Download SISTEMAS LACASA-MEDIADOR APLICADOS A LA

SISTEMAS LACASA-MEDIADOR APLICADOS A LA
TRANSFORMACIÓN DE LIGNINAS INDUSTRIALES
González Arzola, K., Hernández Fernaud, J.R., Carnicero, A., Perestelo, F. y Falcón M.A.
Departamento de Microbiología y Biología Celular. Facultad de Farmacia. Universidad de La
Laguna. Avenida Astrofísico Francisco Sánchez.38206. La Laguna. Tenerife. Teléfono: 922318479.
mail: [email protected]
RESUMEN
Las ligninas industriales utilizadas en este estudio (CELESA e Indulina AT), fueron tratadas en dos
sistemas de bioconversión acuosos, con el fin de mejorar sus características físico-químicas
tendentes a conseguir una posible reutilización de ese tipo de sustrato en diversas industrias.. El
primero de los sitemas estuvo constituído únicamente por un medio tamponado que contenía la
enzima lacasa parcialmente purificada, producida por Fusarium proliferatum. El segundo, contiene,
además de la enzima, el sustrato 2,2-azino-bis-3-ethybenzothiazoline-6-sulphonic-acid (ABTS)
como mediador de la actividad lacasa. Al inicio de la incubación (tiempo cero), las ligninas
recuperadas del primer sistema mostraron un incremento en los valores de absorbancia de sus
espectros UV-Vis que pueden asociarse con la introducción de nuevos grupos funcionales en los
polímeros incubados, no detectándose cambios en sus perfiles de distribución de masas
moleculares por técnicas cromatográficas. Tras un periodo de incubación mayor, los respectivos
análisis de sus espectros y perfiles cromatográficos revelaron que ambas muestras mantienen un
grado de funcionalización mayor que las ligninas originales y sus perfiles cromatográficos
manifestaron la aparición de un nuevo pico en la zona de alta masa molecular (alrededor de los
200 kDa). Ello indicaría una polimerización de los sutratos tratados. Las ligninas recuperadas de
los sistemas lacasa-ABTS, presentaron una importante despolimerización, acompañada de un
incremento de sus grupos funcionales, detectándose, paralelamente, un pequeño incremento en
las respectivas fracciones de alta masa molecualr (cercana a los 200 kDa). Además, dichos
sutratos fueron solubles en medio ácido. Los sitemas que se han utilizado en este trabajo son de
facil manipulación, permiten la solubilidad del sustrato durante el tiempo de incubación y, por los
cambios que originan en las ligninas ensayadas, podrían ser útiles, por una parte, para incrementar
el potencial biotecnológico de las ligninas provenientes de la industria papelera y, por otra, ofrecen
la posibilidad de considerarlos como alternativa para el tratamiento de residuos que contengan
polímeros de naturaleza fenólica.
PALABRAS CLAVE
Ligninas industriales, lacasas, mediadores, bioconversión.
INTRODUCCIÓN
Una de las fuentes más abundantes de lignina es el material de desecho contenido en los efluentes
de la industria papelera, que constituye una enorme fuente de materia prima barata y con
posibilidad de diversas aplicaciones industriales, i.e. como aglomerante de alimentos para
piscifactorías, producción de adhesivos para la industria maderera, matriz transportadora de
fertilizantes, etc.(Hütterman et al., 2001; Gargulak y Lebo, 2000). La reutilización de las ligninas
industriales requiere, normalmente, de su transformación para conseguir un nuevo polímero en el
que se mejore la escasa reactividad química y elevada polidispersión molecular. Algunos de los
sistemas que se han descrito para este fin emplean solventes orgánicos que disuelven a la lignina
y que mantienen la capacidad catalítica de las enzimas (Milstein et al., 1990). La mayoría de estos
sistemas usan enzimas ligninolíticas, como las lacasas, que destacan por su capacidad para
producir radicales libres (Mayer y Staples, 2002). La actividad de esta enzima puede ser
potenciada por mediadores (sustancias de baja masa molecular), cuya utilización amplia el rango
de sustratos de la enzima, lo que permitiría el ataque de las unidades fenólicas y no fenólicas de la
lignina (Bourbonnais y Paice, 1990).
