Download Bioquimica Basica Unidad IV

PROPEDÉUTICO DE ODONTOLOGÍA
BIOQUÍMICA BÁSICA
2012
Dagmar Stojanovic de Malpica Ph D
Escuela de Biología, Facultad de Ciencias, U.C.V.
PROPEDÉUTICO DE ODONTOLOGÍA, UCV
UNIDAD IV. ENZIMAS
D. Stojanovic de Malpica, Ph D
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Relación entre el ∆G´o y la K´eq en una reacción química
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Ejemplos de cambios de energía libre de varias
reacciones bajo condiciones estándares
Reacción
∆G´o
kJ/mol
ATP + H20 → ADP +Pi
-30,5
ATP + H20 → AMP + PPi
-45,6
PPi + H2 0 → 2Pi
-19,2
Glucosa + 6 O2 → 6CO2 + 6 H2 0
-2840
Palmítico + 23 O2 → 16CO2 + 16 H2 0
-9770
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¿El cambio de energía libre se
relaciona con la velocidad de las
reacciones químicas?
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El cambio de energía libre de una reacción no
está relacionado con la velocidad de la reacción
Una reacción con un valor de ΔG´ o negativo:
ü  No indica que ocurre instantáneamente
ü  Indica que la reacción es termodinámicamente
favorable
ü No indica la duración ( el tiempo) de la reacción
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La velocidad de una reacción química depende
de la energía libre de activación
ü  La velocidad de una reacción química depende de
una barrera energética conocida como energía de
activación (energía libre de activación: ΔG┼)
ü  Este concepto aplica tanto para reacciones
exergónicas como reacciones endergónicas
ü  Citemos el siguiente ejemplo: la hidrólisis del ATP
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La energía libre de activación de la hidrólisis del ATP
La reacción de hidrólisis del ATP es una reacción exergónica:
ATP + H20 → ADP +Pi
∆G´o = - 30,5 kJ/mol
ΔG┼ = +300 kJ/mol
ü Tiene un ΔG┼ alta, lo cual indica que la reacción bajo condiciones
estándares es lenta
ü La hidrólisis del ATP es termodinámicamente favorable, no obstante,
es cinéticamente estable
ü Observe que la reacción inversa (síntesis de ATP) es endergónica
(∆G´o = + 30,5 kJ/mol) también presenta una ΔG┼ no obstante es
superior al de la hidrólisis del ATP, por lo que es aún más lenta
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La mayoría de las reacciones
químicas tienen una energía libre
de activación
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La mejor manera de comprender este
concepto es por medio del análisis
gráfico del cambio de energía libre
durante el curso de una reacción
química (coordenada de reacción ó
avance de reacción)
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Gráfico de coordenada de reacción
ü Es un diagrama que describe los cambios de
energía libre durante el curso de una reacción
química
ü La energía libre (eje de la Y) se grafica en
contra del avance de la reacción (coordenada
de reacción)
ü Por conveniencia nos referiremos a la reacción
S→P
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Diagrama de energía libre durante el curso de una reacción
ΔG┼ (Energía libre de activación)
ΔG┼ : S → P
S
ΔG┼: S ← P
P
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Número de moléculas
Solo una pequeña fracción de la moléculas de una
población de moléculas dada posee una energía igual
o mayor a la energía libre de activación
25oC
Energía libre
de activación
de una reacción
dada
Moléculas que
reaccionan
Energía
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La energía libre de activación (ΔG┼)
Se define
como la cantidad de energía libre
requerida en calorías para que todas las
moléculas contenidas en un mol de una
sustancia a una temperatura dada (T ) puedan
pasar al tope de la barrera energética (estado de
transición)
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El estado de transición
ü Se define como el punto máximo de energía
libre a lo largo de la coordenada de reacción
ü En este punto los reactantes se encuentran en
formas reactivas (especies reactivas) que
conducen a la formación de productos
ü El estado de transición del (los) reactante (s)
es una especie hipotética intermedia en la
conversión de reactante a producto
ü Es inestable y breve
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La velocidad de una reacción es
directamente proporcional al
número de especies en el estado de
transición
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¿Cómo se puede aumentar la fracción de
moléculas en el estado de transición?
