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Manual de colorantes y soluciones
Código: M-CCBA-LB-08
Revisión: 01
Fecha de emisión: 19/04/10
Página: 1 de 16
CONTROL DE CAMBIOS Y MEJORAS
NIVEL DE SECCIÓN Y/O
REVISIÓN
PÁGINA
01
1
DESCRIPCIÓN DE LA MODIFICACIÓN Y
MEJORA
Actualización de las firmas
FECHA DE
MODIFICACIÓN
Octubre 2012
02
03
04
05
Elaboró
Revisó
Aprobó
QFB Ana María Sofía Rejón Magaña
Responsable del laboratorio
Coordinador de la Unidad de
Diagnóstico
Coordinador de la Unidad de
Diagnóstico
1.-OBJETIVO
Proporcionar la información necesaria para la preparación de colorantes y soluciones
utilizadas en el laboratorio de bacteriología.
2.- ALCANCE
Aplica a todo el personal del laboratorio de bacteriología.
3.- POLITICAS
Todos los colorantes y soluciones mencionados en este manual deben apegarse a las
instrucciones del mismo para su preparación.
2
INDICE
Introducción …………………………………………………………...…………………
5
Cristal violeta …………………………………………………………..………………..
5
Lugol ……………………………………………………………………...………………
5
Alcohol acetona …………………………………………………………...…………….
5
Safranina …………………………………………………………………….…………..
6
Colorante wayson ……………………………………………………………………….
6
Azul de metileno alcalino (Tinción de Hansen) ………………………………….…..
6
Solución acuosa de safranina ………………………………………………………....
6
Azul de Metileno Alcalino Loeffler …………………………………………………….
7
Fucsina Fenicada (Tinción de Ziehl -Neelsen) ………………………………….…...
7
Alcohol Acido (Tinción de Ziehl-Neelsen) ………………………..………………......
7
Verde Malaquita al 5 % (Tinción de esporas) ………………………………………..
8
Safranina al 5 % (Tinción de espora) …………………………………………………
8
Sulfato de cobre al 20 % (Tinción de cápsula) ……………………………………....
8
Fucsina básica (Tinción de cápsula) ……………………………………………….…
8
Fucsina fenicada (Tinción de Campylobacter)al 0.8 % ………………………..……
8
Preparación de soluciones …………………………………………………………….
9
Introducción …………………………………………………………………………...…
9
Indicador de rojo de metilo ………………………………...…………………………..
9
Soluciones, empleadas para la prueba (Reducción de nitratos) ………….............
9
Reactivo de kovac ……………………………………………………………………....
10
Reactivos empleados para la prueba de Voges Proskauer ..................................
10
3
Hidróxido de potasio (KOH) 40 % agente oxidante ………………………………....
10
Peróxido de hidrógeno al 30% ……………………………………………………...…
11
Solución salina fisiológica 0.85 % ………………………………………………….....
11
Estandar sulfato de bario (para ANTIBIOGRAMAS) ………………………………..
11
Preparación de HCl 0.1 N ……………………………………………………………...
11
Solución Verde Brillante al 0.1 % (Salmonella) ……………………………………...
12
Solución buffer fosfatos para alimentos (PBS) …………………………………..….
12
Agua peptonada concentrada para salmonella en aves (APC) ……………………
12
Agua peptonada diluida para salmonella en carne molida …………………………
12
Buffer fosfatos para salmonella en aves …………………………………………..…
12
Preparación de lugol para tetrathionate ………………………………………………
13
Preparación del hipurato de sodio al 1 % …………………………………………….
13
Solución de fosfatos para mantener remojados los electrodos ……………………
13
Solución buffer diluyente para bacteriológico de alimentos ………………………..
13
Soluciones para ajustar pH de muestras ………………………………………….…
14
Referencias ……………………………………………………………………………...