Las lacasas se han encontrado en gran cantidad de hongos, incluyendo Ascomicetos y
Deuteromicetos (Leonowicz et al., 2001), que constituyen una fuente de nuevas lacasas con gran
potencial tecnológico. Kiiskinen y Saloheimo (2004) describieron una lacasa (producida por el
hongo ascomiceto Melanocarpus albomyces) termoestable y que conserva su actividad tras ser
sometidas a pH fuertemente alcalinos, lo que facilita su aplicación industrial. En el presente estudio
se analizaran las transformaciones de dos ligninas industriales derivadas de procesos de tipo kraft,
llevadas a cabo en sistemas acuosos que contienen solo la enzima lacasa parcialmente purificada
o bien suplementados con el mediador ABTS. También se discuten las modificaciones que son
producidas en los perfiles cromatográficos y los cambios espectrales, que reflejan la introducción
de nuevos grupos funcionales en el sustrato original.
PARTE EXPERIMENTAL
Obtención de las ligninas industriales
Una de las ligninas empleadas en el presente estudio fue recuperada a partir de los efluentes
generados por la industria papelera CELESA (Celulosa de Levante Sociedad Anónima). Para ello,
se centrifugó 1 l del efluente alcalino (15 min, 23.700 X g) y se desechó el precipitado. Al
sobrenadante obtenido se le añaden 475 ml de HCl 1M gota a gota, con agitación vigorosa y
posteriormente se centrifugó (15 min, 23.700 x g). El precipitado, que constituye la lignina, se lava
con agua ácida (ajustada con HCl a pH 2) y se centrifuga de nuevo en las mismas condiciones. El
precipitado resultante se secó hasta peso constante a vacío y a temperatura ambiente. Finalmente,
la lignina fue triturada en un mortero hasta obtener un polvo fino y se almacenó a temperatura
ambiente.
La otra lignina utilizada, la Indulina AT, fue suministrada por la empresa Westvaco (North
Charleston, SC, USA).
Microorganismo, medio y condiciones de cultivo
En este estudio se empleó una cepa del hongo ligninolítico Fusarium proliferatum (MUCL 31970).
El mantenimiento del cultivo se llevó a cabo a 4ºC, en un medio que contiene lignina polimérica de
Kraft (LKP) como única fuente de carbono. El medio de cultivo empleado para la producción de
lacasa fue preparado por adición de salvado de trigo libre de almidón al 2% p/v a tampón fosfato
de Sørensen 66 mM pH 6 (Pickard et al., 1999). Este sustrato fue purificado a partir de salvado de
trigo comercial (Comeztier S.A.) como describen Mackenzie et al. (1987). Los cultivos (600 ml)
fueron inoculados con 105 esporas·ml-1 de una suspensión de esporas de Fusarium proliferatum
(proveniente de un precultivo en medio LKP, que contiene glucosa como fuente de carbono y
energía). La solución de esporas fue obtenida a partir del lavado de la superficie de la placa del
precultivo anterior con 5 ml de una solución de Tween 80 en agua destilada y posterior filtración a
través de gasas del líquido obtenido.