Hay dos maneras de aumentar la velocidad de
una reacción:
ü  Aumentando la Temperatura
ü Agregando un catalizador químico
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El aumento de la temperatura
ü Un incremento en la temperatura aumenta la
energía cinética de los reactantes, lo que hace
que una fracción mayor de moléculas pueda
alcanzar el tope de la barrera energética
ü Por cada aumento de 10oC se duplica la
velocidad de la reacción
ü El aumento de la temperatura puede degradar o
alterar los reactantes, lo cual es una limitación
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Número de moléculas
Efecto de la temperatura sobre la energía de
activación (EA) de una reacción dada
300oK
EA
500oK
Energía
Con el incremento de la temperatura aumenta el número de
moleculas que poseen una energía igual o mayor a la energía de
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activación
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Adición de un catalizador químico
ΔG┼ (Energía libre de activación)
ΔG┼ sin catalizador
S
ΔG ┼ con catalizador
P
ü  El catalizador químico ofrece una ruta alternativa (mecanismo) con una
energía libre de activación menor
ü  El catalizador se combina transitoriamente con el reactante S y forma un
estado de transición que tiene una energía libre de activación menor que la
la reacción en ausencia del catalizador
ü  Esto aumenta la fracción de moléculas de una población determinada que
puedan reaccionar por unidad de tiempo, a una temperatura dada
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Los catalizadores químicos
ü  Son compuestos que aceleran la velocidad de una
reacción química
ü  No son específicos
ü  Se combinan reversiblemente con el compuesto a
modificar
ü  No modifican la constante de equilibrio de la
reacción
ü  No se consumen durante el curso de la reacción
ü  Se recuperan al finalizar la reacción
ü  El catalizador puede repetir la reacción numerosas
veces; se requieren pequeñas cantidades
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El catalizador no modifica la constante de equilibrio
de la reacción
ΔG┼ (Energía libre de activación)
ΔG sin catalizador
S
ΔG con catalizador
P
∆G´o = ∆G´o P - ∆G´o S
∆G´o = -RT 2,3 log K´eq
kJ/mol
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LAS ENZIMAS
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Cantidad de producto ( P) formado
Las enzimas son los catalizadores biológicos de
las reacciones químicas celulares
Con enzima
Reacción S ↔ P
Reacción sin enzima
Tiempo
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Características de las reacciones químicas
celulares
ü  La mayoría de las reacciones químicas celulares
presenta elevada energía libre de activación
ü  En consecuencia las reacciones químicas en las
células son muy lentas, por lo que los reactantes
(biomoléculas) son muy estables
ü  Las enzimas aceleran las reacciones según las
necesidades de la célula
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Las enzimas presentan propiedades similares
a los catalizadores químicos
ü  Se combinan reversiblemente con el reactante
(sustrato)
ü  Disminuyen la energía libre de activación
ü  No modifican la constante de equilibrio de la reacción
(Keq)
ü  No se consumen durante la reacción
ü  Se requieren en pequeñas cantidades
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ΔG┼ (Energía libre de activación)
ΔG en ausencia de enzima
S
ΔG en presencia de enzima
P
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Las enzimas se distinguen de los catalizadores
químicos por:
ü  Su naturaleza química (Proteína o ARN)
ü  Son altamente específicas, seleccionan el reactante
(una enzima un reactante)
ü  Disminuyen la energía de activación (105 hasta 1017
veces) en proporciones mayores
ü  Su actividad puede ser regulada
ü  Las enzimas son producidas por las células mediante
la expresión de los genes en el ADN
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Naturaleza de las enzimas
ü La mayoría son proteínas, algunas son ARN
(p.e, la ribozima)
ü Presentan estructura primaria, secundaria y
terciaria
ü Pueden presentar estructura cuaternaria
ü Presentan una conformación nativa
biológicamente activa a pH fisiológico