15
4
PREPARACION DE COLORANTES
INTRODUCCIÓN
Sólo algunos de los muchos compuestos orgánicos que actúan como colorantes se
usan para teñir microorganismos. Se trata de modificaciones de las primeras anilinas
obtenidas de productos del alquitrán, introducidas alrededor de 1880 por Koch, Weigert y
Ehrlich en las técnicas bacteriológicas.
Los colorantes se dividen en ácidos, básicos o neutros. En los colorantes ácidos,
como la eosina, el grupo iónico que imparte color a la (llamado cromóforo) tiene carga
negativa(es un anión) y al colorear forma una sal al combinarse con una base(NaOH).Los
colorantes básicos, como el azul de metileno, son tinturas en la que el ión que lleva al
color está cargado positivamente (un catión), que se combina con un ácido(HCL) para
formar la sal colorante. No todas las tinturas actúan mediante la formación de sales.
Los colorantes neutros como el de Giemsa, son compuestos en los que se mezclan
colorantes ácidos y básicos. Debido a la presencia de abundantes partículas(ribosomas)
que contienen ácido ribonucleico en todo el protoplasma de la célula bacteriana, las
tinturas básicas son las más útiles en bacteriología. Con estos colorantes, la mayoría de
las células bacterianas intactas se tiñen profunda y uniformemente, como los núcleos de
las células de vegetales y animales superiores.
CRISTAL VIOLETA
Cristal violeta (85%)
Etanol ( 95 %)
Oxalato de Amonio
Agua destilada
1 gr.
20 ml.
0.8 gr.
100 ml.
Almacenar en frasco ámbar.
LUGOL
Cristales de Iodo
1 gr.
Yoduro de potasio
2 gr.
Disolver completamente en 5 ml. de agua destilada, luego adicionar:
Agua destilada
Guardar en frasco ámbar.
240 ml.
ALCOHOL- ACETONA
Etanol 95 %
Acetona
SAFRANINA
250 ml.
250 ml.
5
Safranina
Alcohol (95 %)
2.5 gr.
100.0 ml.
COLORANTE DE WAYSON
Solución " A "
Fucsina básica
Alcohol etílico absoluto
Azul de metileno
Disolver los colorantes en el alcohol.
0.2 gr.
20.0 ml.
0.75 gr.
Solución " B "
Fenol
Agua destilada
10 gr.
190 ml.
Solución para empleo.
1.- Echar la solución A en B lentamente.
2.- Dejar reposar durante 48 horas.
3.- Filtrar y guardar en fresco ámbar.
Nota: Este colorante ofrece mayor tinción después de 1 ó 2 años.
AZUL DE METILENO ALCALINO (TINCIÓN DE HANSEN)
Solución " A "
Azul de metileno
Agua destilada
0.3 gr.
100.0 ml.
Solución " B "
Hidróxido de potasio
Agua destilada
0.04 gr.
100.0 ml.
Mezclar 3 ml. de solución A + 10 ml. de solución B antes de usarla.
SOLUCIÓN ACUOSA DE SAFRANINA
Safranina
1 gr.
Agua destilada
100 ml.
AZUL DE METILENO ALCALINO DE LOEFFLER
6
Tinción de gránulos metacromáticos.
Solución " A "
Azul de metileno
0.3 gr.
Alcohol etílico (95 %)
30.0 ml.
Disolver completamente: se trata de una solución saturada.
Solución " B "
Hidróxido de potasio
0.01 gr.
Agua destilada
100.0 ml.
Para se empleo: Añadir la solución A en la solución B, agitando continuamente.
Filtrar antes de su empleo.
FUCSINA FENICADA (Tinción de Ziehl- Neelsen)
Fucsina básica
Alcohol etílico (95 %)
Fenol cristales
Agua destilada
0.3 gr.
10.0 ml.
5.0 ml.
95.0 ml.
ALCOHOL - ÁCIDO (Tinción de Ziehl- Neelsen)
Alcohol etílico (95 %)
HCL Q.P.
