2. Extracción del ARN viral
Lisis
Lavados
Elución
Centro
Nacional de
Alimentación
Método de detección de HAV Y NoV en
moluscos bivalvos
1. Extracción del virus
2. Extracción del ARN viral
3. RT-PCR en tiempo real
Centro
Nacional de
Alimentación
3. RT-PCR en tiempo real
RT Master Mix
ARN viral
5´
ARN viral
RT
PCR Master Mix
ADNc
3´
RT Master Mix
RT
5´
3´
ARN viral
3´
5´
PCR Master Mix
RT y PCR
ADNc
PCR
PCR
3´
5´
5´
3´
RT-PCR en un paso
RT-PCR en dos pasos
Centro
Nacional de
Alimentación
3. RT-PCR en tiempo real. Primers y sondas
Norovirus GI
5291 CGCTGGATGC GCTTCCATGA CCTCGGATTG TGGACAGGAG ATCGCGATCT TCTGCCCGAA TTCGTAAATG ATGATGGCGT CTAAGGACGC
NVGG1p
QNIF4
NV1LCR
Norovirus GII
5011 AATGTTCAGA TGGATGAGAT TCTCAGATCT GAGCACGTGG GAGGGCGATC GCAATCTGGC TCCCAGTTTT GTGAATGAAG ATGGCGTCGA
QNIF2
COG2R
QNIFS
Hepatitis A
61 TGATACCTCA CCGCCGTTTG CCTAGGCTAT AGGCTAAATT TTCCCTTTCC CTTTTCCCTT TCCTATTCCC TTTGTTTTGC TTGTAAATAT TAATTCCTGC
HAV150HAV68
171 AGGTTCAGGG TTCTTAAATC TGTTTCTCTA TAAGAACACT CATTTTTCAC GCTTTCTGTC TTCTTTCTTC CAGGGCTCTC CCCTTGCCCT
HAV240
Centro
Nacional de
Alimentación
3. RT-PCR en tiempo real. Condiciones
RNA UltraSense™ OneStep Quantitative RTPCRSystem
RT
1 hora 55ºC
PCR
5 min 95ºC
15 seg 95ºC
1 min 60ºC x45
1 min 65ºC
x45
Centro
Nacional de
Alimentación