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Algunas enzimas requieren cofactores en
el sitio activo para efectuar su actividad
biológica
Holoenzima: Apoenzima + cofactor
Porción proteica
de una enzima
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Cofactores:
Pueden ser de dos clases:
ü  Elemento inorgánico: Fe2+, Mg2+, Cu2+
ü  Molécula orgánica(Coenzima): FMN. FAD, NAD+ CoASH
Algunas enzimas requieren ambos tipos de cofactores
Cualquiera de los dos cofactores pueden estar unidos:
ü  Débilmente (cosustrato)
ü  Fuertemente a la enzima (grupo prostético)
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Las coenzimas funcionan como transportadores
transitorios de grupos funcionales específicos
Coenzima
FMN
FAD
NAD+
Coenzima A
Grupo químico que
transfieren
Precursor en la
dieta
Transferencia de dos
átomos de hidrógeno
Riboflavina
(vitamina B2)
Transferencia de dos
átomos de hidrógeno
Riboflavina
(vitamina B2)
Transferencia de iones
hidruro (:H-) + H+
Acido nicotínico
(niacina)
Transferencia de grupos
acetil (CH3-CO-)
Acido pantoténico y
otros compuestos
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CARACTERÍSTICAS
ESTRUCTURALES DE LAS
ENZIMAS
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El sitio activo: región 3D de la enzima donde se
une el sustrato y ocurre la conversión del
sustrato en producto
Sitio Activo
El sitio activo representa sólo una pequeña fracción del área de
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superficie de la enzima
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Formación del sito activo: encuentro de grupos laterales
R de residuos de aminoácidos provenientes de diferentes
regiones del polipéptido
Los grupos R son responsables de la catálisis
(conversión del sustrato en producto) D. Stojanovic de Malpica, Ph D
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Especificidad del sitio activo
ü  Se refiere a la capacidad de selección del sustrato por la enzima
ü  Varios factores contribuyen a esta propiedad: la 3D del sitio activo,
características químicas del sitio activo y la estructura del sustrato
ü  Las enzimas son absolutamente específicas para el (los) sustrato
(s) de la reacción que catalizan
ü  Cada reacción química celular es catalizada por una enzima
específica
ü  Por lo general se considera “una reacción, una enzima”
ü  Muchas enzimas presentan estereoespecificidad, esto es,
reconocen un solo tipo de estereoisómero del sustrato
ü  Dentro de una célula hay cientos de enzimas distintas
ü  La especificidad hace que dentro de un mismo compartimento
subcelular puedan tener lugar, a la vez, cientos de reacciones
distintas sin que se confundan
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Ejemplo ilustrativo de la especificad del sitio activo de una
enzima (La glucoquinasa)
La glucoquinasa cataliza la siguiente reacción:
Glucosa + ATP
Glucosa 6-fosfato + ADP
A: Sitio activo de la
enzima mostrando
los grupos R que
enlazan a la
Glucosa
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La enzima también puede reconocer a la Galactosa, no
obstante la velocidad de fosforilación es muy lenta:
Galactosa + ATP
Galactosa 6-fosfato + ADP
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Complementariedad de superficies entre el
sustrato y el sitio activo
ü  La superficie del sitio activo no es del todo complementaria a la
superficie del sustrato
ü  No es una interacción tipo llave-cerradura como originalmente
pensaba Emil Fisher (1890)
ü  La interacción entre la enzima y el sustrato ocurre por interacciones
no covalentes débiles (puentes de hidrógeno; hidrofóbicas y/o
atracción electrostática)
ü  La interacción inicial entre el sitio activo y el sustrato es relativamente
débil
ü  No obstante, las interacciones inducen cambios de conformación en
la enzima que refuerzan el enlazamiento y promueven una máxima
complementariedad (ajuste inducido) que se alcanza en el estado de
transición
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El modelo del ajuste inducido
Sustrato
+
Sitio Activo
Complejo
Enzima-Sustrato
(ES)*
Enzima
*La máxima complementariedad del complejo ES se alcanza en
el estado de transición
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¿CÓMO LA ENZIMA DISMINUYE LA
ENERGÍA DE ACTIVACIÓN DE UNA
REACCIÓN CELULAR DADA?