97 ml.
3 ml.
1.- Azul de metileno de Loeffler. (Tinción de Ziehl- Neelsen)
Azul de metileno
Alcohol ( 95 %)
0.3 gr.
30.0 ml.
2.- KOH 0.01 %
(Tinción de Ziehl - Neelsen)
Hidróxido de potasio
0.01 gr.
Agua destilada
100.ml.
Mezclar 1 y 2 agitar continuamente.
Filtrar antes de su empleo.
VERDE MALAQUITA AL 5 % (TINCIÓN DE ESPORAS)
7
Verde malaquita
Agua destilada
5 gr.
100 ml.
SAFRANINA AL 5 % (TINCIÓN DE ESPORAS)
Safranina
Agua destilada
5 gr.
100 ml.
SULFATO DE COBRE AL 20 % (TINCIÓN DE CÁPSULA)
Sulfato de cobre
Agua destilada
20 gr.
100 ml.
FUCSINA BÁSICA (TINCIÓN DE CÁPSULA)
Fucsina básica
Agua destilada
0.15 gr.
100.0 ml.
FUCSINA FENICADA (TINCIÓN DE CAMPYLOBACTER) AL 0.8%
Fenol
Alcohol 100%
Fucsina Básica
Agua destilada
2.5 ml
5.0 ml
0.8 gr.
100 ml
PREPARACION DE SOLUCIONES
8
INTRODUCCIÓN
Las soluciones en química, son mezclas homogéneas de sustancias en iguales o
distintos estados de agregación. La concentración de una solución constituye una de
sus principales características. Bastantes propiedades de las soluciones dependen
exclusivamente de la concentración. Su estudio resulta de interés tanto para la física
como para la química. Algunos ejemplos de soluciones son: agua salada, oxígeno y
nitrógeno del aire, el gas carbónico en los refrescos y todas las propiedades: color,
sabor, densidad, punto de fusión y ebullición dependen de las cantidades que
pongamos de las diferentes sustancias.
La sustancia presente en mayor cantidad suele recibir el nombre de solvente, y a
la de menor cantidad se le llama soluto y es la sustancia disuelta.
INDICADOR DE ROJO DE METILO
1.- Disolver 0.1 gr. de rojo de metilo en 300 ml. de alcohol etílico al 95 %.
2.- Agregar 200 ml. de agua destilada a la mezcla alcohol-indicador.
Conservación: guardar el reactivo en un refrigerador 4°C mientras no se usa.
SOLUCIONES EMPLEADAS PARA LA PRUEBA REDUCCIÓN DE NITRATOS
Reactivo A
Dimetil alfa naftilamina al 0.6%:
250 ml de agua destilada
100 ml de ácido acético glacial
2.1 ml de dimetil alfa naftilamina
Mezclar en el orden que se mencionan.
Reactivo B
Ácido Sulfanílico al 0.8%:
250 ml de agua destilada
100 ml de ácido acético glacial
1.8 gr. de ácido sulfanílico.
Mezclar en el orden mencionado.
Zinc en polvo (reduce el nitrato a nitrito).
Guardar ambos reactivos en el refrigerador (4°C). Por lo general estos reactivos se
mantienen estables durante por lo menos tres meses. Sin embargo, periódicamente se
hará un control de calidad, desechándolos si dan una reacción negativa o débil con un
organismo conocido.
REACTIVO DE KOVAC
9
Alcohol amílico o isoamílico (puede
150 ml.
p- dimetil- amino- benzaldehido 10 gr.
HCL (concentrado)
50 ml.
sustituirse
por
alcohol
butílico)
Preparación
Disolver el aldehído en el alcohol.
Agregar lentamente el ácido a la mezcla aldehído- alcohol. Guardar
en
el
refrigerador 4°C. Su estabilidad es variable, por lo tanto se hará todas las semanas un
control de calidad, desechando si muestra una reacción débil o negativa con un
organismo positivo conocido.