Ensayos enzimáticos
Las actividades enzimáticas lacasa (fenoloxidasa) y AAO (aril alcohol oxidasa) fueron valoradas en
un espectrofotómetro UV-Vis (Shimadzu 160) y expresadas en Unidades (U), que se definen como
la cantidad de enzima capaz de transformar 1 mol· ml-1·min-1 de sustrato. El volumen de reacción
fue de 1 ml, el tiempo de incubación de 3 minutos y la temperatura de 37ºC en ambos casos. La
actividad fenoloxidasa fue valorada por el seguimiento de la oxidación del 2,2-azino-bis-3ethybenzothiazoline-6-sulphonic-acid (ABTS), siguiendo el método descrito por Wolfenden y Wilson
(1982). La mezcla reactiva contenía 2 mM de ABTS, 0.1 M de los tampones succinato y lactato
sódico pH 4.5 y entre 50-200 l de sobrenadante procedente de los cultivos. La oxidación del
ABTS fue seguida por incrementos de la absorbancia a 420 nm ( 420 = 3.6 X 104 M-1· cm-1). La
actividad lacasa también fue evaluada frente a 2,6 dimetoxifenol (2,6 DMP) ( 468 = 1 x 104 M-1· cm1
), con 2 mM de dicho sustrato en tampón tartrato sódico 200 mM pH 5. La actividad AAO fue
determinada por la producción de aldehído verátrico ( 310 = 9300 M-1· cm-1), como consecuencia
de la oxidación de alcohol verátrico, según describen Bourbonnais y Paice (1988), en una mezcla
de 2 mM de alcohol verátrico, 0.05 M de tampón tartrato sódico pH 4.5 y 500 l de sobrenadante.
Determinación de proteínas
El contenido en proteínas fue determinado por espectrofotometría a 595 nm con Coomassie blue,
usando como proteína estándar albúmina bovina (fracción V).
Purificación parcial de la actividad lacasa de Fusarium proliferatum
El sobrenadante crudo (500 ml), procedente del cultivo de 13 días en el medio descrito
anteriormente, fue filtrado, centrifugado (15 min, 23.700 x g), congelado a 20ºC y de nuevo
centrifugado en idénticas condiciones. El sobrenadante obtenido se filtra a través de membranas
de poro de 0,45 m y se somete a diálisis durante 12 horas frente a tampón ácido cítrico-fosfato
disódico (Mc Ilvaine) 100 mM, pH 5 (tampón A). Alícuotas de 5 ml fueron sometidas a
cromatografía de intercambio iónico en columnas Econo-Paq Q, en un HPLC (Thermo Separation
Products) equipado con un detector UV-Vis diodo array (Spectrum monitor mod. 5000), una bomba
de gradiente (P-2000) y un inyector Reodyne 7125. El flujo se ajustó a 1 ml· min-1 y la columna fue
equilibrada con tampón A y posteriormente lavada con un gradiente no lineal de NaCl (0-1 M). Las
fracciones que presentaron actividad lacasa frente a ABTS fueron recogidas, dializadas en agua
destilada y liofilizadas. Con el fin de determinar el grado de purificación, una alícuota de dichas
fracciones fue sometida a PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida) no desnaturalizante, tal
como describe Laemmli (1970) con un 10% p/v de poliacrilamida. Los zimogramas fueron
revelados con una solución de ABTS (5 mM) en tampón Mc Ilvaine 100 mM pH 5 y las proteínas
por tinción con reactivo de plata (Biorad).
Biotransformación de las ligninas industriales
La reacción se llevó a cabo en tubos eppendorf de 1.5 ml, siendo el volumen final de 1 ml en todos
los casos. Para ambos sustratos (CELESA e Indulina AT), la mezcla reactiva contiene 1 mg de
lignina (solución stock de 10 mg·ml-1 en NaOH 50 mM) y tiene un pH de 6. El eluído procedente de
la columna Econo-Pac Q fue concentrado por ultrafiltración (Amicón; 50 kDa) hasta obtener una
actividad lacasa de 250 mU·ml-1. Alícuotas de 0.8 ml de este concentrado fueron añadidas a la
mezcla reactiva. Para los ensayos con el mediador ABTS, éste fue añadido de forma que su
concentración final fue de 1 mM. Los controles fueron preparados en idénticas condiciones a las
descritas, con la salvedad de que la enzima se añadió de forma inactivada por calor (15 min a
100ºC).