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Eventos que deben ocurrir para que un
sustrato se convierta en producto
ü Aumento en la frecuencia de colisiones de
moléculas reactivas
ü Eliminación de las capas de solvatación del
reactante con el agua
ü Distorsión de enlaces químicos
ü  Alineación de enlaces
ü  Reacomodación de enlaces
ü Ruptura y formación de enlaces
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La energía de enlazamiento es la principal fuerza
conductora de la catálisis
ü  Formación del complejo [ES]: intervienen múltiples interacciones
individuales débiles no covalentes que liberan una pequeña cantidad
de energía libre (exergónicas ; ΔG valor negativo)
ü  La suma de la energía libre de todas las interacciones débiles
individuales suministra una cantidad significativa de energía libre,
conocida como energía de enlazamiento
ü  Esta energía de enlazamiento es la principal fuente de energía libre
utilizada por las enzimas para bajar la energía de activación de las
reacciones
ü  Explica la enorme velocidad que alcanzan las reacciones catalizadas
por las enzimas
ü  Las múltiples interacciones débiles en el estado de transición son las
que contribuyen mayoritariamente con la catálisis y son
responsables de la especificidad de la enzima por su sustrato
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Catálisis enzimática
ü  Se refiere al estudio cinético de una reacción catalizada
por una enzima
ü  Este estudio revela el mecanismo por el cual la enzima
convierte el sustrato en producto
ü  Requiere de la formación de un complejo [ES]
ü  El complejo [ES] pasa al estado de transición [ES] ┼
ü  El complejo [ES]┼ se transforma en [EP]
ü  La enzima se disocia del producto
S↔ [ES] ↔ [ES]┼ ↔ [EP] ↔ P + E
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Mecanismo de acción de una enzima:
estudios de cinética enzimática
Se refiere al estudio de la velocidad de una reacción y
los cambios en la velocidad de una reacción en
respuesta a cambios experimentales
El método más sencillo para estudiar el mecanismo de
acción de una enzima es estudiar el efecto de la
concentración del sustrato sobre la velocidad de la
reacción
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Modelo cinético de Michaelis-Menten
k1
k2
S + E ↔ [ES] ↔ E + P
k-1
Unión del sustrato
Catálisis
La transformación del S en P se divide en dos pasos:
ü El primer paso es rápido, consiste en la formación del complejo
[ES] reversible
ü El segundo paso de la reacción es lento, consiste en la
conversión del [ES] en P + E; se considera el paso limitante de la
reacción
ü k1, k2, k-1: se refieren a las constantes de velocidad de la
reacciones individuales señaladas en el modelo
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Velocidad inicial de la reacción:
Aparición del producto en función del tiempo
Ensayo para medir el efecto de la [S] sobre la velocidad de una
reacción catalizada por una enzima (S ↔ P)
Concentraciones
crecientes de sustrato
Concentración fija de
enzima
[ S ] mM
q 
q 
q 
Los tubos de ensayo se incuban por un tiempo corto en condiciones
óptimas de pH y temperatura
La reacción se detiene
Para cada concentración de sustrato se determina la cantidad de producto
formado por unidad de tiempo (velocidad inicial de la reacción: Vo)
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Velocidad inicial, Vo µMoles/min
Efecto de la concentración del sustrato sobre la
velocidad de la reacción catalizada por una enzima
La enzima se satura con el sustrato
Concentración de sustrato [S] mM
El grafico muestra una hiperbóla rectangular la cual tiene
una expresión matemática conocida como la ecuación de
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Michaelis-Menten
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Saturación de la enzima con el sustrato
Vo
Vmax
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Ecuación de Michaelis-Menten
Vo: es la velocidad inicial
Vmax: velocidad máxima de la reacción
[S]: concentración del sustrato
Km: constante de Michaelis, es una relación matemática de las tres
constantes de velocidad (k1 k2 y k-1); Km es igual a la [S] cuando la Vo
= Vmax/2; se expresa en concentración molar
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Análisis gráfico de la ecuación de
Michaelis-Menten
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¿Porqué Km es igual a la [S] cuando
la Vo es la mitad de la Vmax?