REACTIVOS EMPLEADOS PARA LA PRUEBA DE VOGES-PROSKAUER
Alfa naftol 5 %, intensificador del color.
Alfa naftol (1- naftol)
5 gr.
Alcohol etílico (absoluto)
100 ml.
Preparación
Disolver el alfa naftol en menos de 100 ml. de alcohol etílico absoluto. Trasvasar la
solución a un frasco volumétrico de 100 ml. y agregar a alcohol etílico absoluto c.s.p.
100 ml.
HIDRÓXIDO DE POTASIO (KOH) 40 % AGENTE OXIDANTE
Hidróxido de potasio
Agua destilada
40 gr.
100 ml.
Preparación
Pesar rápidamente el KOH y disolverlo en menos de 100 ml. de agua destilada.
Este reactivo es muy higroscópico. Colocar el vaso en un bañó de agua fría circulante
para controlar la temperatura.
Enfriar y transvasar la solución de KOH a un frasco volumétrico
agregando agua destilada c.s.p. 100 ml.
de 100 ml.
Guardar en un frasco para reactivos color ámbar. Rotular perfectamente. Los
reactivos deben ser controlados con cultivos positivos y negativos conocidos antes de su
empleo.
Guardar los reactivos en el refrigerador (4°C).
PERÓXIDO DE HIDRÓGENO AL 30 %
10
Conserve en un frasco ámbar, evitar la innecesaria exposición a la luz. Mantener a 4°C.
SOLUCIÓN SALINA FISIOLÓGICA
0.85 %
Cloruro de sodio (NaCL)
8.5 gr.
Agua destilada c.s.p.
1000 ml.
Disolver en agua destilada, aforar a 1000 ml. y filtrar con papel filtro Whatman No.
40 o equivalente. Esterilizar a 15 libras durante 15 minutos. Mantener en el refrigerador a
4°C.
STANDAR DE SULFATO DE BARIO (PARA ANTIBIOGRAMAS)
Prepare dicho estándar agregando 0.5 ml del Cloruro de Bario (BaCl2) 0.048 M
(1.175% P/V BaCl2 . 2H2O) a 99.5 ml de H2SO4 0.18 M (0.36) (1%). Mezcle agitando las
soluciones en una parrilla agitadora.
Verifique la densidad correcta del estándar usando un espectofotómetro. La
absorbancia a 625 nm debería ser 0.08-0.1 para el estándar 0.5 MacFarland.
Distribuir 5 ml dentro de tubos similares a los que se van a usar para preparar los
inóculos. Para evitar la evaporación mantenga sellado los tubos y almacenados a
temperatura ambiente al abrigo de la luz. Agite vigorosamente el estándar antes de su
uso para lograr una turbidez homogénea. Remplace o verifique la confiabilidad de los
estándares mensualmente.
PREPARACIÓN DE HCl 0.1 N
HCl
P.E.
0.1 N.
1.192
3.46/ lit.
= 37.23 gr de HCl
44.3 gr. -------- 100ml
3.646 gr. -------- X
.
X= 8.23 ml./lit.
4.15 ml./ 500 ml.
Titulación del HCL 0.1 N con - NaHCO3 Q.P.
Pesar 0.15, 0.20, 0.25 gr. NaHCO3
Añadir a cada porción 50 ml de H20 + III gotas de naranja de metilo; a esto dejarle
caer el HCL preparado.
Cálculos: NORMALIDAD= ___ Gr.______
Milieq.x Lit.
SOLUCIÓN VERDE BRILLANTE AL 0.1 % (SALMONELLA)
11
Para inhibir otras bacterias Gram. (-) que no sean Salmonella.
Preparación
Verde Brillante
0.1 gr.
Agua destilada estéril
100.0 ml.
Conservar en frasco ámbar
4°C.