Estudio de las transformaciones de la lignina recuperada de las mezclas reactivas
Los cambios introducidos por la lacasa fueron estudiados por técnicas espectrofotométricas y
cromatográficas. Para el análisis por espectrofotometría UV-Vis, se midió la absorbancia entre 200
y 500 nm de muestras de 3.2 ml con 50 g·ml-1 de lignina, en un espectrofotómetro UV-Vis
(Shimadzu 160). El análisis cromatográfico abarcó 2 tipos de cromatografías de exclusión
molecular. La primera de ellas, la filtración en gel (GPC), se llevó a cabo aplicando alícuotas de 0.8
ml de mezcla reactiva a una columna de Sephadex G-100 (2 x 45 cm), equilibrada con NaOH 0.1
M. El flujo se ajustó a 0.12 ml·min-1 y los patrones de masa molecular usados fueron albúmina de
suero bovino (BSA, 66 kDa), citocromo c (12.5 kDa) y ácido benzoico (0.125 kDa) (Sigma).
Por último, la lignina fue sometida a cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). Para ello, a la
mezcla reactiva se le añadió 3 ml de NaOH 2N, se agita en vórtex (10 min) y se separa la fase
orgánica por centrifugación (10 min a 9000 x g). A ésta se le añade posteriormente 2 ml de acetato
de etilo que contiene Aliquat 336 50 mM (Sigma), se separa por centrifugación como se indicó
anteriormente y se lava 3 veces con 2 ml de una solución de NaCl al 1%. El acetato de etilo se
evapora por medio de vacío (Speed vacuum, Savant SPD, modelo 121P) y el residuo obtenido, la
lignina, se resuspende en 200 l de tetrahidrofurano (THF). Alícuotas de 20 l fueron inyectadas en
un HPLC equipado con detector UV-Vis (diodo array) (Spectra Monitor mod. 5000, Termo
Separation Products) y un inyector Reodyne 7125, a un sistema formado por 3 columnas: una
guardacolumna HXL (Toso-Haas; 7.8 d.i. x 40 mm), G 3000 HXL y G 4000 HXL (ambas Toso-Haas,
7.8 d.i. x 300 mm). La fase móvil empleada fue THF con Aliquat 336 20 mM y el flujo se ajustó en
0.5 ml·min-1. Los datos fueron analizados con el programa informático LC Talk versión 2.03.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Producción y purificación parcial de la actividad lacasa de Fusarium proliferatum.
El cultivo del hongo en el medio de inducción con salvado de trigo libre de almidón presentó un
máximo de actividad lacasa, tras 13 días de incubación, de 9100 y 13950 mU·mg 1 según se
valorase frente al ABTS o al 2,6 DMF. Esta actividad resultó ser muy superior a la descrita para los
cultivos suplementados con otros inductores como el alcohol bencílico (Regalado et al., 1999).
Además de lacasa, también se detectó en los primeros dias de incubación, la actividad AAO. Los
ensayos para poner de manifiesto otros enzimas ligninolíticos, revelaron la usencia de éstos
durante el tiempo de incubación (hasta 30 días, datos no mostrados).
La purificación parcial de la enzima se llevó a cabo a partir de los sobrenadantes de los cultivos (
13 de incubación). Con una purificación de 1,97 veces y un rendimiento del 60%
aproximadamente, la actividad lacasa contenida en el eluído del primer paso de purificaión (EconoPac Q) se utilizó para los ensayos de bioconversión. Cabe decir que una alícuota de dicho eluído
sometida a un proceso electroforético en condiciones no desnaturalizantes (PAGE), permitió
detectar en el zimograma dos bandas de actividad lacasa teñidas con ABTS (dato no mostrado).
La actividad AAO no fue detectada en el zimograma correspondiente.