Despejando Km:
Km+ [S] = 2 [S]
Km = 2 [S] –[S]
Km= [S]
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Significado biológico de Km
En términos prácticos la Km es una medida de la afinidad
de la enzima por su sustrato:
ü Mientras más pequeño es su valor mayor es la afinidad
de la enzima por el sustrato
ü Mientras más alto es su valor menor es la afinidad de la
afinidad por su sustrato
ü Las enzimas con una Km muy baja (10-6-10-8M) son
importantes en el metabolismo
ü Si una reacción tiene dos o mas sustratos (A +B
→productos), la enzima tiene dos Km uno para cada
sustrato; lo mismo ocurre para Vmax
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Valores de Km para algunas enzimas y sus
sustratos
Enzima
Catalasa
Sustrato
Km (mM
H 20 2
25
D-Glucosa
0.05
D-Fructosa
1.50
HC03-
26
D-Lactosa
4
Hexoquinasa (cerebro)
Anhidrasa carbónica
β-Galactosidasa
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Relacíón entre Vmáx y la concentración
total de enzima [E] en exceso de sustrato
Vmáx = k2 [E]
[E]: concentración total de enzima
k2: constante de velocidad del segundo paso de
la reacción: [ES] ↔ P + E
ü La única manera de incrementar la Vmax de
una reacción en un mismo ensayo (ejemplo
anterior) es aumentando la cantidad total de
enzima; la Km queda igual
ü  k2 se conoce como kcat ó número de
recambio
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Eficiencia de la enzima:
número de recambio (kcat)
Se refiere al número de moléculas de sustrato convertidas en
producto por una molécula de enzima por unidad de tiempo
cuando la enzima esta completamente saturada con su
sustrato
Número de recambio (kcat):
Vmáx = k2 [E]
k2 = kcat = Vmáx/[E] segundos-1
Enzima
Sustrato
kcat (seg-1)
Catalasa
H 20 2
40.000.000
Anhidrasa carbónica
HC03-
400.000
Acetilcolinesterasa
Acetilcolina
14.000
Fumarasa
Fumarato
800
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Mayoritariamente las enzimas no regulatorias
siguen una cinética de Michaelis-Menten
ü Se refiere a las enzimas cuya actividad biológica
no se puede regular (ni aumentar ni disminuir su
actividad)
ü Usualmente consisten de una sola cadena
polipeptídica, que presenta una conformación
nativa a pH fisiológico
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Factores que regulan la actividad
enzimática
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Efecto del pH sobre la actividad enzimática
ü  La mayoría de las enzimas son activas en una escala
estrecha de pH
ü  El pH en el cual la velocidad de la reacción es máxima se
denomina pH óptimo
ü  El pH óptimo de la mayoría de las enzimas en el hombre
varía entre 6 a 8
ü  Es excepcional la pepsina, una enzima gástrica que
funciona a un pH óptimo de 2, un pH muy ácido
ü  Los cambios en el pH pueden modificar las cargas de
los grupos R ionizables de los residuos de aminoácidos
en el sitio activo de la enzima
ü  También puede alterar los enlaces iónicos que
contribuyen a la estabilización de la estructura terciaria o
cuaternaria, con lo que se altera la conformación nativa
de la proteína y por ende, la actividad de la enzima
ü  La desnaturalización es irreversible en presencia de pH
extremos ácidos o básicos
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Porcentaje de máxima actividad
Efecto del pH sobre la actividad enzimática
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Las enzimas poseen una temperatura
óptima
ü  Las enzimas poseen una temperatura óptima a la cual la
velocidad de la reacción es máxima
ü  Las enzimas en nuestro cuerpo, tienen una temperatura
óptima entre 35 a 37° C
ü  Con el incremento de la temperatura
aumenta la
energía cinética de las moléculas y las colisiones
moleculares, por lo que favorece las reacciones
enzimáticas dentro de límites determinados
ü  Por encima de la temperatura óptima, se rompen los
enlaces no covalentes que estabilizan la estructura
secundaria, terciaria y cuaternaria, esto conlleva a la
pérdida de la conformación nativa y de la actividad de la
enzima (desnaturalización de la enzima)
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Efecto de la temperatura sobre la
actividad enzimática
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Enzimas alostéricas
ü Son proteínas que presentan estructura cuaternaria
ü  Están compuestas por dos ó más subunidades
ü Actúan como enzimas reguladoras del metabolismo
(Unidad VI)
ü Poseen una región llamada sitio alostérico, el cual
se localiza en una región de la proteína diferente
del sitio activo
ü  Los compuestos que afectan la actividad
enzimática mediante la unión a sitios alostéricos se
denominan reguladores alostéricos
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Efecto de reguladores alostéricos
sobre la actividad enzimática
Sustrato
Regulador positivo
Enzima menos activa
Enzima más activa
Complejo
Enzima-Sustrato
más activo
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Las enzimas alostéricas no presentan una cinética
de Michaelis-Menten
ü  El estudio cinético de una reacción catalizada por una enzima
alostérica muestra una curva sigmoidal
ü  Este tipo de curva obedece a otra ecuación matemática, por lo que no
se puede aplicar la ecuación de Michaelis-Menten
ü  No obstante, presenta Vmax y la [S] para alcanzar la mitad de la Vmax
se conoce como K 0.5
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Efecto de los reguladores positivos (+) y negativos
(-) sobre la actividad enzimática
ü  El regulador + disminuye la K0.5, por lo que, aumenta la afinidad de la
enzima por el sustrato y en consecuencia, aumenta su actividad
ü  El regulador - disminuye la K0.5, por lo que, disminuye la afinidad de
la enzima por el sustrato y en consecuencia, se reduce la actividad de
la enzima
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