SOLUCIÓN BUFFER FOSFATOS PARA ALIMENTOS (PBS)
Na2HPO4
NaH2PO4
NaCl
Agua
pH
2.3
0.5
9.0
1000
7.2
gr.
gr.
gr.
ml.
Distribuir en tubos con 20 ml y esterilizar a 15°C por 15 min. Este PBS es utilizado
cuando se hacen diluciones para muestras de alimento.
AGUA PEPTONADA CONCENTRADA PARA SALMONELLA EN AVES(APC)
Peptona
NaCl
Na2HPO4
KH2PO4
Agua Destilada
10 gr.
5 gr
3.5 gr.
1.5 gr.
100 ml
Distribuir en frascos 2 ml, esterilizar a 15 lib. Por 15 min.
AGUA PEPTONADA DILUIDA PARA SALMONELLA EN CARNE MOLIDA
La misma fórmula pero para 1000 ml de agua destilada y distribuir 100 ml en
frascos con tapa de rosca. Esterilizar a 15 lib. Por 15 min.
BUFFER FOSFATOS PARA SALMONELLA EN AVES
Na2HPO4
2.3 gr.
NaH2PO4
0.5 gr
NaCl
9.0 gr.
Agua destilada
1000 ml
Distribuir 20 ml en tubos con tapa de rosca. Esterilizar 15 lib. Por 15 min.
PREPARACIÓN DE LUGOL PARA TETRATHIONATE
12
Yodo
6.0 gr.
Yoduro de Potasio 5.0 gr.
Mezclar
Añadir Agua Destilada 20 ml.
PREPARACIÓN DEL HIPURATO DE SODIO AL 1%
Hipurato de sodio
Agua destilada estéril
1 gr.
97 ml
Disolver y repartir en volúmenes de 400 microlitros en tubos de rosca estériles.
Congelar a -20 °C.
SOLUCIÓN DE FOSFATOS PARA MANTENER REMOJADOS LOS ELECTRODOS
Solución A
NaH 2 PO4
Agua destilada
2.78 gr.
100 ml.
Solución B
Na2HPO4 . 7H2O
Agua destilada
5.37 gr.
100 ml.
Mezclar
A : 30.0 ml
B: 61 0 ML
pH 7.0-7.2
SOLUCIÓN BUFFER DILUYENTE PARA BACTERIOLÓGICO DE ALIMENTOS
KH2PO4
Agua destilada
34 gr.
1000 ml.
Diluir 1.25 en un litro de agua destilada pH 7.2
Distribuir 9 ml en tubos con tapa de rosca.
SOLUCIONES PARA AJUSTAR PH DE MUESTRAS.
13
NaOH 1 M
4.0 gr. de NaOH en 100 ml de Agua Destilada
NaOH 3 M
12 gr. de NaOH en 100 ml de Agua Destilada
HCL
8.3 ml de HCl en 100 ml de Agua Destilada
1M
HCL 0.1M
0.83 ml de HCL en 100 ml de Agua Destilada
TABLA 1.1 Composición de estándar para turbidez Escala de McFarland.
____________________________________________________________________
Estándar de
Cloruro de Bario
Acido Sulfúrico Densidad
Turbidez Nodiluido 1.175%
(1%)
aprox. De bacterias
Por ml.
____________________________________________________________________
0.5
0.5 ml
99.5 ml
1x 108
1
0.1 ml
9.9 ml
3x 108
2
0.2 ml
9.8 ml
6x 108
3
0.3 ml
9.7 ml
9x 108
4
0.4 ml
9.6 ml
12x 108
5
0.5 ml
9.5 ml
15x 108
6
0.6 ml
9.4 ml
18x 108
7
0.7 ml
9.3 ml
21x 108
8
0.8 ml
9.2 ml
24x 108
9
0.9 ml
9.1 ml
27x 108
10
1.0 ml
9.0 ml
30x 108
_____________________________________________________________________
REFERENCIAS
14
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16