Transformación in vitro de las ligninas industriales en sistemas lacasa y lacasa-mediador
Las ligninas incubadas con la lacasa en el medio de bioconversión, fueron recuperadas del mismo
a diferentes tiempos (0-144 horas). Las distintas alícuotas, se analizaron por diferentes técnicas
espectrofotométricas y cromatográficas. Durante ese tiempo, la lacasa mantuvo cerca de un 80%
de su actividad inicial.Cabe destacar que, al inicio de la incubación (tiempo cero), la lignina de
CELESA recuperada del medio de bioconversión, presentó una modificación sustancial de su
espectro UV-Vis, aumentando la absorbancia en las regiones de su espectro comprendidas entre
230 y 340 nm (Tabla 1), que fue extensible hasta los 400 nm (dato no mostrado). Este incremento
en la absorbancia fue concomitante con un intenso cambio en el color de la lignina tratada con la
enzima, que adquiere un color marrón rojizo, estable en el tiempo. Este hecho puede atribuirse a
la introducción de grupos quinónicos, compuestos que contribuyen a la coloración de la madera
(Polcin y Rapson, 1969). El incremento en la absorbancia registrado entre 360 nm (tabla 1) y 400
nm (dato no mostrado) apoyaría también esta hipótesis. Además, el alto valor de la absorbancia
registrado a 340 nm (228% de incremento freente al control, Tabla 1) también sugiere, como
indicaron los últimos autores citados, la introducción, en la lignina tratada, de grupos carbonilos
conjugados con el anillo aromático. El incremento de absorbancia registrado a 260 nm en la
lignina tratada, puede ser debido a la introducción de nuevos grupos oxi-no conjugados con el
anillo aromático y/o a la formaciópn de nuevos enlaces dobles (C -C de la cadena lateral). La
introducción de estos nuevos grupos funcionales contribuyen a la deslocalización de los electrones
del anillo aromático, que se reflejaría en el valor de basorbancia en la región de 230 nm. En
efecto a esa longitud de onda, el polímero tratado se ve afectado mostrando un incremento del
114% de su absorbancia respecto al control (Tabla 1). Por último, parece también relevante el
incremento en la absorbancia a 280 nm, valorado en un 54% (Tabla 1), que sugiere la introducción
de grupos hidroxilos en el anillo aromático (Janshekar et al., 1981). Los datos comentados,
sugieren, en definitiva, una intensa funcionalización de la molécula de lignina, que se lleva a
cabo desde que iniciamos el tratamiento con la enzima y antes de que aparezcan alteraciones en
el perfil de elución de dicho sustrato.
Después de 72 horas de incubación, la lignina de CELESA, mostró un espectro UV-Visible con
valores de absorbancia entre 230 y 340 nm superiores a los controles, pero inferiores a los
observados para el tiempo cero (Tabla 1). Cabe interpretar este nuevo hecho como una
consecuencia de la formación de nuevos enlaces entre los radicales de oxígeno previamente
introducidos por la lacasa (tiempo cero), lo que generaría la polimerización de la molécula.
Apoya esta segunda hipótesis, el cambio registrado en el perfil de elución de este polímero,
cuando se somete a un proceso en cromatografía de eclusión molecular en Sephadex G-100 con
un enriquecimiento en las fracciones que eluyeron con valores de Kav entre 0,03 y 0,1, que se
corresponden con fracciones de alta masa molecular, aspecto que se ve corroborado con los
perfiles obtenidos por HPLC (Fig.1) en donde se detectaron un aumento en las fracciones que
eluyen a los 21 minutos (200 kDa aproximadamente) y un descenso de las de baja masa
molecular.
