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LABORATORIO DE BIOQUIMICA I
PRÁCTICA 8
ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LA LACASA DE HONGOS
INTRODUCCIÓN
Para la obtención de enzimas intracelulares a partir de microorganismos, se pueden usar
algunas técnicas para lograr la lisis celular, por ejemplo el rompimiento mecánico, presión
celular, sonicación, choque osmótico y rompimiento químico. Los hongos macroscopicos,
poseen un sistema multienzimático sofisticado, que les permite desdoblar los nutrientes. Este
sistema enzimático sofisticado es capaz de romper enlaces altamente polimerizados. Las
principales enzimas que son causantes esta despolimerización son la Manganeso peroxidasa,
Lignino peroxidasa, superoxido dismutasa y la lacasa. Estas enzimas se encuentran en hongos
con una capacidad ligninolitica avanzada.
OBJETIVO
Que el alumno aprenda a calcular las curvas de progreso a partir de la oxidación de un sustrato
por medio de un extracto crudo enzimático del hongo seta y champiñón
MATERIALES
1 Espectrofotómetro
12 Tubos con tapa de rosca
2 Celdas para espectrofotómetro
1 Gradilla para tubos
2 Pipeta Pasteur
1 Probeta de 100 mL
REACTIVOS
3 Vasos de precipitados de 100 mL
2,6 Dimetoxifenol (DMP) (Sustrato1)
1 Micropipeta de 1000 y 200µL
ABTS (sustrato 2)
1 Piceta con agua destilada
Fosfato de sodio monobasico
1 Vortex
Fosfato de sodio dibasico
2 Matraces aforados de 100 mL
HONGOS (equipo 2)
1 Agitador magnético
Hongo seta (2 hongos)
1 Palangana
Hongo champiñon (2 hongos)
PREPARACIÓN DE SOLUCIONES (EQUIPOS 2)
A. Solución amortiguador de fosfatos 50 mM, 1000mL pH 6.
B. Solución de 2,6 dimetoxifenol (2,6DMP) 0.5 mM, 250 mL en amortiguador de fosfatos
pH6.
C. Solución de ABTS 5 mM, 250 mL en amortiguador de fosfatos pH6.
PROCEDIMIENTO
Ensayo enzimático
D. Colocar los hongos por separado en un mortero, macerarlos con 50 mL de amortiguador
de fosfatos hasta obtener un macerado homogeneo.
E. Centrifugar a 10000 rpm los dos extractos y obtener el sobrenadante, llevar este al aforo de
100 mL.
F. Equipos nones utilizaran Extracto de Seta y los equipos pares utilizaran extracto de
champiñon.
G. Disponer 5 tubos de ensaye: Al tubo 1 adicionarle 2.7 mL de extracto enzimático. Al tubo
2 adicionarle 2.7 mL de extracto enzimático y 2.7 de amortiguador de fosfatos y
homogeneizar. Tomar 2.7 del tubo 2 y adicionarlo al tubo 3, junto con 2.7 mL de
amortiguador. El procedimiento es sucesivo para los siguientes tubos, por lo cual la
concentración de cada tubo será de la mitad del anterior. Prepare un tubo blanco con 2.7
mL de amortiguador de fosfatos y adicione 0.3 mL del sustrato correspondiente y
calibre el espectrofotómertro (tubo 0).
PRACTICA 8: ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LA LACASA DE HONGOS
LABORATORIO DE BIOQUIMICA I
H. Encender y elegir la opción de “cinética” en el espectrofotometro con la siguientes
condiciones: Para la determinación con ABTS a λ=420 nm y con 2,6-DMP a λ=469 nm,
tiempo de retardo = 0 minutos, intervalos de 25 segundos, tiempo total 5 minutos.
I. Una vez preparados todos los tubos, ajustar el blanco espectométrico (tubo 0) y
adicionar al tubo 1 la cantidad de 0.3 mL de sustrato, agitar rápidamente y anotar las
lecturas cada 25 segundos hasta que se cumplan los 5 minutos.
J. Una vez concluido el tiempo efectuar el mismo procedimiento anterior para el tubo 2 y los
demás tubos.
Ensayo de Proteina (Bradford)
Por otro lado, en otros tubos efectuar 3 diluciones para los extractos de hongo hasta obtener
un volumen final de 800µL de extracto. Una vez efectuadas las diluciones, se adicionan 200µL
de Reactivo de Bradford, agitar y reposar los tubos y después de 10 minutos, tomar la lectura
de la absorbancia de cada tubo en la longitud de onda de 595 nm, previamente ajustando el
espectrofotómetro con un blanco de amortiguador de fosfatos tratado en la misma forma.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
o Construir las curvas de progreso (abs vs tiempo), respecto a las concentraciones de 2,6
DMP y ABTS.
o Determinar las actividades de la enzima en Unidades internacionales enzimáticas de cada
curva de progreso (analice la pendiente de cada curva), utilizando el coeficiente de
extinción molar del sustrato oxidado (εDMP= 49600 M-1cm-1 y de εABTS= 36000 M-1 cm-1)
CUESTIONARIO
1. ¿Qué enzima de los hongos estudiados es la que esta actuando sobre los sustratos
ensayados?
2. ¿Cómo se define la actividad de una enzima y describa las unidades dimensionales?
3. ¿Qué diferencia existe entre las Unidades Internacionales y unidades enzimáticas
especificas?
4. Que es un Katal (Kat) y exprese las unidades dimensionales?
5. Calcule la actividad de los extractos enzimaticos en (Kat)
BIBLIOGRAFÍA
1) Aiba S., Humphrey A. E. y Millis N. F. (1973) Biochemical Engineering, Second Edition.
Academic Press Inc. London.
2) Bailey J. E. y Ollis D. (1978) Biochemical Engineering Fundamentals, 2ª Edition, Mc GrawHill, USA.
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5) Solomon E. I., Sundaram U. M. y Machonkin T. E. (1996) Multicopper oxidases and
oxigenases. Chem. Rev. 96: 2563-2605.
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