Los ensayos realizados con la segunda muestra de lignina (Indulina AT), revelaron una
modificación en el sustrato incubado, equivalente a las descritas en el caso anterior. Así, el
espectro UV-Vis de dicha lignina, recuperada a tiempo cero, correspondientes a la fracción que
eluye en el minuto 30, muestra un aumento importante de los valores de absorbancias entre 230 y
340 nm (Tabla 2). En este caso los espectros no pertenecen a la lignina global recuperada del
medio de incubación, como en el caso anterior, sino que pertenecen a una fracción de la Indulina
cromatografiada en HPLC, correspondiente al tiempode retención de 30 min (Tabla 2). Por lo tanto,
puede decirse también, en este caso, que se produce un incremento en grupos funcionales en
la lignina tratada. Además, tras un periodo de incubación de 6 h (frente a las 72 h del caso anterior)
el polímero incubado aumentó el contenido de las fracciones de alta masa molecular, en
detrimento del resto, principalmente las que eluyeron entre el minuto 30 y 40 aproximadamente
(Fig. 2). Este hecho, también se puso de manifiesto en el proceso cromatográfico del polímero en
Sephadex G-100 (dato no mostrado).
Por otra parte, la adición del ABTS a los sistemas formados por las ligninas industriales y la lacasa,
dio lugar a un aumento de las fracciones que eluyeron con un tiempo de retención entre 40 y 44
min, es decir, con masas moleculares inferiores a 1 kDa.. Estas fracciones representan en la
lignina tratada, un 43% de la lignina total. Sin embargo en la lignina control, su representación sólo
alcanza un 4% (dato no mostrado) . Los espectros de las ligninas incubadas presentaron un
notable aumento de la absorbancia entre 260 y 280 nm, lo que puede atribuirse a una intensa
oxidación de la molécula. Sin embargo, el cromatograma también mostró un nuevo pico a los 20
minutos (200 kDa), ausente en la lignina control, que representa un 3,8% de la lignina fraccionada.
Ello sugiere que también se ha producido un proceso de polimerización (dato no mostrado). Esta
doble característica que presenta la lignina incubada: polimerización y despolimerizaión
simultánea, puede ser explicada según indicaron Balakshin et al. (2000) por el mecanismo de
oxidación en dos etapas por el cual la lacasa lleva al ABTS al estadío de oxidación ABTS+2 capaz
de despolimerizar la lignina. Será éste el fenómeno que predomine en el sistema aquí estudiado.
Evidentemente, la propia enzima, sería capaz de oxidar, simultaneamente, a la lignina presente en
el medio de bioconversión (conduciendo posteriormente a su polimerización). Puede hablarse por
tanto de un fenómeno de competencia establecido entre la lacasa, y sus sutratos dianas: el ABTS
y la propia lignina. Ello se traduce, en el sistema lacasa-mediador lignina, aquí utilizado, en la
doble modificación, ya discutida, que se detecta en la lignina incubada. Debe añadirse que, al
contrario de la lignina no tratada, la incubada bajo esas condiciones, forma us sustrato que es
soluble en medio ácido (pH 2).
CONCLUSIONES
1. Las transformaciones de ligninas tipo Kraft, por la enzima lacasa de Fusarium
proliferatum, en medios acuosos, de fácil manipulación, provocan cambios que pueden
ser interesantes a la hora de considerar su uso en biotecnología: por ejemplo, en la
producción de co-polímeros, en la producción de adhesivos para la madera, etc).
2. En los sistemas donde se añade, además de la lacasa, un mediador, como el ABTS,
las ligninas incubadas son, fuertemente despolimerizadas, funcionalizadas, y se
hacen solubles en medio ácido. Dichos sistemas tendrían cabida en la depuración de
residuos que contienen este tipo de sustrato.
BIBLIOGRAFÍA
Balakshin MY,Chen CL, Gratzl JS, Kirkman AG. y Jacob, H. (2000). Kinetic studies on oxidation of
veratryl alcohol by laccase-mediator system. Part 1. effects of mediator concentration.
Holzforschung. 54, 171-175.
Gargulak JD. Y Lebo SE. (2000). Commertial use of lignin-based materials. En: Grasser WG,
Northey RA. Y Schultz TP (eds). Lignin: Historial, Biological and Material Prospectives. American
Chemical Society. Washington DC, 304-320.
Hüttermann A, Mai C. y Kharazipour A. (2001). Modification of lignin for the production of new
compounted materials. Appl. Microbiol. Biotechnol. 55, 387-394.
Janshekar, H., Brown, C. y Fiechter, A. (1981). Determination of biodegraded lignin by ultraviolet
spectrophotometry. Anal. Chim. Acta. 130, 81-91
Polcin, j. y Rapson, W.H. (1969). The interpretation of the UV and Visible spectrum of lignin. Pulp
and paper magazine of Canada. Junio, 555-562.
AGRADECIMIENTOS
Proyectos: REN 2002-02732 (Plan Nacional I+D)
Proyecto PI 64.Gobierno Autónomo de Canarias
Tabla 1. Incremento de los valores de absorbancia registrados para diferentes longitudes de onda
(230,260, 280 y 340 nm), en los espectros de la lignina de CELESA total al inicio de la incubación
(0 h) y después de 72 horas (a 37ºC en tampón Mc Ilvaine 66 mM, pH 6), en presencia de lacasa
(0.2 U). La misma solución conteniendo enzima inactivada por calor (100ºC, 15 min) fue utilizada
como control.
Absorbancia
Ensayo
Tiempo (h)
230 nm
260 nm
280 nm
340 nm
Control
Lignina tratada
Diferencia (%)
0
1.75
3.75
+ 114.3
1.32
2.10
+ 59.1
0.95
1.47
+ 54.7
0.39
1.28
+ 228.2
Control
Lignina tratada
Diferencia (%)
72
1.52
1.77
+ 16.4
1.11
1.16
+ 4.5
0.78
0.95
+ 21.8
0.22
0.37
+ 68.2
Tabla 2. Incremento de los valores de absorbancia registrados para diferentes longitudes de onda
(230,260, 280 y 340 nm), en los espectros de la Indulina AT al inicio de la incubación (0 h) y
después de 6 horas (a 37ºC en tampón Mc Ilvaine 66 mM, pH 6), en presencia de lacasa (0.2 U).
La misma solución conteniendo enzima inactivada por calor (100ºC, 15 min) fue utilizada como
control.
Absorbancia
Ensayo
Tiempo (h)
230 nm
260 nm
0
0.21
0.30
+ 30
0.07
0.20
+ 65
Control
Lignina tratada
Diferencia (%)
280 nm
340 nm
0.08
0.11
+ 27.3
0.03
0.04
+ 25
1
Abs
280 nm
0.5
0
0
20.5
40.5
60.5
Tiempo
3
Tiempo elución: 21.36 min
3
Tiempo elución: 36.18 min
B
Abs 2
Abs 2
1
1
0
200
240
280
(nm)
320
360
0
200
240
280
320
360
(nm)
Fig. 1. Perfil cromatográfico de la lignina de CELESA tras su incubación durante 72 horas en
presencia de lacasa (0.2 U) parcialmente purificada de F. proliferatum ( ) y dicha enzima
termoinactivada ( ). En la parte inferior de la figura se ofrecen los espectros de absorción de las
fracciones que eluyen en el minuto 21 y 36 respectivamente (enzima activa , enzima
termoinactivada )
Absorbancia (280 nm)
0.16
A
0.14
0.12
0.1
0.08
0.06
0.04
0.02
0
0
10
20
30
40
50
60
70
Tiempo (min)
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
210
Tiempo de elución: 26.115 min.
B
260
310
longitud de onda (nm)
360
Absorbancia
Absorbancia
Tiempo de elución: 30.840 min.
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
210
260
310
360
longitud de onda (nm)
Figura 2. A. Perfil de elución de la Indulina AT (control ) sometida a un proceso cromatográfico en
HPLC, tras su incubación con lacasa de Fusarium proliferatum (0.2 U) durante 0 horas (inicio de la
incubación, y 6 horas ( ). Espectros correspondientes a las fracciones que eluyeron al minuto
31(0 horas; B) y en el minuto 26 (6 horas, C). Espectro de la lignina tratada y del control .